Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Ишемия головного мозга: модели и механизмы 12
1.1.1. Типы ишемии головного мозга 12
1.1.2. Механизмы повреждения нервной ткани при глобальной и фокальной ишемии головного мозга 14
1.1.3. Экспериментальные модели ишемии головного мозга 18
1.2. Креатин. Его свойства, функции и применение 25
1.2.1. Биосинтез и распределение креатина в организме 25
1.2.2.Функции креатина и креатинфосфата в организме 28
1.2.3. Исследования нейропротекторных свойств креатина в условиях ишемии/гипоксии головного мозга , 33
1.2.3.1. Теоретически предпосылки применения креатина при ишемии и гипоксии головного мозга 33
1.2.3.2. Исследования нейропротекторных свойств креатина in vitro... 33
1.2.3.3. Исследования нейропротекторных свойств креатина in vivo 35
1.3. Неврологические и когнитивные нарушения при глобальной ишемии и инсультах головного мозга 41
1.3.1. Необходимость использования животных моделей и поведенческих тестов 41
1.3.2. Неврологические тесты для оценки последствий глобальной и фокальной ишемии мозга 42
1.3.2.1. Неврологические расстройства у людей, перенесших инсульт или глобальную ишемию головного мозга 42
1.3.2.2. Оценка функциональных нарушений с использованием неврологических шкал в клинике у людей и в эксперименте у животных 42
1.3.2.3. Неврологические последствия глобальной ишемии мозга у животных 46
1.3.2.4. Неврологические последствия фокальной ишемии мозга у животных 49
1.3.3. Исследование когнитивных нарушений, вызванных глобальной
и фокальной ишемией мозга 56
1.3.3.1. Когнитивные нарушения, вызываемые ишемией и инсультом 56
1.3.3.2. Исследование обучения и памяти у животных в водном тесте Морриса 59
1.3.3.3. Влияние глобальной ишемии мозга на обучение животных в водном тесте Морриса 62
1.3.3.4. Влияние фокальной ишемии мозга на обучение животных в водном тесте Морриса 69
Глава 2. Методика 75
2.1. Животные 75
2.2. Хирургические процедуры 75
2.2.1. Маркировка животных 75
2.2.2. Индуцирование глобальной и фокальной ишемии головного мозга 77
2.2.2.1. Индуцирование глобальной ишемии головного мозга 77
2.2.2.2. Индуцирование фокальной ишемии головного мозга 79
2.2.3. Процедура введения исследуемых растворов 81
2.2.2.1. Имплантация интрацеребровентрикулярной канюли и интрацебровентрикулярная инфузия исследуемых растворов 81
2.2.2.2. Внутрибрюшинная инъекция производных креатина 83
2.2.3. Эвтаназия животных 84
2.3. Поведенческое тестирование 84
2.3.1. Выбор схемы поведенческого исследования 1 84
2.3.2. Исследование когнитивных нарушений в пространственной версии водного теста Морриса 86
2.3.3. Неврологическое тестирование 90
2.3.3.1. Оценка последствий глобальной ишемии головного мозга с использованием девятибалльной неврологической шкалы Комбса и Д'Алеси... 90
2.3.3.2. Оценка последствий фокальной ишемии с использованием специализированных неврологических шкал 92
2.3.4. Статистическая обработка и представление данных 95
Глава 3. Результаты и обсуждение 98
3.1. Влияние креатина на неврологические нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс 98
3.1.1. Базовый уровень неврологических способностей у крыс 98
3.1.2. Неврологические нарушения, вызываемые ГИМ у крыс 99
3.1.3. Влияние процедур и.ц.в. канюлирования и и.ц.в. инфузии per se на неврологический статус животных 101
3.1.4. Профилактическая эффективность креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ 106
3.1.4.1. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 50 мМ раствора креатина 106
3.1.4.2. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 100 мМ раствора креатина 108
3.1.4.3. Влияние глицерина на неврологический статус животных до и после ГИМ - контроль осмотических эффектов креатина 110
3.1.5. Терапевтическая эффективность креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ 113
3.2. Влияние креатина на когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс 115
3.2.1. Нарушения обучения в водном тесте Морриса, вызываемые ГИМ у крыс 115
3.2.2. Влияние длительной и.ц.в. инфузии исследуемых растворов perse на когнитивные функции у крыс 118
3.2.3. Профилактическая эффективность креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ 120
3.2.3.1. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 50 мМ раствора креатина на обучение крыс в водном тесте Морриса после ГИМ 120
3.2.3.2. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии 100 мМ раствора креатина на обучение крыс в водном тесте Морриса после ГИМ 122
3.2.3.3. Влияние предварительной и.ц.в. инфузии раствора глицерина на обучение крыс в водном тесте Морриса после ГИМ - контроль возможных осмотических эффектов креатина 124
3.2.4. Терапевтическая эффективность креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ 126
3.3. Влияние новых синтетических производных креатина на неврологические и когнтивные нарушения, вызванные глобальной ишемией мозга у крыс 129
3.3.1. Профилактическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ 129
3.3.2. Профилактическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ 131
3.3.3. Профилактическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ 132
3.3.4. Профилактическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ 135
3.3.5. Сравнение профилактической эффективности глицерилового и бензилового эфиров креатина в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ГИМ 137
3.4. Влияние производных креатина на неврологические нарушения, вызванные фокальной ишемией головного мозгау крыс 138
3.4.1. Неврологические нарушения, вызываемые хронической ФИМ... 138
3.4.2. Профилактическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической ФИМ 141
3.4.3. Терапевтическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической ФИМ 143
3.4.4. Профилактическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической ФИМ 145
3.4.5. Терапевтическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении неврологических нарушений, вызванных хронической ФИМ 147
3.5. Влияние производных креатина на когнитивные нарушения, вызванные хронической фокальной ишемией головного мозга у крыс 150
3.5.1.Когнитивные нарушения, вызываемые хронической ФИМ 150
3.5.2. Профилактическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных хронической ФИМ 153
3.5.3. Терапевтическая эффективность глицерилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных хронической ФИМ 154
3.5.4. Профилактическая эффективность бензилового эфира креатина в отношении когнитивных нарушений, вызванных хронической ФИМ 156
3.5.5. Терапевтическая эффективность бензилового эфира Кр в отношении когнитивных нарушений, вызванных ФИМ 158
Заключение 161
Выводы 168
Список литературы 170
- Ишемия головного мозга: модели и механизмы
- Необходимость использования животных моделей и поведенческих тестов
- Хирургические процедуры
- Влияние креатина на неврологические нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс
Введение к работе
В промышленно развитых странах ежегодная частота инсультов (фокальной ишемии головного мозга, ФИМ) достигает 400 случаев на 100 000 жителей, при этом смертность составляет 30% (Block, 1999). Глобальная ишемия головного мозга (ГИМ) представляет особую проблему в связи с широкой распространённостью атеросклероза сосудов головного мозга и является довольно частым осложнением при операциях на сердце (Johansson et al., 1995; Hindman, Todd, 1999; B6ttiger et al., 2001; Stamou, 2006).
Вызванные ГИМ и ФИМ разнообразные когнитивные, эмоциональные и функциональные нарушения ведут к инвалидизации людей и ложатся тяжелым социальным и экономическим бременем на общество. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, средняя стоимость прямых и непрямых расходов на одного больного с инсультом составляет 55 000-73 000 американских долл. в год, и общие затраты только США, связанные с проблемой инсульта, должны составлять от 16,5 до 22 млрд. долл. в год (Жулев и др., 2002). Несмотря на широкую распространённость данных заболеваний и многолетние многомиллиардные вложения в поисковые исследования, на сегодняшний день единственным одобренным регуляторными инстанциями многих стран методом лечения инсульта с подтвержденной эффективностью является внутривенное введение рекомбинантного активатора плазминогена (Brown, 2004). Средства эффективной нейропротекции, несмотря на огромное число исследований, так и не найдены (Broderick, Hacke, 2002а, 2002b; Danton, Dietrich 2004). Всё это определяет неослабевающий интерес к поиску новых подходов к профилактике и лечению данных острых нарушений мозгового кровообращения и является одной из актуальных проблем современной медицины (Гусев, Скворцова, 2001; Herczeg et al., 1996; Shaaban et al., 2000; Danton, Dietrich 2004). Установлено, что развитие необратимого поражения нервной ткани при ишемии связано с резким снижением уровня высокоэнергетических фосфатов (АТФ и креатинфосфата) в ишемизированных тканях и ограниченной возможностью их ресинтеза ввиду дефицита кислорода и глюкозы (Самойлов, 1985, 1999). Кроме того, происходящее при ишемии снижение рН дополнительно отягощает положение, ускоряя неферментативное необратимое превращение креатина в креатинин, что дополнительно ограничивает возможность ресинтеза креатинфосфата. В нервной ткани, как и других тканях организма с высокими энергетическими запросами (например, мышечной), в норме ресинтез АТФ из АДФ в клетке связан с дефосфорилированием креатинфосфата, и процесс этот может происходить при отсутствии кислорода и глюкозы. На основании этого была выдвинута рабочая гипотеза: введение креатина может способствовать увеличению синтеза и восполнению мозговых запасов креатинфосфата, тем самым снижая степень нейрональных повреждений при ишемии мозга.
Действительно, справедливость этой гипотезы подтверждена в опытах in vitro и in vivo. Непродолжительная инкубация переживающих срезов мозга с креатином увеличивает уровень креатинфосфата в ткани и существенно снижает степень аноксического и ишемического поражения нейронов (Carter et al., 1995; Balestrino et al., 2002, Balestrino, 2005). Рядом исследователей также была показана возможность увеличения уровня мозгового креатинфосфата при продолжительном приёме креатина с пищей или системном введении; отмечен нейропротекторный эффект данной добавки (Dechent et al., 1999; Adcock et al., 2002). Однако эти данные спорны, поскольку в норме проницаемость ГЭБ для креатина чрезвычайно мала (Perasso et al., 2003).
В нашей лаборатории впервые в опытах in vivo было установлено, что интрацеребровентрикулярное (и.ц.в.) введение креатина значительно уменьшает степень нейрональных повреждений в модели глобальной ишемии головного мозга у крыс (Polenov et al, 2005). Однако поскольку ГЭБ препятствует проникновению экзогенного креатина в мозг (Perasso et al., 2003), а и.ц.в. введение препарата непригодно для использования в клинике, в содружестве с химиками ИВС РАН были разработаны и синтезированы производные креатина, обладающие способностью проникать через ГЭБ. В опытах in vitro и, в дальнейшем, in vivo, в нашей лаборатории были получены приоритеные данные, свидетельствующие о высокой нейропротекторной эффективности одного из них - бензилового эфира креатина (Balestrino et al., 2004; Balestrino, 2005). Результаты этих исследований открывают перспективу разработки принципиально нового подхода к профилактике и лечению ишемического поражения мозга. Дальнейшая разработка этого направления невозможна без детального исследования влияния креатина и его новых аналогов на когнитивные функции и неврологический статус животных при ишемии головного мозга, чему и посвящена данная работа.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является определение эффективности креатина при интрацеребровентрикулярном (и.ц.в.) введении и новых синтетических производных креатина - глицерилового и бензилового эфиров креатина - при внутрибрюшинном введении (в/б) для профилактики и лечения неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной и хронической фокальной ишемией головного мозга (ГИМ и ФИМ) у крыс.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Выявить неврологические и когнитивные нарушения, возникающие при ГИМ и хронической ФИМ у крыс.
2. Исследовать эффекты и.ц.в. инфузии физиологического раствора и раствора креатина per se на неврологический статус и когнитивные функции крыс.
3. Оценить профилактическое и лечебное действие и.ц.в. введения креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные ГИМ у крыс. Установить роль осмолярности в эффектах креатина. 4. Оценить профилактическое действие глицерилового и бензилового эфиров креатина при их в/б введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные ГИМ и ФИМ у крыс.
5. Оценить лечебное действие глицерилового и бензилового эфиров креатина при их в/б введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные ФИМ у крыс.
Научная новизна
Впервые получены экспериментальные доказательства возможности защиты или улучшения функционального состояния (неврологического статуса) и когнитивных способностей у крыс после ГИМ и при хронической ФИМ за счёт и.ц.в. введения креатина, а также в/б введения новых синтетических производных креатина (его бензилового и глицерилового эфиров).
Впервые установлено, что профилактическое и.ц.в. введение 50 мМ (но не 100 мМ) раствора креатина, значительно снижает выраженность когнитивных нарушений и эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений у крыс после ГИМ; и показано, что данный благоприятный эффект 50 мМ Кр не связан с высокой осмолярностью его раствора.
Впервые установлено, что новое синтетическое производное креатина -глицериновый эфир креатина значительно (на 50% через 48 ч после ГИМ) снижает степень неврологических расстройств, вызванных ГИМ, при его предварительном (профилактическом) в/б его введении. При хронической ФИМ в/б введение глицерилового эфира креатина обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений.
Также впервые установлено, что новое синтетическое производное креатина - бензиновый эфир креатина высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных последствий хронической ФИМ у крыс при его в/б введении как в профилактической, так и терапевтической парадигмах.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость работы заключается в доказательстве того, что повышение мозгового уровня высокоэнергетических фосфатов с помощью и.ц.в. введения Кр способно ослаблять степень неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ишемией головного мозга. Практическая значимость связана с экспериментальным доказательством высокой эффективности новых синтетических производных Кр при их парентеральном введении в отношении ослабления неврологических и когнитивных нарушений в двух моделях ишемии головного мозга, что позволяет рекомендовать их для дальнейшей разработки в качестве перспективных противоишемических препаратов нового класса.
Представляемая работа является частью комплекса проводившихся ранее в рамках совместной Российско-Итальянской исследовательской программы и европейского гранта INTAS-2000-0441 исследований протективного и лечебного действия креатина в отношении последствий экспериментальной ишемии головного мозга у крыс и продолжающегося исследования «Разработка, синтез и доклиническое тестирование новых препаратов на основе креатина, способных проникать через гематоэнцефалический барьер и увеличивать мозговое содержание высокоэнергетических фосфатов с конечной целью реализации нового подхода к профилактике и лечению инсультов и ишемических поражений мозга» (грант РФФИ-Ориентированные фундаментальные исследования № 05-04-08072), которые в настоящее время ведутся в лаборатории физиологии пищеварения Института физиологии им. ИЛЛавлова РАН.
Ишемия головного мозга: модели и механизмы
Нейроны головного мозга характеризуются высоким уровнем энергетического метаболизма и, вероятно, поэтому энергетика головного мозга почти исключительно базируется на окислительном фосфорилировании, основным субстратом которого считается глюкоза. Головной мозг человека потребляет 20% поступающего в организм кислорода и до 20% свободной глюкозы (Самойлов, 1985); относительно высокого уровня потребления собственные мозговые запасы глюкозы весьма ограничены. В связи с этим очевидна опасность ишемии головного мозга - вызванной снижением мозгового кровотока ограничения поступления в нервную ткань кислорода (циркуляторная гипоксия) и глюкозы. Инсульты подразделяются на ишемические и геморрагические, которые происходят в пропорции 80-85% к 15-20% (Гусев, Скворцова, 2001).
Понимание механизмов действия церебральной ишемии постепенно развивалось на протяжении последних десятилетий XX в. До 60-х годов доминировало представление, что при остром нарушении мозгового кровообращения ишемическое повреждение возникает сразу и необратимо, формируя зону погибшей ткани - инфаркт (Гусев, Скворцова, 2001). В результате исследований конца 70-х - начала 80-х гг. начали постепенно раскрываться механизмы последовательного изменения функционального состояния и морфологии ткани мозга после или на фоне ишемии, что позволило сформулировать понятие о церебральной ишемии как о динамическом процессе и установить, что индуцированные нарушения являются потенциально обратимыми (Самойлов, 1985).
В зависимости от того, в целом ли головной мозг или только относительно небольшой его участок испытывают последствия ограничения кровоснабжения, ишемия головного мозга подразделяется на глобальную (ГИМ) и фокальную/локальную (ФИМ).
ГИМ возникает вследствие временной остановки сердца, грубых нарушений сердечного ритма, выраженной системной артериальной гипотензии. Особый тип ГИМ связан с хронической гипоперфузией мозга, вызванной атеросклерозом сосудов, обеспечивающих кровоснабжение мозга -явлением, характерным для ряда патологических процессов и чрезвычайно часто сопровождающее старение. Наблюдаемое при этом длительное ограничение кровоснабжения мозга из-за развивающейся патологии капилляров приводит к нарушению транспорта глюкозы и аминокислот в мозг (Mooradian et al., 1991) и снижению васкуляризации ткани мозга (Farkas, Luiten, 2001; de Wilde, 2002), что губительно сказывается на деятельности всех мозговых структур. Поскольку при уменьшении просвета сосуда риск закупорки его тромбом или эмболом значительно возрастает, создаются предпосылки возникновения фокального ишемического или геморрагического инсульта.
ФИМ возникает при локальном снижении кровообращения в отдельном сосудистом бассейне только одной половины мозга. Выделяют два основных типа ФИМ (Жулев и др., 2002):
1.) ишемический нетромботический инсульт (гемо динамический) возникающий в результате длительного ангиоспазма мозговых сосудов при нарушении центральных механизмов регуляции и / или местной саморегуляции сосудистого тонуса (срыв механизмов возможен в случае гипертонической болезни);
2.) ишемический тромботический и эмболический инсульты, вызываемые тромбозом или закупоркой эмболом крупных сосудов мозга. Последний вариант является преобладающим: от общего числа ишемических инсультов 50% связано с тромботическим или эмболическим осложнением атеросклеротического процесса в артериях мозга, и примерно 20% - с кардиогенной эмболией (Гусев, Скворцова, 2001).
Необходимость использования животных моделей и поведенческих тестов
Долгое время в экспериментальной практике основным критерием эффективности нейропротекции служили данные морфологического исследования, а именно снижение объема очага поражения (при фокальной ишемии) или уменьшение количества погибших нейронов (при глобальной ишемии). В то же время в медицинской практике основным критерием степени тяжести инсульта или ишемии являются клинические проявления -неврологические расстройства, нарушения речи, памяти и т.д. (Ginsberg, Busto, 1989). Такой дисбаланс (недостаточное внимание к неврологическим и поведенческим критериям в эксперименте) привел к тому, что большое число очень перспективных по данным экспериментальных исследований веществ оказались неэффективными при их клинических испытаниях (Hunter et al., 1998). В связи с этим в последнее время ведущие специалисты по разработке нейропротекторных средств настоятельно рекомендуют использовать в доклинических исследованиях как можно более полную оценку неврологических и поведенческих показателей, что позволяет проводить экстраполяцию данных эксперимента на животных в клинику (Stroke therapy academic industry roundtable, 1999). При этом именно крысы являются наиболее подходящим объектом для такого изучения в силу целого ряда факторов -высокой способности к обучению, пластичности нервной системы, наличие накопленных за многие десятилетия разнообразных приемов изучения их поведения (Ginsberg, Busto, 1989; Traystman, 2003).
Двигательные расстройства являются наиболее частыми последствиями инсультов у человека; обычно это односторонние гемипарезы. По данным Регистра инсульта НИИ неврологии РАМН, к концу острого постинсультного периода параличи и парезы наблюдались у 81% выживших больных; спустя год после инсульта они отмечаются у 49% больных (Жулев и др., 2002). Гемипарезы сочетаются с нарушениями соматической чувствительности: расстройство мышечно-суставного чувства отмечаются почти у трети больных. Отдельную проблему представляют изменения тонуса мышц паретичных конечностей: повышение - спастичность, реже гипотония (чаще мышц ног). В ряде случаев отмечаются т.н. афферентные парезы - нарушения при выполнении целенаправленных действий на фоне сохранения полного объема движений и силы. Особую проблему представляет анозогнозия - отсутствие осознания или игнорирование субъектом поражения, наблюдающееся у 20-30% больных с гемиплегией (Vuilleumier, 2004). Нарушения равновесия, координации и статики затрудняют восстановление функции ходьбы и навыков самообслуживания. Восстановление относительно простых движений интенсивно происходит в основном в первые полгода после инсульта. Этот период является лучшим для проведения реабилитационных мероприятий. Восстановление сложных бытовых и трудовых навыков затягивается на ещё большие сроки.
Клиническое неврологическое исследование основывается на высокой регулярности и воспроизводимости безусловных реакций (прежде всего моторных). Их наличие или отсутствие дает важную информацию о состоянии структур ЦНС и локализации очага поражения. Считается, что даже относительно простые неврологические тесты могут дать сведения о функциональном состоянии всех уровней ЦНС. Иерархия таких уровней включает спинной мозг (рефлекс сгибания); продолговатый мозг (реакции вздрагивания, роговичный рефлекс, качание головой); варолиев мост и средний мозг (рефлексы переворачивания и равновесия, зрачковые реакции); кору головного мозга (реакция постановки лапы на опору, хватание, тесты на равновесие) (Буреш и др., 1991).
С целью увеличения полноты и надёжности оценки функционального состояния больных, перенесших инсульт или ишемию, широко используются многотестовые комплексные неврологические шкалы. Наряду с группой тестов, всесторонне характеризующих собственно функциональные нарушения, они включают также и оценку уровня сознания, речевых (афазия, дизартрия) и базовых ментальных способностей (осознаёт ли факт пребывания в больнице и т.п.). Из зарубежных наиболее распространёнными комплексными шкалами являются: 100-балльная Скандинавская (Scandinavian Stroke Study Group, 1985), 60-балльная Оргогозо (Orgogozo, Capildeo, 1983) (тяжелому инсульту соответствуют оценка менее 30 и 40 баллов, соответственно), Канадская (Cote et al, 1986,1989) и шкала инсульта Национального института здоровья (NIHSS) (Brott et al., 1989). Основу последней шкалы составляют оценки расстройства сознания, нарушений зрительных функций, двигательных и координаторных нарушений, соматической чувствительности, аутотопоанозогнозии (неглекта) и речевых нарушений (дизартрии, афазии), всего по 15-ти пунктам. Выраженность каждого из симптомов инсульта соответствует градациям от 0 до 4 баллов, общее количество баллов - от 0 до 60, при этом удовлетворительному клиническому состоянию соответствует минимальное количество баллов, а тяжелому - максимальное.
Хирургические процедуры
В качестве модели ГИМ использовалась модель Смита с соавт. (Smith et al., 1984а, 1984b) с окклюзией двух сонных артерий и контролируемой гшютензией среднего артериального давления (АД) до 50 мм рт. ст. (02С+гипот. 50 мм). После наркотизации пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, в/б), животное располагалось на подогреваемом операционном столике. С помощью микроинтубатора с осветителем под визуальным контролем производилась интубация трахеи атравматической трубкой для обеспечения свободного спонтанного дыхания. Обе бедренные артерии катетеризировалась заполненными гепаринизированным физраствором фторопластовыми катетерами, соединёнными с трехходовыми кранами для измерения АД и забора крови. Бедренная вена катетеризировалась полиэтиленовым катетером для введения полиионного раствора (для поддержания водно-электролитного баланса), реинфузии крови и, при необходимости, введения дополнительной дозы анестетика. После срединного разреза кожи на передней поверхности шеи и тупого расслаивания шейных мышц обе общие сонные артерии (СА) тщательно отделялись от окружающих тканей и сопутствующих нервов и помещались на лигатуры.
По окончании препаровки животное располагали на термостабилизируемом столике экспериментальной установки. Ректально вводился датчик электротермометра. Посредством регулирования степени нагрева столика и дополнительной обогревающей лампы, ректальная температура в ходе всего воздействия поддерживалась на уровне 37,5-38,0С. С помощью игольчатых электродов регистрировалась ЭКГ в первом грудном отведении. Один артериальный катетер через жесткие трубки соединялся с датчиком давления (ПДП-300К, ВНИИМП, Москва), подключенным к стандартному усилителю. Второй артериальный катетер через трехходовой кран соединялся с двумя шприцами объемом 10 и 1 мл, заполненными на 1/20 объема гепаринизированным физраствором. Регистрируемые параметры артериального давления и ЭКГ вводились в персональный компьютер через АЦП (PC LPM-16, National Instruments, США) под управлением пакета программ ввода и обработки данных Lab View 7.0 (National Instruments, США) и записывались в файл на жёсткий диск компьютера; программно рассчитанные АД и ЧСС (усреднение за 1 с) в реальном масштабе времени представлялись в графической и цифровой форме на мониторе. После 10-15 минутного периода стабилизации АД, производился забор крови в 10 мл шприц для снижения АД до 45-55 мм рт. ст. Затем микрохирургическими клипсами пережимались обе общие С А. После этого в течение 12 минут путем забора и реинфузии крови во второй, маленький шприц, значения АД строго поддерживались на уровне 44-46 мм рт. ст. По окончании 12 минут клипсы с обеих С А снимались, визуально контролировалось восстановление кровотока по ним, и сразу после этого производилась плавная реинфузия всего объема забранной крови. После возвращения значений АД к исходному (или близкому к нему) уровню и его стабилизации, все датчики отключались, животное переносилось обратно на обогреваемый операционный столик, катетеры удалялись, операционные раны послойно ушивались. Внутримышечно вводился раствор антибиотиков; до выхода из наркоза животное помещалось на электрогрелку. При появлении попыток двигаться производилась экстубация и животные переносились в виварий в стандартную клетку (Т4) для последующего содержания.
Морфологическое исследование использованных в данных экспериментах крыс, проведённое нашими коллегами (ИЭМ РАМН), показало, что данная модель ГИМ вызывала значительные нейроморфологические нарушения, локализованные в гиппокампе (секторы СА1, СА2, САЗ), зубчатой извилине, п. caudatus/putamen и неокортексе (Отеллин и др. 2002, 2003); выявленные нарушения хорошо согласуются с приводимыми в литературе (Smith et al., 1984а, 1984b; Warner et al., 1990).
Процедура имитации ГИМ (ложная операция) была аналогична вышеизложенной, за исключением того, что пережатия СА и обратимого изъятия крови не производилось. Соответствующий морфологический контроль показал отсутствие выраженных нейродегенераторных изменений у крыс данной группы (Отеллин и др. 2002,2003).
Влияние креатина на неврологические нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс
Поскольку выбранная схема неврологической оценки включает несколько повторных тестирований, необходимо было выяснить, насколько результаты однократного тестирования соответствует истинному исходному уровню неврологических способностей (baseline) и насколько стабильны полученные данные по неврологическому статусу крыс, т.е. не будут ли они меняться в ходе последующих тестирований (эффект тренировки и т.п.). Для этой цели в ходе предварительного эксперимента по принятой схеме (рис. 5А) в тестах шкалы Комбса-ДАлеси было протестировано девять интактных крыс (рис. 7, тестирования № 2 и 3). В трех последовательных тестированиях (второе - через 3 дня (72 ч) и третье - через 9 дней после первого теста) были получены следующие оценки неврологического статуса: 8,56±0,26 балла; 8,56±0,26 и 8,44±0,40 балла. Небольшое отклонение от максимально возможного в тесте балла - 9 - объясняется тем, что отдельные животные не всегда успешно действовали в каком-либо из тестов. Статистическое сравнение (критерий Вилкоксона парных сравнений) не выявило никаких значимых отличий между неврологическим статусом у данных интактных крыс в разные дни тестирования. Это хорошо согласуется с литературными данными (к примеру, Ulrich et al., 2003). Можно предположить, что в последующих исследованиях отклонения неврологического статуса от исходного уровня, выявленные при повторных тестированиях, будут отражать влияние именно экспериментальных воздействий, а не эффект тренировки.
У ряда групп (с ГИМ, но без и.ц.в. канюлирования, с в/б инъекциями и т.д.) первое неврологическое тестирование проводилось до каких-либо хирургических процедур. Поскольку в это тестирование все животные данных групп (включая интактный контроль) демонстрировали практически одинаковый уровень неврологических способностей, и статистическая проверка показала отсутствие статистически значимых отличий между ними, они были объединены в одну группу - «интакные на первый тест» (п=93) со средним баллом 8,56±0,10. Неврологические данные по этой объединённой группе использовалась в ряде последующих сравнений.
В первую очередь необходимо было установить, вызывает ли используемая в нашем исследовании модификация модели ГИМ (12 мин окклюзия 2СА+гипотензия до 45 мм рт. ст. АД) неврологические нарушения у крыс. С этой целью мы сравнили данные, полученные при тестировании крыс в соответствии с неврологической шкалой Комбса-Д Алеси за день (24 ч) до и через 2 дня (48 ч) и 7 дней после ГИМ (п ІЗ) с неврологическим статусом крыс интактного контроля, тестированных в том же временном режиме (п=93 -«интакные на первый тест» на тест 1 и п=9 на 2 и 3 тестирования, п. З.1.1.). Результаты представлены на рис. 7.
За день до ишемии крысы группы ГИМ (п=13) вполне предсказуемо не отличались по неврологическим способностям от прочих крыс объединённой группы интактного контроля (п=80), поскольку также были интактными. ГИМ вызывала значительные неврологические нарушения: через два дня после неё у крыс данной группы наблюдалось резкое (на 80%) снижение неврологического статуса относительно их базового (до ишемии) уровня (с 8,88±0,08 до 1,76±0,47 баллов, р 0,01; критерий Вилкоксона). Соответственно, в это тестирование неврологический статус крыс с ГИМ был значительно (на 80%) ниже, чем у интактного контроля (межгрупповые отличия статистически значимы, р 0,001; U-тест) (Рис. 7).
Через семь дней после ишемии у крыс наблюдалось статистически значимое улучшение неврологического статуса: по сравнению со вторым днём после ишемии балл увеличился (до 7,36±0,52, р 0,01; критерий Вилкоксона). Крысы демонстрировали уровень неврологических способностей, сопоставимый с собственным базовым (отличия статистически не значимы, р 0,10; критерий Вилкоксона) или уровнем интактных крыс (межгрупповые отличия статистически не значимы, р 0,15; U-тест). Это позволяет говорить о практически полном восстановлении неврологических способностей крыс через 7 дней после ГИМ.
Таким образом, набор неврологических тестов Комбса-Д Алеси успешно выявляет неврологические нарушения у крыс, вызванные использованной нами моделью ГИМ. Динамика неврологических способностей, наблюдавшаяся у крыс после ГИМ: значительные нарушения через 48 ч и практически полное восстановление до исходного уровня через 7 дней, хорошо согласуется с вышеприведёнными литературными данными (п. 1.3.2.4.) для модификаций модели ГИМ с окклюзией двух СА и гипотензией АД (Combs, D Alecy, 1987; Warner et al., 1990; Gionet et al., 1991; Mackensen et al., 2001a.).
