Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 9
1.1. Артериальная стенка, атеросклероз и развитие атеросклеротических поражений 9
1.1.1. Атеросклероз. Введение в проблему 9
1.1.2. Формирование атеросклеротического поражения 11
1.1.3. Классификация атеросклеротических поражений 13
1.1.4. Понятие о стабильном / нестабильном (устойчивом / неустойчивом) состоянии
атеросклеротической бляшки 20
1.1.5. Типы клеток, участвующие в атерогенезе 21
1.2. Моноциты и макрофаги. Функциональная активность. Дифференцировка моноцитов в
макрофаги. Гетерогенность состава популяций и маркеры моноцитов/макрофагов 23
1.2.1. Характеристика моноцитов периферической крови человека. Субпопуляции
моноцитов. Дифференцировка в макрофаги 23
1.2.2. Пути активации макрофагов. Современные представления о гетерогенности состава популяции макрофагов 26
1.2.3. Классически активированные макрофаги и их функции
1.2.3.1. Характеристика провоспалительных факторов 27
1.2.4. Альтернативно активированные макрофаги и их функции 31
1.2.4.1. Характеристика противовоспалительных факторов 34
1.2.5. Метаболическая поляризация макрофагов М1 и М2 36
1.3. Современные представления о роли моноцитов и макрофагов в развитии атеросклеротического поражения 36
1.3.1. Привлечение моноцитов в интиму артерий и атерогенез 37
1.3.2. Возможная роль макрофагов в инициации и прогрессии атеросклеротического поражения 38
1.3.3. Трансформация макрофагов в пенистые клетки в атеросклеротическом поражении 40
1.3.4. Субпопуляции макрофагов в атеросклеротических поражениях 41
1.3.5. Про- и противовоспалительные факторы, характеризующие функции субпопуляций макрофагов в патогенезе атеросклеротических бляшек 46
1.3.5.1. Провоспалительные факторы 46
1.3.5.2. Противовоспалительные факторы 49
1.3.6. Роль металлопротеаз и их ингибиторов в развитии атеросклеротической бляшки 51
ГЛАВА II.Материалы и методы 55
ГЛАВА III. Результаты исследований 66
3.1. Морфологическая характеристика и идентификация атеросклеротических поражений сонных артерий человека в соответствии с классификацией Stary (1995). Оценка стабильности и нестабильности поражений 66
3.1.1. Классификация поражений исследуемой выборки образцов сонных артерий человека 66
3.1.2. Морфологическая характеристика атеросклеротических поражений 69
3.1.3. Оценка стабильности/нестабильности атеросклеротической бляшки сонных артерий человека 73
3.1.4. Исследование клеточного состава и факторов реорганизации межклеточного матрикса в различных областях атеросклеротических поражений разных типов с помощью иммуногистохимического метода 75
3.2. Исследовать роль макрофагов про- и антивоспалительного фенотипа в развитии, прогрессии и осложнении атеросклеротического поражения 82
3.2.1. Топография распределения субпопуляций макрофагов М1 и М2 в разных типах атеросклеротических поражений 82
3.2.1.1. Основные закономерности распределения субпопуляций макрофагов М1 и М2 82
3.2.1.2. Распределение субпопуляций макрофагов М1 и М2 в выраженных
атеросклеротических поражениях 88
3.2.2. Исследование содержания и распределения про- и антивоспалительных цитокинов – показателей функциональной активности макрофагов М1 и М2 в атеросклеротических поражениях 97
3.2.2.1. Изучение содержания маркерных белков моноцитов/макрофагов, про- и антивоспалительных цитокинов в различных типах атеросклеротических поражений 98
3.2.2.2. Оценка содержания маркерных белков моноцитов/макрофагов про- и антивоспалительных цитокинов в стабильных и нестабильных участках
атеросклеротических поражений 111
3.2.3. Изучение содержания факторов, участвующих в реорганизации межклеточного матрикса в атеросклеротических поражениях 118
3.2.3.1. Исследование содержания белков протеазно-антипротеазного баланса в атеросклеротических поражениях разных типов 118
3.2.3.2. Оценка содержания белков протеазно-антипротеазного баланса в стабильных и нестабильных участках атеросклеротических поражений 122
3.2.4. Корреляционный анализ содержания в атеросклеротических поражениях белков маркеров моноцитов/макрофагов, цитокинов и факторов протеазно-антипротеазного баланса. Возможная роль субпопуляций макрофагов М1 и М2 в реорганизации межклеточного матрикса 125
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 129
Заключение 146
Выводы 148
Список литературы 149 – 168
- Классификация атеросклеротических поражений
- Метаболическая поляризация макрофагов М1 и М2
- Оценка стабильности/нестабильности атеросклеротической бляшки сонных артерий человека
- Исследование содержания белков протеазно-антипротеазного баланса в атеросклеротических поражениях разных типов
Классификация атеросклеротических поражений
Интерлейкин-10 (IL-10) продуцируется тучными клетками, Т- и В-Лц, Мф и индуцирует дифференцировку Мц в Мф, блокируя наряду с этим их дифференцировку в дендритные клетки. IL-10 подавляет активацию транскрипционного фактора NFKB в Мц и некоторых клонах Т-Лц, но в то же время активирует NFKB и AP-1 (activator protein 1) в CD8+ Т-Лц (Moore et al, 2001).
Основными мишенями для IL-10 являются антиген презентующие клетки и Лц. Добавление in vitro рекомбинантного IL-10 к Т-Лц ведет к ингибированию ими продукции IL-2 и IFNy и образованию Т-супрессорных/регуляторных клеток. Под действием IL-10 в дендритных клетках ингибируется продукция IFNy, экспрессия костимуляторной молекулы В7 и представление антигена Tх1. Однако IL-10 усиливает функциональную активность В-Лц посредством активации Tх2 (Steinbrink et al, 1997).
Функционирование Мц/Мф регулируется IL-10 в нескольких направлениях: он регулирует продукцию цитокинов, ингибируя синтез про- и активируя синтез противовоспалительных цитокинов. В частности, IL-10 ингибирует продукцию провоспалительных медиаторов Мф и Мц, индуцированных LPS и IL-1: IL-1, IL-6, IL-8, G-CSF, GM-CSF и TNF (Mantovani et al, 2004, 2009; Martinez et al, 2008). IL-10 служит физиологическим антагонистом IL-12. Кроме того, он усиливает продукцию Мц и Мф антивоспалительных цитокинов, таких как IL-1RA и растворимая форма рецептора TNF. Несмотря на супрессорную активность, IL-10 не действует на фагоцитарную функцию Мф. IL-10 способствует экспрессии Fc- и скевенджер-рецепторов, в частности CD163, который является маркером M2c Мф. Считается, что CD163 обеспечивает взаимодействие между M2c Мф и эндотелиальными клетками в области воспаления (Antachopoulos, Roilides, 2005).
IL-10 подавляет иммунную функцию и других типов клеток. Например, ингибирует экспрессию молекулы адгезии ICAM-1 эндотелиальными клетками, а также Т -зависимую активацию В-клеток. IL-10 ингибирует выброс различных хемокинов нейтрофилами, синтез провоспалительных цитокинов, а также циклооксигеназы-2 (Moore et al, 2001).
Таким образом, IL-10 супрессирует продукцию провоспалитльных цитокинов и антигенпрезентирующую функцию Мф и дендритных клеток. IL-10 может вызывать изменение направленности иммунитета, выводя его из Tх1 в Tх2-зависимый иммунный ответ. Однако IL-10 может также подавлять активацию Tх2-Лц и стимулировать созревание Treg-лимфоцитов, обладающих иммунорегуляторными свойствами (Katakura et al, 2004; Buechler et al, 2000). Трансформирующий фактор роста бета (TGFP). Во взрослом организме TGFp проявляет три основных биологических действия. Во-первых, он регулирует пролиферацию многих клеток, в большинстве случаев подавляя ее (Zhang et al, 2006). Во-вторых, TGF-P усиливает формирование внеклеточного матрикса за счет активации синтеза его компонентов и подавления деградации, таким образом, являясь основным регулятором фиброза (Fichtner-Feigl et al, 2006). В третьих, этот цитокин оказывает выраженное иммуносупрессивное действие, являясь совместно с IL-10 одним из основных негативных иммуномодуляторов. В частности, сочетание иммуносупрессивной и фиброгенной функций позволяет TGF-P предотвращать возникновение хронического воспаления в постоянно сталкивающихся с инфекционными агентами легких, одновременно способствуя восстановлению в них тканей, поврежденных патогенами (Sheppard, 2006).
Однако тип действия цитокинов семейства TGF зависит от особенностей продукции, экспрессии рецепторов и микроокружения, при этом характер биологической активности может меняться на противоположный (Wang et al, 2006).
CCL18, известный также как pulmonary and activation-regulated chemokine (PARC), -противовоспалительный хемокин, принадлежащий к семейству СС хемокинов. Он на 60% гомологичен по аминокислотному составу CCL3. Основными мишенями для CCL18 являются Т-Лц и дендритные клетки. Рецептором для CCL18 служит CCR3 (Struyf et al, 2003).
CCL24 - хемокин, относящийся к эотаксинам, исходно был описан как хемоаттрактант для эозинофилов, участвующий в Тх2-ответе и экспрессируемый в основном активированными Мф и фибробластами (Jose et al, 1994). Этот хемокин является лигандом для рецептора CCR3, экспрессируемого эозинофилами, базофилами, Тх2-Лц и, в меньшей степени, нейтрофилиами (Pease, 2006). Более поздние исследования выявили наличие CCR3 на поверхности основных матрикс-синтезирующих клеток АСБ: ГМК и фибробластах (Isgr et al, 2012). Исследование функциональной активности CCL24 in vitro показало, что добавление его к культуре фибробластов обеспечивало приобретение ими миграционного фенотипа, характеризующегося усилением секреции коллагеназ, эластаз и металлопротеаз (Kodali et al, 2006), а также способствовало их миграции в раневом монослое (Isgr et al, 2012).
Участие СCL24 в патологиях продемонстрировано, в первую очередь, в связи с развитием аллергических заболеваний, таких как астма и аллергический ринит, а также при неспецифическом язвенном колите (Park et al, 2005). 1.2.5. Метаболическая поляризация макрофагов М1 и М2
Недавние исследования показали, что характер фенотипической и функциональной поляризации Мф связан с определенными изменениями в их метаболизме. Они основаны на разнице в энергетическом обмене: для субпопуляции М1 Мф характерно получение энергии путем гликолиза и окислительного пентозофосфатного пути, т.е. в анаэробных условиях, в то время как для М2 Мф характерно мембранное фосфорилирование в митохондриях с затратой кислорода. Оказалось, что синтез и функционирование ряда факторов, определяющих функциональную поляризацию в сторону той или иной субпопуляции Мф, зависит от интермедиантов соответствующих катаболических путей. Например, было показано, что сукцинат, типичный интермедиант цикла Кребса, накапливающийся в М1 Мф, регулирует синтез HIF1, участвующего в поддержании уровня IL1 и проявлении других провоспалительных функций (Galvn-Pea and O Neill, 2014; Zhu et al., 2014). Авторы предполагают возможность использования подобных метаболитов, например, седогептулозофосфаткиназы, связанной с синтезом Arg1 в М2 Мф и другими элементами антивоспалительного ответа, для переключения уже активированных Мф в другой вариант поляризации, что может оказаться перспективным при лечении ассоциированных с Мф заболеваний.
Исходно атеросклероз воспринимали в первую очередь как заболевание, связанное с нарушением липидного обмена, а накопление ЛП, а особенно ЛП низкой плотности (ЛПНП) в стенке сосуда и атеронекротическом ядре – как центральное звено патогенеза. Действительно, инфильтрация и аккумуляция ЛПНП в интиме является триггерным событием, запускающим развитие атеросклеротического поражения (Ross, 1997; Fan, Watanabe, 2003). Однако в настоящее время сформировалось единое представление о центральной роли воспалительной реакции и осуществляющих её иммунных клетках, как в развитии атеросклероза, так и в дестабилизации выраженного поражения, приводящей к разрыву, тромбообразованию и возникающим вследствие этого клиническим проявлениям, таким как тромбоз, инфаркт и инсульт (Hansson, 2009; Libby et al., 2013). При этом среди разнообразных иммунных клеток многие исследователи отводят Мф основную роль в инициации, поддержании и погашении воспалительного процесса в АСБ, стимуляции образования осложнений, миграции ГМК и фибробластов, деструкции и синтезе соединительнотканного матрикса и, как следствие, в стабилизации или дестабилизации поражения (Moore and Tabas, 2011).
Метаболическая поляризация макрофагов М1 и М2
Иммуногистохимическое выявление антигенов на срезах. Оценка распределения в атеросклеротических поражениях различных клеточных субпопуляций Часть криосрезов атеросклеротических поражений использовали для иммуногистохимического выявления различных антигенов с помощью непрямого пероксидазного метода с использованием авидин-биотинового комплекса. Для идентификации типов клеток использовали мышиные моноклональные антитела в разведении 1:100 (DAKO, Дания) против специфических клеточных маркеров: Мц/Мф -CD14 (корецептор к липополисахариду), зрелых Мф - НАМ56 (гликопротеид с неизвестной функцией), Т-Лц - CD3 (Т-клеточный рецептор), ГМК - SM a-actin (гладкомышечный а-актин), эндотелиальных клеток - vWF (фактор фон-Виллебранта). Субпопуляции М1 и М2 Мф выявляли согласно принятой на сегодняшний день схеме, используя мышиные моноклональные антитела в разведении 1:100 (BD, Франция) против маркера провоспалительных Мф – MCP-1 (моноцит-хемотаксический фактор 1) и против двух маркеров антивоспалительных Мф: СD206 (маннозный рецептор) и CD163 (гемоглобиновый – гаптоглобиновый рецептор – маркер регуляторных М2) (Bouhlel et al., 2007; Chinetti-Gbaguidi et al., 2011).
Для выявления клеток, секретирующих ферменты, участвующие в реорганизации матрикса, использовали мышиные моноклональные антитела против металлопротеазы 9 – MMP9 (Abcam, США) в разведении 1:500 и ингибиторы металлопротеаз – смесь TIMP1/2 (Novocastra, Германия) в разведении 1:300 (табл. 4).
Для иммуноцитохимического окрашивания криосрезы отмывали от среды для замораживания Tissuеek (фирма) в теплом ФСБ (37С), обрабатывали 10% неимунной сывороткой козы (продуцент вторых антител) (Vector, США) в течение 15 минут для блокирования неспецифического связывания антител, наносили первые антиген-специфичные мышиные моноклональные антитела и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Далее срезы фиксировали 10% забуференным формалином (Биовитрум, Россия) в течение 10 мин. Для ингибирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали 3% перекисью водорода в течение 10 мин в темноте. Далее срезы инкубировали с биотинилированными козьими поликлональными антителами к мышиным IgG (Vector, США) в разведении 1:200 в течение 30 минут при комнатной температуре. Выявление мест связывания антител с антигенами проводили путем инкубации в растворе конъюгата авидина D с пероксидазой хрена (Vector, США) в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей визуализацией с помощью стандартного набора на основе диаминобензидина (Vector, США), следуя инструкции производителя. Ядра докрашивали гематоксилином Майера. Срезы обезвоживали по стандартной методике и заключали в BioMount (Bio Optica, Италия).
В качестве негативного контроля использовали срезы, на которые наносили в качестве первых антител неиммунные IgG мыши в той же концентрации, что и специфические антитела. При этом на всех контрольных препаратах неспецифическое окрашивание не выявлялось. Таблица 4. Антитела против специфических маркеров, использованные для выявления различных клеточных субпопуляций и молекул, участвующих в реорганизации матрикса АСБ.
Примечание: Мц - моноциты, Мф - макрофаги, Гр – гранулоциты, Нф – нейтрофилы, Лц – лимфоциты, Пк – пенистые клетки, ГМК – гладкомышечные клетки, миоФб – миофибробласты, ЭК – эндотелиальные клетки, Фб – фибробласты, Дк – дендритные клетки.
Анализ распределения субпопуляций М1 и М2 макрофагов в различных областях и типах атеросклеротических поражений
В первой части исследования анализировали топографию распределения Мф М1 и М2 на срезах в неизмененной интиме сосуда и при различной степени прогрессии атеросклеротического поражения. Во второй части работы была проведена количественная оценка распределения Мц, Мф М1 и М2 в участках АСБ, наиболее предрасположенных к разрыву и тромбозу – в покрышке и плечах. При этом проводили подсчет числа клеток каждого типа, приходящихся на общую площадь участка среза в 1мм2. Иммуноферментный анализ атеросклеротических бляшек
Для проведения иммуноферментного анализа (ИФА) замороженные в жидком азоте фрагменты (n = 95) образцов атеросклеротических поражений различного типа гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере при pH = 7,4, содержавшем смесь ингибиторов протеаз. Для этого каждую секцию АСБ предварительно взвешивали и на холоде разбивали молотком на более мелкие куски с тем, чтобы в микроцентрифужной пробирке (Eppendorf, Германия) соотношение объема буфера к весу ткани составляло не больше 500 мкл буфера на 100 мкг ткани. В 1 мл буфера содержались в конечной концентрации: 1mM диэтилтритола, 1mM PMSF, 10g леупептина (Sigma, США). Ткань после добавления к ней необходимого объема буфера гомогенизировали с помощью гомогенизатора (IKA, США) в течение 1 – 2 мин до гомогенного состояния. Затем гомогенат центрифугировали в течение 20 мин при 12000 об/мин и 40С. После этого отбирали супернатант, разделяли на аликвоты по 100 мкл, замораживали и хранили при -700С для последующего ИФА.
ИФА проводили согласно протоколам производителей, используя готовые наборы для выявления в тканевых гомогенатах хемокинов CCL3, CCL18 и CCL24, маркерных белков Мц/Мф CD14 и CD163 (RandD, США), цитокинов MCP-1, IL-1b, IL-6, IL-12 (BD, Франция), IL-8, IL-10, фактора роста TGF-1 (BMS, Франция) и факторов, участвующих в реорганизации матрикса: MMP2 и TIMP2 (RandD, США), MMP9 и TIMP1 (BMS, Франция), (табл. 5). Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре (BioRad, Германия) при длине волны 450 нм. Для устранения погрешности, вызванной оптическими искажениями в образце, из результата вычитали оптическую плотность при 570 нм, согласно протоколам производителей. В качестве калибровочных стандартов для определения концентрации каждого фактора использовали стандарты из готовых коммерческих наборов. Концентрации всех факторов нормализовали на количество общего белка в гомогенатах, которое определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). Таблица 5. Цитокины, исследованные методом ИФА.
Примечание: Мц - моноциты, Мф - макрофаги, Пк – пенистые клетки, ГМК – гладкомышечные клетки, Фб – фибробласты, Гр – гранулоциты, Нф – нейтрофилы, Эф – эозинофилы, Дк – дендритные клетки, Лц – лимфоциты, ЭК – эндотелиальные клетки, Тк – Т киллеры, Тх – Т хелперы, НК – натуральные киллеры, ТК – тучные клетки. Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ STATISTICA 7.0, Medcalс и Microsoft Excel, входящей в пакет программного обеспечения Microsoft Office 2003. Для оценки статистической значимости отличий применяли двусторонний непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р 0,05. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Спирмана, при этом коэффициент корреляции считали достоверным при р 0,05. На таблицах и графиках данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартная ошибка среднего.
Оценка стабильности/нестабильности атеросклеротической бляшки сонных артерий человека
Широкий спектр действия и неоднозначность влияния, оказываемого субпопуляциями Мф на развитие и стабильность АСБ, связаны с разнообразием и многофункциональностью продуцируемых ими цитокинов (Mantovani et al., 2004, 2009; Martinez et al., 2008). В целом, М1 Мф секретируют широкий спектр провоспалительных интерлейкинов и хемокинов, основная задача которых – стимулировать и поддерживать острое воспаление. Напротив, М2 Мф в основном секретируют антивоспалительные цитокины: интерлейкины, хемокины и факторы роста. Деятельность этих клеток направлена на торможение острого воспаления и стимуляцию репарации ткани. С другой стороны, активность М2 Мф может способствовать хронизации воспалительного процесса. Кроме того, функции секретируемых Мф молекул достаточно разнообразны, а итоговое воздействие на ткани зависит от сложного сочетания цитокинов. Изучение распределения последних в разных участках и на разных стадиях развития атеросклеротических поражений, таким образом, необходимо для понимания возможной роли в них М1 и М2 Мф.
Исследование функциональной активности субпопуляций Мф М1 и М2 проводили, изучая содержание секретируемых ими соответствующих про- (CCL3, MCP-1, IL-1, IL-6, IL-8 и IL-12) и антивоспалительных цитокинов (IL-10, CCL18, CCL24 и TGF-1) в гомогенатах изучаемых типов атеросклеротических поражений методом ИФА. В качестве показателей функциональной активности субпопуляций М1 и М2 Мф были исследованы именно те цитокины, которые у человека, по мнению большинства авторов, наиболее ярко отражают присутствие и активность каждой из этих субпопуляций (Mantovani et al., 2004, 2009; Martinez et al., 2008). Известно, что помимо Мф эти факторы с разной интенсивностью секретируют и другие клетки бляшки: Т-Лц, ГМК и эндотелиальные – однако полагают, что именно Мф оказывают основное действие на развитие и патогенез АСБ. По-видимому, задача остальных клеток в большей степени состоит в создании необходимого микроокружения для дифференцировки и активации по про- или антивоспалительному пути самих Мф, без которых не происходит развития очага атеросклеротического поражения (Tedgui and Mallat, 2006; Hansson and Hermansson, 2011; Murray et al., 2014). Помимо перечисленных цитокинов маркером М2 Мф является белок CD163. Этот белок выявляется на М2с субпопуляции Мф (см. главу «Обзор литературы»), выполняющих иммунорегуляторную функцию (Mantovani et al., 2004). Присутствие белков CD163, маркера М2 Мф, и CD14, основного маркера Мц, в разных типах поражений также выявляли с помощью метода ИФА.
Изучение содержания маркерных белков моноцитов/макрофагов, про- и антивоспалительных цитокинов в различных типах атеросклеротических поражений
Исследование распределения маркерных белков Мц/Мф: CD14, основного маркера Мц, и CD163, маркера М2с Мф, – выявило их повышенное содержание в выраженных атеросклеротических поражениях (атеромах, фиброатеромах и осложненных бляшках) по сравнению с фиброзными и фиброкальцинозными (табл. 16), что соответствует выше отмеченному о высоком содержании Мц/Мф в этих бляшках (см. табл. 8). При этом уровень белка CD14, связывающего липополисахариды корецептора к толл-подобному рецептору 4 (TLR4), был достоверно выше в этих поражениях по сравнению с фиброзными в 2,2, 2,6 и 2,4 раза, соответственно, и фиброкальцинозными – в 2,8, 3,4 и 3,2 раза, соответственно (рис. 27). Данный факт свидетельствует о постоянном поступлении в такие бляшки Мц из кровотока. Аналогичное распределение было показано и для белка CD163, маркера М2с Мф (рис. 28). Минимальное его количество было в фиброзных и фиброкальцинозных бляшках, а максимальное – в осложненных поражениях. Достоверно более высокое его содержание было выявлено в фиброатеромах и осложненных поражениях по сравнению с фиброзными – в 2,3 и 3,2 раза, соответственно, а по сравнению с фиброкальцинозными – соответственно, в 2,4 и 3,4 раза. Рис. 27. Содержание белка CD14 (маркера Мц) в атеросклеротических поражениях разных типов. Достоверные различия между типами поражений (p 0,05) представлены в таблице под графиком. Номера в таблице соответствуют номерам поражений на графике.
Содержание белка CD163 (маркера регуляторных М2с Мф) в атеросклеротических поражениях разных типов. Достоверные различия между типами поражений (p 0,05) представлены в таблице под графиком. Номера в таблице соответствуют номерам поражений на графике. Острый воспалительный процесс в атеросклеротических поражениях обусловлен деятельностью Мф провоспалительного фенотипа М1, секретирующих ряд соответствующих провоспалительных цитокинов, важнейшими из которых являются IL-1, IL-6, IL-8 и IL-12. В частности, показано, что IL-1 стимулирует адгезию, миграцию лейкоцитов через эндотелиальные клетки и синтез провоспалительных цитокинов; IL-6 является индуктором острой фазы воспалительного ответа и тканевого повреждения; а IL-8 играет ключевую роль в миграции лейкоцитов и активации ГМК и эндотелиальных клеток в очаге воспаления; IL-12 - основной индуктор синтеза IFNy (Tedgui and Mallat, 2006; Apostolakis et al, 2009). Исследование распределения большинства этих цитокинов в разных типах атеросклеротических поражений позволило нам обнаружить их повышенное содержание в атеромах, фиброатеромах и осложненных поражениях по сравнению с фиброзными и фиброкальцинозными (табл. 16). Уровень IL-6 был самым высоким в атеромах, фиброатеромах и осложненных поражениях, существенно отличаясь от его содержания в фиброкальцинозных бляшках, соответственно, в 12,9, 7,1 и 11,2 раза. В фиброзных поражениях уровень этого белка был высоким, однако в 2,4 раза ниже, чем в атеромах, и в 2,1 раза ниже, чем в осложненных бляшках (рис. 29). В осложненных поражениях было показано максимальное содержание IL-8, достоверно превышающее его уровень в фиброзных и фиброкальцинозных бляшках в 4,1 и 10,1 раз, соответственно. Более высокое содержание по сравнению с теми же бляшками (в 2,4 и 5,8 раз, соответственно) было выявлено и в фиброатеромах. В атеромах в среднем также наблюдался высокий уровень IL-8, однако достоверных различий с остальными типами поражений выявлено не было (рис. 30). Во всех типах атеросклеротических поражений, кроме фиброкальцинозных, уровень IL-1 был высоким. Максимальное содержание, превышающее в 5,6 раза его уровень в фиброкальцинозных бляшках, было отмечено в фиброатеромах (рис. 31). Однако самый низкий уровень IL-12 был выявлен в осложненных поражениях, достоверно отличающийся в 5,6 и 4,7 раз от его уровня в фиброатеромах и фиброзных поражениях, соответственно. В фиброкальцинозных поражениях содержание IL-12 также было низким, а в липидных пятнах/полосах и атероме - высоким, однако достоверных различий с остальными типами поражений выявлено не было (рис. 32). Помимо провоспалительных интерлейкинов в атерогенезе АСБ важную роль играет противовоспалительный IL-10 (Mallat et al, 1999; Tedgui and Mallat, 2006). Максимальное содержание IL-10 было выявлено в осложенных поражениях, в остальных поражениях уровень его был минимальным (табл. 16, рис 33).
Исследование содержания белков протеазно-антипротеазного баланса в атеросклеротических поражениях разных типов
Атеросклероз – многофакторное заболевание, в котором воспаление является основным из звеньев патогенеза (Libby et. al., 2013). Воспалительная реакция в сосуде протекает на основе сложного взаимодействия различных типов клеток, как пришедших из кровеносного русла (Мц, Мф, Лц и др.), так и клеток стромального компонента сосудистой стенки (эндотелия, ГМК, фибробластов, перицитов). В результате этого взаимодействия атеросклеротические поражения проходят определенные стадии развития, различающиеся по микроскопическим особенностям строения, а также по присутствию и роли клеток, влияющих на прогрессию поражения (Струков и Серов, 1995). При этом стабильность АСБ, т.е. её склонность к разрыву и тромбообразованию с последующими клиническими проявлениями, может сильно зависеть от стадии или типа поражения. На сегодняшний день отсутствует полное понимание того, каким образом происходит развитие АСБ в сторону той или иной стадии, но несомненной является определяющая роль в этом процессе мигрирующих из кровеносного русла лейкоцитов, в первую очередь Мц/Мф (Libby et. al., 2002, 2012, 2013). С помощью выработки цитокинов и хемокинов, поглощения тканевого детрита и регуляции развития и разрушения тканей эти клетки в наибольшей степени участвуют в регуляции атерогенеза (Das et al., 2006; Hansson and Hermansson, 2011; Libby et. al., 2013). В последние годы показано присутствие в атеросклеротическом поражении как про-, так и антивоспалительных субпопуляций Мф М1 и М2, которые потенциально могут регулировать развитие поражения противоположным образом (Bouhlel et al., 2007; Khallou-Laschetetal et al., 2010; Wilson, 2010; Wolfs et al., 2011; Shaikh et al., 2012; Butcher and Galkina, 2012,). Однако, несмотря на появившиеся за последнее десятилетие работы по этой теме, окончательное представление о распределении этих популяций в АСБ, их функциях, участии в развитии поражения на разных стадиях и, следовательно, влиянии на их потенциальную стабильность или нестабильность ещё предстоит сформировать.
В связи с этим, наше исследование было направлено на проведение сравнительного анализа распределения субпопуляций Мф М1 и М2 и факторов, характеризующих их функциональную активность (про- и антивоспалительных цитокинов, а также ферментов, участвующих в реорганизации соединительнотканного матрикса) в различных типах атеросклеротических поражений сонных артерий человека и на изучение участия этих субпопуляций Мф в процессе дестабилизации АСБ.
Среди исследованных 163 фрагментов 27 АСБ сонных артерий человека, полученных при операции эндартерэктомии, было выявлено 5 основных типов выраженного поражения: атерома, фиброатерома, осложненное, фиброзное и фиброкальцинозное поражение – а также липидные пятна/полосы (начальная стадия развития АСБ) и неповрежденные участки интимы. Распространённой практикой является отнесение липидных пятен/полос и, в некоторой степени, атером к ранним стадиям поражения, фиброатером и осложнённых поражений – к нестабильным (наиболее склонным к разрыву), а фиброзных и фиброкальцинозных поражений – к стабильным. (Stger et al., 2012). Однако, существуют конкретные гистоморфометрические критерии стабильности или нестабильности поражений (Falk et al., 1995; Casscells et al., 2003; Lovett et al., 2005), в соответствии с которыми можно провести актуальный анализ степени стабилизации/дестабилизации бляшки. В связи с этим, в нашей работе при анализе полученных данных мы сопоставляли представленность различных иммуногистохимических маркеров или изученных факторов, характеризующих активность М1 и М2 Мф, как между различными стадиями развития АСБ, так и между группами стабильных и нестабильных поражений. Стоит, однако, заметить, что в ходе работы, в соответсвии с ожиданиями, подавляющее большинство фиброзных и фиброкальцинозных поражений было отнесено к стабильным, а осложненных – к нестабильным, которыми также являлось значительное количество атером и фиброатером. Поэтому в дальнейшем описании результатов мы придерживались сопоставления данных между различными типами поражений по H. Stary (1995, 2000). Отнесение части атером и фиброатером к стабильным, а части – к нестабильным поражениям может быть связано с тем, что эти стадии развития АСБ находятся в переходном состоянии, в котором решается исход стабильности/нестабильности поражения. Выход из такого критического состояния может быть основан, по-видимому, на соотношении факторов протеазно-антипротеазного баланса и цитокинового порофиля.
Известно, что в неизменённой артериальной стенке всегда присутствуют резидентные Мф, выполняющие гомеостатические функции, а в случае воспаления первыми реагирующие на изменившиеся условия (Libby et al., 2002). Действительно, в ходе нашей работы в неизменённой интиме были обнаружены лишь единичные Мц/Мф, представленные клетками, несущими маркеры CD14+, HAM56+ и CD206+. Проникновение в интиму модифицированных липопротеидов (модЛП) стимулирует местную воспалительную реакцию. Происходит интенсивная инфильтрация Мц и Т-Лц, что является начальной стадией развития атеросклеротического поражения (липидное пятно/полоса) (Libby et al., 2013). Предположительно, в этот момент может происходить поляризация процесса активации Мф и Т-Лц по про- или антивоспалительному пути (Butcher and Galkina, 2012). Эксперименты in vitro показывают, что М1 Мф необходимы для активного фагоцитоза модЛП и стимуляции воспалительной реакции (Wolfs et al., 2011), а М2 – для клиренса апоптотических клеток и секреции цитокинов и ферментов (Butcher and Galkina, 2012). Это позволяет предположить, что обе субпопуляции Мф могут принимать участие в инициации развития атеросклеротического поражения. У мышей до настоящего времени в ранних бляшках были обнаружены преимущественно М2 Мф (Khallou-Laschetetal et al., 2010). В противоположность этому у человека в нашей работе установлено, что интима липидных пятен/полос значительно инфильтрирована Мц и Мф, имеющими как про- (MCP1+-клетки), так и антивоспалительный иммунофенотип (CD206+- и CD163+-клетки). При этом CD206+ и CD163+ подтипы М2 Мф были представлены в равных долях, а суммарное количество Мф М2 в липидном пятне/полосе по сравнению с Мф М1 было в 2,3 раза больше. До разделения на субпопуляции эти клетки, по-видимому, также выявлялись за счет маркеров Мц или пенистых клеток. Окончательные выводы о распределении субпопуляций Мф на начальной стадии развития поражения ещё предстоит получить в дальнейших работах. Однако имеющиеся в работе результаты иммуногистохимического анализа совместно с данными ИФА позволяют уже сейчас предположить, что обе субпопуляции в сопоставимой степени принимают участие в инициации и развитии атеросклеротического поражения.
Распределение субпопуляций М1 и М2 внутри выраженного атеросклеротического поражения на данный момент изучено мало. Показано, что М1 Мф (МСР1+) солокализуются с пенистыми клетками (Bouhlel et al., 2007) и что Мф M2 (CD68+CD206+) располагаются дальше от липидного ядра, чем Мф М1 (CD68+CD206-), и менее интенсивно поглощают липиды (Chinetti-Gbaguidi et al., 2011). Это соответствует основным предположениям о потенциальной роли М1 и М2 Мф в атерогенезе. Например, показано, что Мф М1 активно фагоцитируют окисленные ЛПНП и секретируют ряд металлопротеаз (MMP1, 3 и 9) и провоспалительных цитокинов (IL-1, 6, 8, 12 и TNF-), вследствие чего, по мнению ряда авторов, могут участвовать в формировании атеронекротического ядра (Ley et al., 2011; Moore and Tabas, 2011; Murray and Wynn, 2011). Что касается Мф М2, то для них характерно участие в клиренсе апоптотирующих клеток, а также синтезе антивоспалительных (IL-4, 10, 13; CCL18, 22, 24) и других факторов, в частности TGF-. То есть действие М2 Мф направлено на стимулирующих ГМК и фибробластов к пролиферации и синтезу внеклеточного матрикса, что способствует образованию фиброзной ткани (Butcher and Galkina, 2012). Наши исследования подтверждают эти предположения.
