Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Фундаментальные и клинические аспекты хронической сердечной недостаточности 16
1.2. Современные представления об апоптозе 25
1.3. Морфофункциональная характеристика компенсаторных и приспособительных возможностей мышечных и немышечных элементов миокарда 36
1.4. Роль и значение нейроэндокринной регуляции в обеспечении клеточного и тканевого гомеостаза миокарда 41
1.5. Современные подходы к коррекции нарушений тканевого и клеточного гомеостаза миокарда при хронической сердечной недостаточности 49
Глава 2. Материал и методы исследования 54
2.1. Исследование прижизненных биоптатов миокарда больных с хронической сердечной недостаточностью 54
2.2. Моделирование экспериментальной сердечной недостаточности 58
2.3. Культивирование миокарда in vitro 58
2.4. Методы исследования 59
Глава 3. Светооптическая и ультраструктурная характеристика мышечных и немышечных элементов миокарда у больных с различными стадиями хронической сердечной недостаточности 65
Глава 4. Ультраструктурная характеристика миокарда у больных с хронической сердечной недостаточностью в условиях интраоперационной кардиоплегии 101
Глава 5. Роль апоптоза клеток миокарда в развитии хронической сердечной недостаточности 110
Глава 6. Ультраструктурные изменения клеток миокарда и гипо таламо-гипофизарной нейросекреторной системы крыс в условиях экспериментальной сердечной недостаточности 125
Глава 7. Ультраструктурная реорганизация реактивно измененного миокарда в условиях культивирования in vitro 150
Глава 8. Обсуждение полученных результатов 183
Выводы 222
Практические рекомендации 225
Список литературы 227
- Роль и значение нейроэндокринной регуляции в обеспечении клеточного и тканевого гомеостаза миокарда
- Светооптическая и ультраструктурная характеристика мышечных и немышечных элементов миокарда у больных с различными стадиями хронической сердечной недостаточности
- Роль апоптоза клеток миокарда в развитии хронической сердечной недостаточности
- Ультраструктурная реорганизация реактивно измененного миокарда в условиях культивирования in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы.. Хроническая сердечная
недостаточность (ХСН) рассматривается не только как патологическое состояние, вызванное структурно-функциональными расстройствами сердечной мышцы и нарушением адаптивной деятельности регуляторных неирогуморальных систем, но и как процесс ремоделирования миокарда. [Brilla et al, 1994; Cohn,. 1995(a); Olivetti et al, 1995, Белов, Вараксин, 2002]. Эти,процессы, при ХСН. могут сопровождаться некрозом, гипертрофией, определенными изменениями ультраструктуры кардиоми-оцитов (КМЦ), соотношения мышечных и стромальных клеток миокарда [Booz, Baker, 1995; Janicki et al, 1995; Vasan et al., 1997], а также сосудов микроциркуляции [Jaffe et al.,1997].
Анализ работ по структурно-функциональной реорганизации миокарда при ХСН показывает, что клинико-морфологические исследования в настоящее время в основном идут в направлении изучения патологических изменений в тканях сердца. Исследований же, рассматривающих взаимоотношения клеток в сердце с точки зрения реализации ими своих компенсаторно-приспособительных возможностей («материальных ресурсов», по Саркисову [1977]), а также морфологические изменения в миокарде при ХСН с позиций расстройств тканевого гомеостаза, нет, в том числе в аспекте программированной клеточной гибели (ПКГ) и закономерностей репаративной регенерации структур миокарда. Все это делает особо актуальным дальнейшее изучение диапазона структурно-функциональной реорганизации кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток, явлений апоптоза- в сердце, то есть тех процессов, которые, наряду с пролиферацией и некробиозом, представляют собой основополагающий биологический механизм, определяющий клеточный гомеостаз. Особенно следует подчеркнуть то, что роль апоптоза в процессах перемоделирования сердца и прогрессировании ХСН до конца не определена. Это объясняется, прежде всего, трудностью его идентификации, а также быстротечностью фенотипических проявлений [Arends et al, 1991; Alison et al., 1992; Bursh. et al, 1992]. В немногочисленных работах при изучении миокарда околоинфарктной зоны левого желудочка в экспериментальных условиях показано увеличение апоптоза КМЦ, приводящее к прогрессивному расширению рубца и, в конечном счете, к желудочковой дисфункции [Sharov et al, 1997; Ino et al., 1997]. Anversa et al. [1997] предполагают, что различные нарушения ПКГ могут являться одним из механизмов перехода от устойчивой компенсации к развитию ХСН. В единичных исследованиях
рос национальная) библиотека 1
аПет«р*рг (//'(И 09 W>y«rr/CVl
указывается также на возрастание апоптоза в сердце у больных с терминальными стадиями ХСН [Olivetti et al, 1997]. С другой стороны, сведения, касающиеся распространенности апоптоза в клетках миокарда при некритических стадиях ХСН, весьма немногочисленны и противоречивы [Olivetti et al, 1997; Sabbah, Sharov, 1998], что не позволяет до сих пор судить о его значении у пациентов с умеренной ХСН.
В основе вышеуказанных структурных изменений в миокарде (некроз, гипертрофия, апоптоз мышечных и немышечных клеток сердца) при ХСН, очевидно, лежит комплекс молекулярных и гистогенетических процессов (реэкспрессия фетальных и неонатальных белков, протоонкоге-нов c-fos, c-myc, вс12, вах и др., изменение структуры клеточных мембран, плотности и строения {5- рецепторов), активизация нейроэндокринных и ауто/паракринных механизмов регуляции тканевого гомеостазиса [Katz А., 1990; Milano et al, 1994; Kurrelmeyer et al., 1998]. Однако молекулярный и генетический фон нарушений структурного тканевого гомеостаза, реализуемый в ходе репаративного кардиомиогенеза при ХСН, требует дальнейших более углубленных исследований.
Все это позволяет расценивать проблему апоптоза и структурно-функциональной реорганизации миокарда при ХСН как недостаточно изученную и требующую дальнейших детальных исследований.
Цель исследования - на основе экспериментально-гистологических и клинических исследований установить особенности и закономерности структурно-функциональных изменений миокарда при ХСН, значение гипоталамических нонапептидов и некоторых кардиотропных лекарственных препаратов в развитии ремоделирования сердца с позиций оценки реализации адаптивных и генетически детерминированных тканевых процессов, в том числе и апоптоза.
Задачи исследования:
1. Изучить особенности структурно-функциональных изменений в
интраоперационном миокарде в зависимости от стадии ХСН.
2. Идентифицировать в миокарде больных с различными стадиями ХСН
клетки с признаками апоптоза, установить особенности его проявлений в
сердце.
3. Проанализировать гистологические корреляции между степенью
выраженности апоптоза клеток миокарда, структурной реорганизацией
КМЦ, интерстиция, сосудов микроциркуляции и соответствующей стадией ХСН.
Определить особенности структурно-функциональной реорганизации миокарда при ХСН в условиях интраоперационной кардиоплегии.
Установить морфофункциональные параллели между структурно-функциональными изменениями в миокарде и гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе (ГГНС) у крыс в условиях экспериментальной сердечной недостаточности.
Исследовать репаративные и цитофизиологические возможности клеточных элементов интраоперационного биопсийного миокарда, полученного от больных с различными стадиями ХСН, в том числе при культивировании in vitro.
Изучить прямое влияние гипоталамических нонапептидов (окситоцина и вазопрессина) и моноаминов, а также некоторых лекарственных средств (ингибиторов АПФ, блокаторов AT II рецепторов) на структурно-функциональные изменения в миокарде в условиях культивирования in vitro.
Научная новизна результатов исследования. Впервые
проведено комплексное морфофункциональное исследование структурных изменений в миокарде больных с различными стадиями ХСН с позиций оценки адаптивных возможностей его клеточных элементов. Определены типовые компенсаторные и приспособительные реакции сердечной мышечной ткани при ХСН.
Получены новые данные по идентификации КМЦ и немышечных клеток миокарда с признаками апоптоза, отражающие состояние его тканевого гомеостаза. Установлены ультраструктурные особенности проявления апоптоза клеток в сердечной мышце. Определены морфологические критерии тяжести ХСН и прогнозирования ее развития. Впервые показана прямая взаимосвязь между основными гемодинамическими показателями, характеризующими систолическую и диастолическую функцию сердца, и числом клеток миокарда, подвергшихся ПКГ.
Получены новые данные, касающиеся рекомбинационных преобразований мышечных и немышечных клеток сердца в условиях кардиоплегии, установлена их зависимость от исходного состояния сердечной мышечной ткани. У больных с тяжелой ХСН выявлены неблагоприятные в прогностическом отношении ультраструктурные изменения.
Показана однонаправленность структурно-функциональных
изменений клеток миокарда больных с ХСН и крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью (ЭСН).
Впервые установлены параллели между структурно-
функциональными изменениями в миокарде и ГГНС у крыс в условиях
ЭСН. Определено негативное значение разбалансировки
функционирования ГТНС в реализации клетками миокарда своих адаптивных потенций.
Впервые показано адаптогенное влияние окситоцина и вазопрессина на клеточные элементы реактивно измененного миокарда (особенно на ультраструктуры энергетического и сократительного аппарата) при культивировании in vitro. С помощью метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) получены новые данные о прямом воздействии гипоталамических нонапептидов на плазмолемму КМЦ.
Установлены морфологические критерии позитивного влияния блокаторов AT II рецепторов на КМЦ и немышечные клетки сердца при их культивировании in vitro.
Практическое значение работы. Определение закономерностей структурной реорганизации миокарда при ХСН и обоснование роли апоптоза КМЦ и немышечных клеток позволило разработать новую концепцию ее возникновения и прогрессирования, основанную на исследовании механизмов развития ремоделирования сердца.
Выявленный характер структурно-функциональных изменений в миокарде при ХСН, в том числе и апоптоз его клеток, имеет существенное прогностическое значение для оценки компенсаторных и приспособительных возможностей сердца в условиях гемодинамических и нейрогуморальных сдвигов.
Гисто- и цитологическая идентификация механизмов развития и прогрессирования ХСН создает предпосылки для поиска современных медикаментозных путей воздействия на них, наметив, таким образом, новое направление в лечении ХСН.
Результаты морфологического исследования биоптатов миокарда могут быть использованы в качестве диагностических критериев прогнозирования развития и исходов ХСН у больных, что обеспечит эффективную реализацию лечебно-профилактических мероприятий с учетом состояния структурного тканевого гомеостаза сердца.
Проведенное исследование открывает новые перспективы использования экспериментальных моделей на животных для изучения различных звеньев патогенеза сердечной недостаточности, а также способов ее фармакологической коррекции.
Полученные данные по адаптогенному влиянию
гипоталамических нонапептидов на миокард способствуют пониманию важности регуляторных факторов в поддержании клеточного гомеостаза и дальнейшему исследованию их механизмов, что явится доказательной методологической основой для разработки эффективных способов лечения заболеваний сердца.
Проведенное исследование по изучению прямого позитивного воздействия блокаторов AT II рецепторов на клеточные . элементы миокарда будет способствовать обоснованию их применения для лечения больных с ХСН.
Полученные результаты по изучению клеточных элементов миокарда с применением АСМ открывают новые перспективы использования данного метода в биологических и клинических исследованиях.
Внедрение.
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс и практику НИР на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедре патологической анатомии, кафедре госпитальной терапии с курсом клинической фармакологии, кафедре факультетской терапии, кафедре пропедевтики внутренних болезней, кафедре ФППС Оренбургской государственной медицинской академии, в проблемной лаборатории «Нейроэндокринная регуляция гомеостазиса про - и эукариот» Оренбургского филиала ЮУНЦ РАМН. По материалам диссертации подготовлены методические рекомендации "Оценка функционального состояния левого желудочка с учетом изменения его структурно-геометрических показателей у пациентов с хронической сердечной недостаточностью", предназначенные для кардиологов, врачей функциональной диагностики, клинических ординаторов, аспирантов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. ХСН сопровождается ремоделированием миокарда, являющегося следствием нарушений структурного тканевого гомеостаза, в основе которого лежит комплекс структурно-функциональных изменений клеточных элементов миокарда, происходящих на тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярно-генетическом уровнях.
2. Прогрессирование ХСН связано с лимитированием и срывом компенсаторных и приспособительных реакций миокарда, а также необратимостью структурных изменений в нем, наблюдающихся у больных с ХСН ИБ ст. Использование интраоперационной кардиоплегии у больных с выраженной ХСН способствует усугублению неблагоприятных ультраструктурных изменений клеточных элементов миокарда.
3. В миокарде больных с различными стадиями ХСН
идентифицируются КМЦ и немышечные клетки с признаками апоптоза,
который является одним из важных звеньев развития ремоделирования
сердца, показателя состояния тканевого и клеточного гомеостаза
сердечной мышечной ткани. Наблюдается прямая взаимосвязь между
состоянием гемодинамики у больных с ХСН и апоптозом клеток
миокарда.
Разбалансировка функционирования ГГНС при сердечной недостаточности ограничивает реализацию адаптогенного влияния гипота-ламических нонапептидов на сердечную мышечную ткань.
Гипоталамические нонапептиды (окситоцин и вазопрессин), блокаторы AT II рецепторов при культивировании in vitro оказывают позитивное влияние на реактивно измененный миокард. Терапия больных с ХСН должна быть направлена не столько на полную блокаду различных нейрогормональных систем, сколько на восстановление их нормального баланса. При этом необходимо учитывать не только негативное, но и адаптационное действие нейрогормонов, реализуемое как на системном, так и на тканевом уровнях.
Апробация работы и публикации результатов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции "Актуальные проблемы кардиологии"(Тюмень, 1999), на IV съезде Российских морфологов с международным участием (Ижевск, 1999), на V и VI Конгрессах Международной Ассоциации морфологов (Ульяновск, 2000; Уфа, 2002), на VI Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2000), на VI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999), на Российском национальном конгрессе кардиологов "От исследований к клинической практике" (Санкт-Петербург, 2002), на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, II Всероссийском симпозиуме "Колебательные процессы гемодинамики. Инжиниринг в медицине"(Челябинск, 2002), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2000, 2001), на конференции, посвященной 70-летию проф. А.И. Рыжова "Актуальные вопросы экспериментальной морфологии "(Томск, 1999), на ежегодной Всероссийской конференции Общества специалистов по сердечной недостаточности " От артериальной гипертонии к сердечной недостаточности" (Москва, 2001), "Сердечная недостаточность, 2002" (Москва, 2002), на международной конференции "Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза человека в норме и при воздействии антропогенных факторов, экология и
здоровье населения, актуальные проблемы биологии и
медицины"(Астрахань, 2000), на национальной конференции
Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей" (Санкт-
Петербург, 2001), на V Всероссийской конференции, посвященной 75-
летию АЛ. Поленова "Нейроэндокринология 2000" (Санкт-Петербург,
2000), на Всероссийской конференции с международным участием "
Нейроэндокринология 2003" (Санкт-Петербург, 2003), на III научно-
практической конференции врачей Приволжско-Уральского военного
округа "Актуальные вопросы военной и практической медицины"
(Оренбург, 2002), на Всероссийской конференции, посвященной памяти
члена-корреспондента АМН СССР Ф.М. Лазаренко, «Реактивность и
пластичность гистологических структур в нормальных,
экспериментальных и патологических условиях» (Оренбург, 2003), на Ежегодной конференции Общества специалистов по сердечной недостаточности «Спорные и нерешенные вопросы сердечной недостаточности» (Москва, 2003).
Диссертация в целом апробирована на совместном заседании проблемных комиссий по морфологии и кардиологии Оренбургской государственной медицинской академии, кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, госпитальной терапии с курсом клинической фармакологии в 2003 году. По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 5 глав результатов исследования, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, представлена в одном томе объемом 269 страниц.
Работа иллюстрирована 11 таблицами и 79 рисунками, которые включают микрофотографии, электронные микрофотографии, гистограммы, схемы. Список литературы содержит 452 источника, в том числе 325 иностранных. Диссертация изложена на русском языке.
Роль и значение нейроэндокринной регуляции в обеспечении клеточного и тканевого гомеостаза миокарда
В последние годы большое внимание уделяется поиску различных, и в первую очередь, нейроэндокринных факторов, участвующих в регуляции тканевого гомеостаза, а также процессов репаративных гистогенезов [Zachary et al., 1987; Стадников, 1989, 1999, 2001]. Однако работ, изучающих влияние нейроэндокринных факторов на диапазон гисто- и органотипических свойств миокарда, недостаточно [Hamaoka, Sawada, 1987], особенно в плане исследования их прямого воздействия на клеточные элементы сердечной мышечной ткани как в нормальных условиях, так и при патологии, в том числе и при ХСН.
Имеются данные о влиянии на миокард AT II, эндотелина, трансформирующего фактора роста (З(ТФР-Р), инсулиноподобного фактора (ИПФ), а-ФНО. Показано, что AT II, эндотелии, фактор роста фибробластов, ТФР-Р, модулируя выраженность нескольких протоонкогенов (c-fos, c-myc) в клетках миокарда, способствуют их гипертрофии [Puri et al., 1994].
В настоящее время большой интерес вызывают работы, изучающие семейство эндотелиновых пептидов, оказывающих биологические эффекты на сосудистые и несосудистые клетки сердца. Luscher et Wenzel [1995] обнаружили, что эндотелий сосудов сердца продуцирует исключительно эндотелии-1 (ЭТ-1). При этом его главными сосудистыми эффектами являются скоротечная вазодилатация и длительная вазоконстрикция. Авторы также отмечают, что ЭТ-Г способствует пролиферации сосудистых гладкомышечных клеток. Имеются сведения о том, что ЭТ-1 может быть одним из факторов, обеспечивающих гипертрофический рост КМЦ [Shubeita et al., 1990; Ito et al., 1992]. ЭТ-1, оказывая прямое воздействие на миокард, вызывает в нем позитивные инотропный и хронотропный эффекты [Golfman et al., 1993]. Damron et al. [1993] подтвердили, что ЭТ способен инициировать инотропный эффект в КМЦ желудочков взрослых крыс через стимуляцию протеинкиназы С и активизацию ингибиторов К4" каналов, что приводит к пролонгированному поддержанию потенциала действия в сердечных миоцитах и способствует притоку в клетки ионов Са2+ через сарколемму. Golfman et al., [1993] установили, что при взаимодействии ЭТ с поверхностными рецепторами КМЦ и гладкомьпыечных клеток происходит активизация G-белка, фосфолипазы С и последующее ускорение гидролиза фосфоинозитидов на инозитолтрифосфат и диацилглицерол, являющихся внутриклеточными мессенджерами, способствующими увеличению концентрации ионов Са2+. Показано, что ЭТ-1 индуцирует в КМЦ секрецию предсердного натрийуретического фактора [Irons et al.,1993] и активизирует каскад "mitogen-aktivated protein kinase (МАРК), вызывающих гипертрофический рост клеток [Bogoyevich et al., 1993, 1994]. На выработку ЭТ, наряду с гипоксией, оказывают влияние такие факторы, как: AT II, аргинин вазопрессин, ТФР-0, ИЛ 1, а-ФНО, тромбин, активированные тромбоциты [ Luscher, 1994; Luscher, Wenzel, 1995].
В настоящее время в литературе активно обсуждается роль ЭТ-1 в развитии и прогрессировании ХСН. Предполагают, что он может стимулировать гипертрофию левого желудочка, вызывать ремоделирование сердца, нарушать процессы образования коллагена в нем [Katz, 1998; Мареев, 2001]. Кроме того, ЭТ-1 усиливает секрецию катехоламинов и действие других гормонов (аргинин вазопрессина, AT II, альдостерона), имеющих большое значение в патогенезе сердечной недостаточности [Карпов, 2002; Pacher et al., 1996; Pousset et al., 1997].
В последние годы также показано, что наряду с ЭТ-1, AT II способствует гипертрофии КМЦ [Neyses at al., 1993]. Ряд авторов, основываясь на результатах опытов по культивированию КМЦ и фибробластов in vitro, показали, что в сердце млекопитающих существует внутренняя ренинангиотензиновая система (РАС), вырабатывающая AT I, AT II [Dostal et al., 1992; Miyata et Haneda, 1994] и экспрессирующая два типа рецепторов - тип 1 (АТід, АТір), тип 2 (АТг).В некоторых работах [Sadoshima et al., 1993] отмечается, что механическая нагрузка на сердечные миоциты в условиях культивирования in vitro приводит к выделению клетками AT II, что позволяет сделать заключение о том, что AT II может выступать в роли аутокринного медиатора в механизме гипертрофического роста КМЦ. Sadoshima et al. [1995] установили, что AT II вызывает в культивируемых КМЦ и фибробластах неонатальных крыс быстрое повышение активности тирозинкиназ, МАРК и "S6 kinase", которые вовлечены в регуляцию генной экспрессии и участвуют в фосфорилировании внутриклеточных субстратов, отвечающих за синтез белков и клеточный рост.
Hirata et al. [1994] обнаружили, что при воздействии AT II на культивируемые КМЦ происходит повышение в них экспрессии мРНК рецепторов к ЭТ-1, продуктов c-fos и с-тус протоонкогенов. При этом AT II не только стимулирует экспрессию c-fos, но и активизирует в миоцитах синтез ДНК и пролиферацию. По данным Villarreal et al. [1993], фибробласты взрослых крыс содержат рецепторы к AT, при воздействии на которые в клетках повышается синтез белков экстрацеллюлярного матрикса (фибронектина и коллагена). В ряде работ приводятся сведения о том, что AT II усиливает продукцию I типа коллагена, повышает синтез ДНК, РНК, белков, одновременно ингибируя активность коллагеназы, ключевого фермента коллагеновой деградации [Brilla et al., 1993; Crabos et al., 1994].
Большой интерес вызывают исследования Harada et al. [1999], которые, используя ATIA дефицитно-рецепторных мышей, подвергнутых стрессу, показали, что, наряду с лучшим выживанием, животные имели маловыраженное левожелудочковое ремоделирование, связанное с ослаблением фиброза.
Сравнительно недавно было также установлено, что AT II является индуктором апоптоза клеток миокарда [Kajstura et al., 1997].
Из приведенных выше данных литературы следует, что AT II играет немаловажную роль в структурной перестройке экстрацеллюлярного матрикса и в регуляции процессов ПКГ, что позволяет с новых позиций оценить его значение в возникновении и прогрессировании ХСН.
В настоящее время также имеются сведения о влиянии альдостерона на ремоделирование сердца при ХСН. Альдостерон приводит к стимуляции фибробластов, повышению синтеза коллагена и развитию интерстициального фиброза, возрастанию жесткости миокарда с развитием диастолической дисфункции левого желудочка [Арутюнов с соавт., 2000; MacFadyen, 1997].
На современном этапе доказано, что на межклеточные взаимоотношения в миокарде оказывают влияние следующие факторы: фактор роста фибробластов (ФРФ), ИПФ роста, эпидермальный фактор роста (ФРЭ). Speir et al. [1992] обнаружили, что при культивировании in vitro в КМЦ возрастало количество мРНК основного ФРФ и транскриптов fig гена, кодирующих рецепторы к нему. Добавление в среду экзогенных ФРФ приводило к повышению включения 3Н-тимидина в культивируемые сердечные миоциты. Все это позволяет сделать предположение о том, что в клетках дефинитивного миокарда усиливается экспрессия ФРФ и рецепторов к ним, что, вероятно, содействует синтезу ДНК, регуляции рибосомальных и актиновых генов, а также клеточному переживанию.
В некоторых исследованиях показано, что ИПФ роста играет определенную роль в сердечной гипертрофии, вызывая в КМЦ повышение количества мРНК сократительных белков, что способствует образованию саркомеров de novo [Donath et al., 1994; Sacca et al., 1994].
Ряд авторов отмечают, что ИПФ роста в сердечных миоцитах стимулирует репликацию ДНК и митозы, увеличивает экспрессию органоспецифичных генов [Adachi et al., 1994; Kajstura et al., 1994].
Yu et al. [1992], Sun et al. [1995] наблюдали также, что культивирование in vitro миокарда крыс с ФРЭ стимулирует синтез ДНК и деление КМЦ, а также немышечных клеток.
Существенный интерес вызывают работы, представляющие анализ сочетанного действия некоторых аутокринных/паракринных факторов на клеточные элементы миокарда. Kardami [1990] было показано, что ФРФ и ИПФ роста усиливают в миоцитах и немышечных клетках сердца синтез ДНК и клеточную пролиферацию, в то время как ТФР-Р ингибирует эти процессы и способствует прекращению действия на клетки вышеупомянутых ростовых факторов.
Светооптическая и ультраструктурная характеристика мышечных и немышечных элементов миокарда у больных с различными стадиями хронической сердечной недостаточности
Результаты наших исследований показали, что клинически идентифицируемая ХСН, как правило, сопровождается существенной реорганизацией мышечных и немышечных элементов миокарда. Прежде всего, структурно-функциональные изменения происходят в КМЦ. При этом наблюдается выраженная вариабельность ультраструктурных профилей мышечных клеток сердца. Часто они приобретают различные нетипичные формы, напоминающие "вязанку хвороста" или ленту с большим количеством звездчатых разветвлений. Это связано, с одной стороны, с тем, что в сердце имеется чрезвычайно гетероморфная категория данных клеток, с другой стороны, угол и направление гистологического среза также существенно влияют на визуализируемый фенотип миоцитов. Вместе с тем во всех случаях фенотип КМЦ соответствовал профилям поверхности региональных капилляров. Это, очевидно, свидетельствует о том, что форма сердечных мышечных клеток in situ в значительной мере обусловлена их микроокружением.
Длина КМЦ в предсердиях и желудочках колебалась в широких пределах: от 47,2±4,6 мкм до 225,7±18,8 мкм. Поперечный размер клеток изменялся в меньших пределах.
Ультраструктурные исследования КМЦ показали, что при ХСН происходят значительные структурно-функциональные изменения миофибрилл. При этом наблюдается их очаговый лизис и фрагментация, нарушение ориентации, частичная или полная дискомплексация саркомеров, деформация Z-линий (рис.2). Данные процессы наиболее ярко проявляются в периферических участках цитоплазмы сердечных миоцитов, сопровождаются активизацией лизосом и формированием большого числа ламеллярных телец.
Нередко в КМЦ отмечается косое расположение миофибрилл, неравномерное их сокращение, появление полос пересокращения, контрактурного повреждения, прикрепления к кариолемме (рис.3,4). В некоторых сердечных миоцитах обнаруживаются участки смещения Z-дисков соседних миофибрилл по отношению друг к другу. У больных с СН НБ стадии иногда наблюдались размывание и исчезновение дисков Z, А, приводящие к гомогенизации миофибрилл (рис.5).
Следует особо подчеркнуть, что у больных с ХСН I и особенно ПА стадиями в зонах локальных разрушений миофибрилл, вблизи Z-линий регистрировалось большое количество свободных рибосом и полисом, появлялись небольшие вновь образованные миофибриллярные пучки, располагающиеся веерообразно, или под углом к длиннику клетки (рис.6). Все это свидетельствует об осуществлении репаративного миофибриллогенеза. Напротив, у больных с ХСН ПБ стадии подобного феномена мы не проследили, что, вероятно, указывает на исчерпание резерва и возможностей внутриклеточной регенерации сократительных структур КМЦ у данной категории пациентов.
Ультраструктурные исследования КМЦ показали, что миофибриллы занимают, как правило, большую часть их объема (табл.4). Однако убедительных различий их площадных и объемных характеристик в зависимости от стадии ХСН нами выявлено не было. Так при ХСН I стадии в некоторых случаях наблюдались атрофия сократительного аппарата и "опустошение" обширных зон цитоплазматического матрикса (рис.7). И, наоборот, при ХСН ПБ стадии нередко обнаруживались "сохранные" миофибриллы, имеющие правильное строение и ориентацию (рис.8).
Нами установлено, что в сердечных миоцитах больных с ХСН существенные изменения претерпевают митохондрии. Обычно они локализуются в межмиофибриллярных пространствах, субсарколеммальной и парануклеарной зонах. Именно здесь они формируют продольные тяжи (колонки) либо конгломераты, в результате чего образуются ассоциации митохондрий с большим количеством межмитохондриальных контактов (рис.9), что может рассматриваться в качестве одной из компенсаторно-приспособительных реакций сердечной мышечной ткани.
По мере нарастания тяжести ХСН в митохондриях усиливались ультраструктурные изменения. Наблюдались явления их набухания, разрушения крист. Фрагментация крист чаще обнаруживалась в центральных участках митохондрий. Мелкие фрагменты крист иногда принимали вид вакуолей. В набухших митохондриях между сохранившимися кристами или их крупными фрагментами нередко возникали анастомозы, в результате чего кристы приобретали вид ломаной кривой. В митохондриях также происходило уменьшение количества крист. Установлен выраженный внутриклеточный гетероморфизм митохондрий. Обнаруживались митохондрии различной конфигурации (гантелеобразные, в виде полумесяца, элипса и др.) неодинаковой и электронной плотности матрикса. При этом одни органеллы выглядели просветленными и набухшими с явлениями вакуолизации, другие были темными с электронно-плотным матриксом и осмиофильными гранулярными включениями (рис.9).
Следует особо заметить, что по мере нарастания ХСН митохондрии изменяли свою пространственную локализацию. У больных с СН II А и II Б стадиями они все более располагались вблизи сарколеммы, контактирующей с прилежащими гемокапиллярами. Очевидно, что такая диспозиция данных органелл отражает соответствующие метаболические изменения КМЦ, предполагающие градиент транспорта кислорода и передачи энергии от периферии в глубь клетки. Иногда плотно упакованные митохондрии обнаруживались в крупных выпячиваниях сарколеммы - кавеолах (рис.10). В ряде случаев при этом происходило разрушение базальной мембраны и "выталкивание" органелл в межклеточное пространство. Обращает на себя внимание то, что у больных с ХСН I стадии в некоторых КМЦ наблюдалось новообразование митохондрий, происходящее путем перешнуровки их на две части, или путем почкования. Гиперплазия митохондрий, наблюдаемая нами является проявлением регенераторной внутриклеточной реакции, направленной на поддержание энергообеспечения сердечных миоцитов в условиях развития патологического процесса.
Следует подчеркнуть, что степень выраженности деструктивных процессов в митохондриях в полной мере коррелировала со стадией ХСН. Так в КМЦ больных с ХСН ІІБ стадии отмечались необратимые изменения этих органелл, сопровождающиеся разрушением наружной мембраны, резким набуханием с потерей крист, вымыванием или гомогенизацией матрикса. Наконец, необходимо указать на выявленное нами нарушение отношения митохондрии/миофибриллы, которое, несмотря на некоторое возрастание (при СН I — 0,31; СН НА - 0,33; СН ПБ - 0,38), не может свидетельствовать о благоприятной энергетической ситуации в миокарде, так как при СН ПБ стадии увеличивается число патологически измененных и функционально несостоятельных митохондрий. Очевидно, что при гипертрофии сердечных миоцитов данные изменения энергетических органелл может привести к фатальным ультраструктурным повреждениям их сократительного аппарата. С другой стороны, преимущественное сохранение миофибрилл в клетке с дегенеративно измененными митохондриями, может быть связано с более длительным периодом жизни сократительных белков по сравнению с митохондриальными.
По мере прогрессирования ХСН в цитоплазме сердечных миоцитов значительно нарастало количество лизосом. У больных с СН ПА, Б стадиями в околоядерной и субсарколеммальной зонах определялись крупные аутофагосомы и липофусциновые тельца (рис.11). Последние, как известно, являются разновидностью остаточных телец, продуктом лизосомального поглощения и дегенерации митохондрий и миофибрилл. Высокая лизосомальная и аутофагоцитарная активность, наблюдаемая нами в КМЦ, может свидетельствовать о наличии саморазрушающего процесса цитоплазматической дегенерации, осуществляемого под контролем самоконтролируемого запрограммированного аутолиза [Yamammoto et al., 2000].
Аутофагические процессы преимущественно нарастали у больных с СН ПБ стадии. При этом мы наблюдали появление миелиноподобных образований в цитоплазме КМЦ и в межклеточных пространствах. Возрастали численность и размеры липосом. Их гомогенное осмиофильное содержимое было не отграничено мембраной. Липидные капли чаще всего располагались вблизи митохондрий, между миофибриллами и в околоядерной зоне КМЦ (рис.12).
Роль апоптоза клеток миокарда в развитии хронической сердечной недостаточности
В последние годы широко обсуждается значение апоптоза в патогенезе многих патологических состояний. Предполагают, что апоптоз может быть одним из механизмов уменьшения числа КМЦ при различных сердечнососудистых заболеваниях: гипертрофической кардиомиопатии, миокардите, аритмогенной кардиопатии правого желудочка.
Активно изучается также роль апоптоза в миокарде при ХСН, однако однозначного взгляда на эту проблему до настоящего времени нет. Ряд авторов выдвигает гипотезу о связи развития ХСН с увеличением в миокарде клеток с признаками апоптоза [Sharov et al., 1996; Ikeda et al., 1999]. ПКГ рассматривается при этом как один из механизмов ремоделирования сердца, способствующих переходу от компенсаторной гипертрофии к дисфункции левого желудочка.
В настоящей главе представлены результаты наших исследований на светооптическом, электронно-микроскопическом и иммуноцитохимическом уровнях. В последнем случае мы использовали моноклональные антитела к р53 фирмы "Дако", набор реактивов ApopTag фирмы "Intergen" для выявления фрагментации ДНК при изучении интраоперационных биоптатов ушка правого предсердия больных с различными стадиями ХСН.
При анализе миокарда на светооптическом уровне нами были обнаружены выраженные структурно-функциональные изменения КМЦ, имеющие тенденцию к усугублению у больных с СН ІІБ стадии. К общим чертам гистологической картины в разных наблюдениях можно отнести следующие особенности: возрастание гетероморфизма КМЦ, ремоделирование интерстиция и сосудов МЦР, нарушение паренхиматозно-стромальных взаимоотношений. В ходе исследования было идентифицировано несколько типов КМЦ: клетки с признаками гиперплазии и гипертрофии с адекватной организацией и локализацией органелл; гипертрофированные КМЦ с глыбчатым, причудливой формы ядром и с ненарушенной топографией органелл; гипертрофированные клетки с участками локальных повреждений миофибрилл, в которых располагались крупные лизосомы, мелкие митохондрии со "смазанными" кристами, липофусциновые гранулы; КМЦ со значительной дискомплексацией саркомеров, фрагментацией и изменениями параллельной ориентации миофибрилл; сердечные миоциты с признаками атрофии и вакуолизации.
Среди КМЦ выявлялись также отдельные клетки со специфическими ультраструктурными изменениями. Эти клетки были уменьшены в объеме. В них наблюдались конденсация цитоплазмы, везикуляция мембранных структур, образование на поверхности крупных кавеол. Количество таких клеток составило не более 1% от общего числа КМЦ. Следует особенно подчеркнуть, что описываемые клетки располагались в миокарде, не имеющем признаков воспаления, некробиоза и некроза, что может косвенно свидетельствовать об их принадлежности к апоптозоизмененным клеточным элементам.
В ходе ультраструктурного анализа нами были идентифицированы КМЦ и интерстициальные клетки с признаками апоптоза. В таких клетках имелись ядра с выраженной маргинацией и дезинтеграцией хроматина, с образованием множества выпячиваний кариолеммы (рис.31). В единичных случаях регистрировались ядра с глубоко инвагинированной кариолеммой, в плоскости ультратонких срезов содержащие митохондрии, что может указывать на причастность таких клеток к началу апоптоза. Следует особо подчеркнуть, что описанные апоптозные тельца как проявление финальной стадии апоптоза при электронно-микроскопическом исследовании обнаруживались редко (рис.32), что, видимо, связано с быстротечностью данного процесса и трудностью его идентификации [Pouyssegur, 1985].
Нами также выявлены ультраструктурные изменения миокардиальных клеток, касающиеся их митохондрий и клеточной поверхности, не характерные для классической морфологической картины апоптоза. В КМЦ при этом отмечалась необычная конденсация внутриклеточных органелл, в частности митохондрий, скопления которых наблюдались либо в центральной части клеток (при этом атрофичные миофибриллы оттеснялись к краю клетки), либо по периферии между миофибриллами. Митохондрии в таких клетках были мелкими, полиморфными, с уплотненным матриксом. Нередко рядом с подобными клетками выявлялись макрофаги (рис.33). Подобную реорганизацию клеток ряд исследователей относят к апоптотическому состоянию [Бокерия с соавт., 1995; Бескровнова с соавт., 1998; Непомнящих с соавт., 2001].
В некоторых КМЦ наблюдалось образование множества выпячиваний уплотненных участков цитозоля, прилежащего к клеточной поверхности, нередко достигающих значительных размеров и иногда содержащих конденсированные митохондрии, что нами расценено как признак формирования дискретных апоптозных структур цитоплазмы (рис.34). В ряде случаев отмечалась отшнуровка подобных фрагментов клеток с элиминацией во внеклеточные пространства (рис.35), где они могли затем фагоцитироваться макрофагами. При этом признаков воспаления в окружающих структурах сердечной ткани не выявлялось.
Электронно-микроскопическое исследование показало, что апоптозоизмененные клетки миокарда встречаются довольно редко (0,08-0,12%) и обнаруживаются у больных с различными стадиями ХСН. Тем не менее, при ультраструктурном анализе достоверных различий между числом апоптозных клеток сердца и стадиями ХСН нами не установлено.
При изучении иммуноцитохимически окрашенных препаратов к р53 было выявлено, что экспрессия р53 отмечалась в клеточных элементах миокарда больных с различными стадиями ХСН. Она определялась в виде окрашивания цитоплазмы клеток в розовато-коричневатый цвет разной интенсивности (от слабой - до ярко выраженной) (рис.36). В некоторых случаях в этих клетках обнаруживались также интенсивно окрашенные пикноморфные ядра, иногда смещенные на периферию (рис.37). Количество клеток, экспрессирующих р53, варьировало от 15 до 7,4% (р 0,05) у больных в зависимости от тяжести ХСН, имея тенденцию к снижению по мере ее нарастания (рис.38).
При проведении иммуноцитохимического исследования на выявление фрагментации ДНК ядерный хроматин клеток, вступивших в апоптоз, приобретал коричневое окрашивание, в то время как неизмененные ядра оставались голубыми (рис.39), что подтверждает наличие в отдельных КМЦ и немышечных клетках сердца больных с различными стадиями ХСН признаков апоптотической дегенерации. Следует подчеркнуть, что иммунопозитивные ядра обнаруживались в большинстве случаев в КМЦ. Число клеток миокарда, подвергшихся апоптозу, в зависимости от стадии ХСН колебалось от 0,012 % (при СН I) до 0,85% (при СН НБ). Таким образом, мы наблюдали достоверное увеличение (по критериям данного метода) апоптоза сердечных миоцитов у пациентов с тяжелой сердечной недостаточностью независимо от этиологических факторов, приведших к ее развитию. Причем клинико-морфологические сопоставления показали, что апоптоз КМЦ был выше у больных с быстрым ухудшением клинических проявлений (0,85%), чем при среднем (0,63%) или медленном (0,11%) прогрессировании недостаточности сердца.
Существенное различие в количестве выявленных клеток с признаками апоптоза вышеописанными иммуноцитохимическими методиками можно, вероятно, объяснить тем, что они позволяю идентифицировать клетки, находящиеся в разных фазах апоптотического цикла (от клеток, готовых вступить в апоптоз и экспрессирующих р53, до клеток, ядра которых подверглись фрагментации и конденсации ДНК). Видимо, не все клетки, готовые вступить на путь апоптоза, затем доходят до его финальной стадии, что подтверждает концепцию об обратимости апоптоза и о наличии эволюционных механизмов, посредством которых ядро может оставаться интактным, несмотря на продолжающийся апоптоз цитоплазмы [Narula et al., 2000].
Таким образом, апоптоз клеток миокарда, обнаруживался у больных с различной степенью тяжести ХСН, отражая при этом состояние тканевого гомеостаза. Увеличение КМЦ с признаками апоптоза (по тесту на фрагментацию ДНК) можно рассматривать в качестве важного механизма развития миокардиальной дисфункции и ремоделирования сердца при ХСН, а также предиктора ее быстрого прогрессирования.
Ультраструктурная реорганизация реактивно измененного миокарда в условиях культивирования in vitro
Метод культивирования миокарда in vitro делает возможным изучение диапазона гистогенетических потенций его тканевых элементов, позволяя при этом оценить структурно-функциональные изменения в сердечной мышце при прямом воздействии на нее различных гуморальных факторов. Данный метод заключается в существенном изменении условий существования тканевых элементов, приводящих к нарушению внутритканевых и межтканевых связей, резко выраженным реактивным изменениям тканевой и клеточной дифференцировки. При этом создаются предпосылки для гистогенетического анализа всей совокупности морфологических изменений, наблюдаемых в тканях при различных условиях существования (включая патологические ситуации), и, вместе с тем, для углубленного исследования собственных свойств тканей, а также их структурных и функциональных особенностей во всей динамике превращений.
В этом разделе работы нами представлены результаты изучения структуры реактивно измененного миокарда в условиях органотипического культивирования in vitro, в том числе при прямом влиянии на него некоторых гипоталамических нонапептидов и моноаминов, а также лекарственных средств. Культивированию в течение 3-х суток подвергался эксцизивный биопсийный миокард больных с различными стадиями ХСН и миокард крыс с ЭСН.
Светооптический и электронно-микроскопический анализ миокарда контрольной серии (культивирование объектов без экзогенного введения гуморальных факторов) показал наличие выраженного ультраструктурного и клеточного гетероморфизма КМЦ. Нами идентифицировано несколько типов сердечных миоцитов. Во-первых, это переживающие КМЦ, имеющие четкие контуры, правильную организацию митохондрий, миофибрилл, крупные ядра с типичным распределением гетеро - и эухроматина. В некоторых из таких КМЦ отмечались признаки гипертрофии митохондрий и миофибрилл. При этом митохондрии в подобных КМЦ имели различные размеры и конфигурацию. Выявлялись набухшие митохондрии с разрушенными или фрагментированными кристами; митохондрии с грубыми, плотно упакованными кристами; митохондрии, содержащие осмиофильные аморфные и кристаллоподобные тельца.
Часть митохондрий приобретало гантелеобразную форму или форму полумесяца. Митохондрии часто формировали продольные тяжи, или конгломераты, в результате чего образовывались их ассоциации с большим количеством межмитохондриальных контактов. В ряде случаев обнаруживался феномен "отпочковывания" митохондрий. В некоторых компартментах КМЦ встречались аномально расположенные миофибриллы, в которых ориентация миофиламентов менялась от продольной к косой. Наиболее выраженная фрагментация и дискомплексация миофибрилл наблюдалась в области вставочных дисков и в парануклеарных зонах.
Значительные изменения претерпевала также и сарколемма. Происходило существенное увеличение площади поверхности сердечных миоцитов за счет образования множества кавеол, представляющих собой глубокие инвагинации плазмалеммы. В ряде случаев выпячивания уплотненных прицитолеммных участков КМЦ достигали значительных размеров, а ультраструктура базальной пластинки (базальной мембраны) была существенно дезорганизованной (рис.55).
В цитоплазме КМЦ постоянно отмечались многочисленные плотные слоистые осмиофильные тельца, которые представляют собой миелиноподобные образования с включением в них гранул гликогена или ряда неидентифицируемых структур. Миелиноподобные тельца локализовались в подсарколеммальных пространствах, в вакуолях, у вставочных дисков и в межмышечных зонах вокруг капилляров. В большинстве КМЦ регистрировались вторичные лизосомы, липосомы (рис.56), аутофагосомы, превращающиеся по мере деградации сегрегированных участков цитоплазмы в остаточные тельца.
Количество переживающих КМЦ в эксплантатах всегда зависело от исходного функционального состояния миокарда. Их число значительно уменьшалось при культивировании кусочков сердечной мышцы больных с тяжелой стадией ХСН (рис.57).
КМЦ с различной степенью жировой дистрофии. В цитоплазме таких клеток содержалось большое количество липосом крупных размеров и включений липофусцина. Некоторые сердечные миоциты полностью подвергались липоидозу, теряя свою органотипичную структурную организацию. При этом в них наблюдались распад большинства митохондрий, исчезновение поперечной исчерченности миофибрилл, лизис ядра, замещение цитоплазмы жировыми каплями различной формы и величины.
В-третьих, идентифицированы гибнущие КМЦ, число которых в различных случаях варьировало, увеличиваясь в культивируемых эксплантатах больных с тяжелой стадией ХСН (рис.57). В таких клетках отмечался разнонаправленный характер и вид альтеративных изменений. Одни КМЦ при сохраняющихся фенотипических характеристиках имели гомогенизированную цитоплазму и пикнотизированные ядра. Контуры других сердечных миоцитов были разрыхлены. При этом в них часто наблюдались разрывы сарколеммы и выход органелл в межклеточное пространство. Гибель КМЦ сопровождалась значительным отеком цитоплазмы, тотальным миоцитолизом, разрушением ядерных структур. Часть сердечных миоцитов подвергалась апоптозу. В таких клетках отмечалось формирование дискретных апоптозоподобных телец как в проекции ядра (рис.58), так и по периферии цитоплазмы (рис.59).
Гетероморфный характер реактивных изменений был присущ не только сердечным миоцитам, но и клеткам интерстициальной соединительной ткани и сосудов микроциркуляторного русла. Клеточные элементы сосудов микроциркуляции в культивируемых кусочках миокарда подвергались значительной структурно-функциональной перестройке. Обнаруживались расширенные капилляры, заполненные сладжированными эритроцитами и другими форменными элементами крови. Отмечался гетероморфизм эндотелиальных клеток капилляров. Одни из них имели плотный цитоплазматический матрикс, другие- просветленную цитоплазму, третьи-были резко вакуолизированы. На апикальной поверхности клеток имелось множество микроворсинок. Во всех случаях в эндотелиоцитах регистрировались пиноцитозные пузырьки, свободные рибосомы, расширенные канальца эндоплазматического ретикулума, что может свидетельствовать об усилении транскапиллярного обмена. Среди элементов соединительной ткани нами были выявлены также дедифференцированные клетки (рис.60). Для них были характерны крупные светлые ядра с деконденсированным хроматином, узкий ободок цитоплазмы, содержащий большое количество свободных рибосом (полисом) и слабо развитые мембранные органеллы.
