Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. Морфофункциональиая яичников в различные сроки антенатального и постнатального периодов 11
1.1 Гистофизиология яичников в антенатальном периоде 11
1.2 Гистофизиология яичников в постнаталыюм периоде 22
Глава II. Материалы и методы исследования 43
2.1 Общая характеристика экспериментальных животных 43
2.2 Экспериментальные модели хронических поражений печени 44
2.3 Методы исследования 47
2.3.1 Морфологические методы исследования яичников 47
2.3.2 Оценка генеративной функции яичника 48
2.3.3 Анализ тучноклеточной популяции яичника 57
2.3.4 Гистохимические методы исследования яичников экспериментальных животных 63
2.3.5 Оценка эндокринной функции яичника 65
2.3.6 Биологические методы - 66
2.3.7 Статистические методы исследования 66
Глава III. Результаты собственных исследований и их обсуждение 67
3.1 Морфологическая характеристика яичников потомства экспериментальных животных в разные сроки постнатального развития 67
3.1.1 Характеристнка весовых параметров яичников экспериментальных животных 67
3.1.2 Морфологический анализ яичников экспериментальных животных 74
3.1.3 Характеристика клеток полового гнезда яичников новорождённых крысят 76
3.1.4 Характеристика процесса фолликулогенеза 81
3.1.5 Характеристика процесса атрезии фолликулов 93
3.2 Биохимическая характеристика яичников потомства экспериментальных животных в разные сроки постнатального развития 96
3.2.1 Содержание холестерина и аскорбиновой кислоты в фолликулярных и интерстициальных клетках яичника экспериментальных животных 96
3.2.2 Оценка эндокринной функции яичников экспериментальных животных 102
3.3 Характеристика тучных клеток яичников экспериментальных животных 106
3.4.1 Метод ранжирования 114
3.5.1 Биологическая характеристика потомства экспериментальных животных 116
Глава IV. Заключение 119
Выводы 133
Приложение 134
Список использованной литературы
- Гистофизиология яичников в постнаталыюм периоде
- Морфологические методы исследования яичников
- Характеристнка весовых параметров яичников экспериментальных животных
- Содержание холестерина и аскорбиновой кислоты в фолликулярных и интерстициальных клетках яичника экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность исследования. Сложившаяся демографическая ситуация в России в настоящее время остается крайне неблагоприятной, поэтому сохранение и восстановление репродуктивного здоровья в современном мире является важнейшей медицинской и государственной задачей. В последние годы отмечается рост числа бесплодных браков, увеличение количества семейных пар, у которых происходило невынашивание беременности, а число врожденных аномалий, не имеет тенденции к уменьшению [Сидельникова В.М., 2007; Доклад ВОЗ «Врождённые пороки», 2010]. Одной из причин нарушения внутриутробного развития являются экстрагенитальные заболевания женщины, при этом в структуре заболеваний особое место занимает патология гепатобилиарной системы, в том числе хронические гепатиты [Подымова С.Д., 2004; Шехтман М.М., 2005]. Многочисленными работами сотрудников кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Челябинской государственной медицинской академии в условиях эксперимента было показано неблагоприятное влияние хронических заболеваний печени матери на морфофункциональное становление различных органов и систем потомства [Брюхин Г.В., 1991-2011; Михайлова Г.И., 1990; Грачев А.Ю., 1990; Бояков А.А., 1998; Евченко Е.В., 2004; Николина О.В., 2004; Пивень Г.В., 2004; Федосов А.А., 2002; Вторушина Е.В., 2008; Леонов Н.В., 2007; Барышева С.В., 2008; Ильиных М.А., 2009; Пашнина Е.Н., 2009; Солянникова Д.Р.; 2010, Романов А. С.; 2010, Смекалина О. Ю., 2011]. В месте с тем исследованиями Сизоненко М.Л. [2011] показано, что у самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза рождается потомство с нарушением мужской репродуктивной функции.
В связи с этим целью настоящего исследования явился анализ морфофункционального становления генеративной и эндокринной функции яичников потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза в различные сроки постнатального периода.
Для достижения поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи:
-
Изучить особенности морфофункционального становления яичников потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени.
-
Исследовать особенности фолликулогенеза яичников потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени различного генеза на разных стадиях постнатального развития.
-
Оценить структурно-функциональные особенности популяции тучных клеток яичника потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени в различные сроки постнатального периода.
-
Оценить эндокринную функцию яичников потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени на разных стадиях постнатального развития
-
Проанализировать биологические показатели второго поколения самок крыс с экспериментальным поражением печени различного генеза
Научная новизна. На адекватных экспериментальных моделях (D(+)-галактозамин и E.coli), воспроизводящих различные формы поражения печени у матери, впервые установлены общие особенности морфофункционального становления яичников потомства. Впервые показано изменение числа и апоптозной активности ооцитов полового гнезда под влиянием хронического поражения печени матери. Впервые выявлена закономерность фолликулогенеза потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени, заключающаяся в снижении в яичниках общего числа фолликулов и усилении их роста, овуляции и образования жёлтых тел. Впервые проведён анализ биологических показателей второго поколения самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени различного генеза.
Теоретическая и практическая значимость работы Исследование, проведённое нами, относится к фундаментальным. Результаты проведенных исследований углубляют и расширяют представление о физиологических механизмах, лежащих в основе нарушения становления репродуктивного здоровья потомства от матерей с экспериментальным поражением печени. Полученные результаты содержат новые сведения о влиянии хронических поражений гепатобилиарной системы у самок на процесс фолликулогенеза, клеточные элементы микроокружения, эндокринную функцию яичника.
Несмотря на условность экстраполяции экспериментальных данных на клинические ситуации, результаты исследований позволяют расценивать наличие патологии гепатобилиарной системы у матерей как фактор риска в отношении становления репродуктивной функции у потомства. Отсюда вытекает целесообразность организации диспансерного наблюдения за девочками, рождёнными от матерей, имеющих в анамнезе заболевания гепатобилиарной системы.
Результаты проведенного научного исследования используются в научно-исследовательской и учебной деятельности кафедры микробиологии ФБГОУ ВПО «Челябинский государственный университет» в курсе «Гистология человека», «Эмбриональное развитие человека. Нарушение внутриутробного развития», «Физиология человека и животных».
Положения, выносимые на защиту
-
Экспериментальная патология матери в виде хронического поражения гепатобилиарной системы является существенным фактором риска, оказывающим неблагоприятное влияние на антенатальное и постнатальное становление генеративной функции яичников потомства.
-
Экспериментальная патология гепатобилиарной системы у самок крыс вызывает изменение активности клеточного микроокружения яичников потомства.
-
Экспериментальная патология гепатобилиарной системы у самок крыс вызывает нарушение процесса фолликулогенеза в яичниках потомства.
-
Хроническое экспериментальное поражение печени самок крыс, моделируемое путем введения токсина E. сoli и D (+) - галактозамина, обусловливает нарушение эндокринной функции яичников потомства.
Апробация работы. Материалы диссертации были обсуждены на I (VIII итоговой) и II (IХ итоговой) международной научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2010, 2011); на VI Международной конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Троицк, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для изложения материалов докторских и кандидатских диссертаций.
Структура и объем диссертации: Основное содержание работы изложено на 200 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, 52 рисунков, из которых 27 микрофотографии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов исследования (глава II), результатов собственных исследований и их обсуждения (глава III), заключения (глава IV), приложения, выводов и списка использованной литературы, включающего 408 источников, в том числе 302 работы зарубежных авторов.
Гистофизиология яичников в постнаталыюм периоде
Общепризнано, что первичные половые клетки (ППК) имеют внегонадное происхождение [Everett, 1943; Mac-Natty, 1980]. В восьмидесятые годы в опытах на зародышах химерных мышей была обнаружена детерминация первичных половых клеток (5-е сутки развития) в области эпибласта [McLaren, 1983; 1985].
Путь, который ППК проходят от места своего образования к месту закладки гонады, начинается от основания аллантоиса, проходит через заднюю кишку и дорсальную брыжейку [Merchant-Larios, et al., 1981]. Важным свойством мигрирующих первичных половых клеток является их высокая митотическая активность [McCoen, et al., 1975].
На основе данных экспериментальных разработок было выдвинуто положение, согласно которому и половые клетки, и соматические элементы половых валиков оказывают индуктивное влияние на взаимное развитие [Merchant-Larios, 1976].
В развитии яичника выделяют несколько стадий. Начальная из них называется стадией индифферентной гонады и протекает идентично развитию семенника. Закладка яичников возникает в виде протяженного парного утолщения целомического эпителия на вентро-медиальных поверхностях первичных почек (у человека на 31-35-е сутки развития). Это утолщение получило название полового валика. После образования половых валиков происходит дезинтеграция канальцев мезонефроса, эпителиальные клетки канальцев мигрируют в закладки гонад и достаточно быстро заселяют их - происходит так называемая колонизация закладки гонады клетками канальцев первичной почки. У зародышей мыши процесс колонизации начинается на 11-е сутки развития [Byskov, et al., 1986].
Мигрировавшие в закладку гонады половые клетки продолжают (как и на пути своего следования к яичнику) активно пролиферировать. Для этого этапа развития характерна неполная цитотомия овогоний при митозе, в результате чего в гонаде создается половой синцитий («гнездо половых клеток»), который существует продолжительное время. В этот период развития яичник становится гистологически отличным от семенника; в последнем в это время уже формируются семенные тяжи.
«Гнездо» половых клеток является важной стадией в формировании зародышевых линий, оно консервативно у самок и самцов различных организмов, от насекомых до лягушек, кроликов и других позвоночных [Pepling М. Е. et al., 1999]. В каждом из этих организмов большинство ооцитов синхронно делятся с неполным цитокинезом с образованием кластера клеток, соединённых межклеточными мостиками [Gondos et al., 1971; Pepling M. E., 1998]. Однако, премейотические женские половые клетки насекомых, кролика, мыши, крысы, хомяка и человека все имеют межклеточные цитоплазматические мостики, характерные для гнезда [рассмотрено в Pepling М. Е. et al., 1999], демонстрируя, что эта структура важна для развития ооцита.
Потеря половых клеток в ходе разрушения «гнезда» очень важна. Возможно существует механизм контроля качества с помощью которого дефектные ядра теряются и здоровые ооциты предпочтительно заключаются в примордиальпые фолликулы. Используя различные методы резки и заливки, было установлено, что происходит потеря ооцитов путём апоптоза в масштабе между от одной трети до двух третей от числа всех оогоний в «гнезде» [Tilly J. L., 1996 ;Pepling M. E., 2001; Bristol-Gould S. K. et al, 2006]. Предполагается, что истощение ооцитов осуществляется, вероятно через действие белков семейства В-клеточной лимфомы/лейкемия-2 (Bcl-2) [Ratts V. S. et al., 1995; Rucker E. В. et al., 2000; Flaws J. A. et al., 2001; Greenfeld С R. et al., 2007]. Предложено несколько возможных причин селективной потери ооцитов в ходе разрушения «гнезда», включая генетические дефекты или нарушения половых клеток в образовании необходимых цитоплазматических органелл, включая митохондрии. В дополнение к мутациям в хромосомном геноме дефекты в количестве митохондрий или их геноме могут привести к апоптозу [Perez G. I. et al., 2000]. У мышей, митохондрии очень быстро размножаются в течение дня до начала разрушения «гнезда» и некоторые митохондрии могут быть обнаружены в межклеточных мостиках, соединяющих ядра сестринских яйцеклеток [Pepling М. Е., 2001]. Наконец, существование фолликулов с множеством ооцитов (MOFs) позволяет считать, что правильное разрушение «гнезда», выборочно освобождает яичник от дефектных ооцитов [Iguchi Т. et al., 1990; Iguchi Т. et al., 1991; Hahn К. L. et al., 2005; Kipp J. L. et al., 2007]. MOFs фолликулы содержат два или больше ооцитов без разделения базальной мембраны между ними. Так как эти фолликулы обнаруживаются даже на примордиальной стадии, вероятно, что они возникают в результате неполного разрушения цитоплазматических мостиков, связывающих ядра половых клеток в ходе разрушения. MOFs могут возникать в результате увеличения уровней эстрогена, миметиков эстрогена или пептидного гормона активина в ходе неонатального развития [Kipp J. L. et al., 2007]. У мышей и человека ооциты из этих фолликулов менее жизнеспособны и имеют на 30% меньший уровень фертилизации, чем их моноовулирующие аналоги [Iguchi Т. et al., 1991; Dandekar P. V. et al., 1988], что говорит о связи между корректным разрушением гнезда и качеством ооцита.
Факторы, продуцируемые ооцитом или соматическими клетками могут влиять на разрушение «гнезда». Многие из этих факторов влияют на начало разрушения «гнезда», среди которых наибольший интерес представляет белок синаптонемалыюго комплекса-1 (SCP1). Этот белок экспрессируется только в ооцитах и его экспрессия стремительно снижается в течение 24 часов после рождения, когда начинается разрушение «гнезда» у мышей. Более того, когда экспрессия SCP1 белка выключается, ооциты преждевременно достигают диплотены и начинается преждевременное разрушения «гнезда» в результате которого образуются здоровые примордиальных фолликулов [Paredes A. et al., 2005]. Интригующее объяснение этих данных подразумевает, что мейоз протекает не только одновременно с разрушением гнезда, но вызывает его.
Ряд других белков, в том числе Foxl2, Nobox и члены Notch сигнального пути и трансформирующий фактор роста (TGF-P) суперсемейства, могут повлиять на сроки разрушения «гнезда». Мутация гена Foxl2, который кодирует транскрипционный фактор, как правило, экспрессирующийся в клетках прегранулезы, связана с преждевременной недостаточностью яичников у мышей и людей [Crisponi L. et al., 2001; Uda M. et al, 2004]. В мышиной модели, нокаут Foxl2 снижает разрушение «гнезда» видимо посредством влияния на дифференцировку клеток гранулезы и укладку собственной базальной мембраны вокруг формирующихся фолликулов [Uda М. et al., 2004].
Nobox является ооцит-специфическим гомеобоксиым геном, который экспрессируется в «гнездах» половых клеток и ооцитах в примордиальных и растущих фолликулов [Suzumori N. et al., 2002]. Нокаутные модельные мыши здоровы при рождении с соответствующим образованием «гнезда» половых клеток. Тем не менее, разрушение «гнезда» значительно нарушено и многие половые клетки остаются в «гнездах» дольше, чем половые клетки у животных дикого типа [Rajkovic A. et al., 2004]. Развитие не просто задержано, так как ооциты мыши дегенерируют и никогда не образуют растущие фолликулы [Rajkovic A. et al., 2004]. Notch сигнальные пути трансмембранных белков также оказались необходимы при разрушении «гнезда». Компоненты путей экспрессируются половыми клетками в гнезде, а таюке окружающих пре-гранулёзных клетках [Trombly D. J. et al., 2009]. Когда подавляется сигнализация в ex vivo культуре яичников, ослабляется или задерживается разрушение «гнезда», и большее число половых клеток остаётся в «гнезде» по сравнению с интактными культивированными яичниками [ТготЫу D. J. et al., 2009]. На более позднем этапе, нарушение Notch сигналинга может привести к образованию MOFs [Hahn К. L. et al., 2005], вероятно, из-за неполного разрушения гнезда.
В дополнение к другим дефектам фертильності!, MOFs образуются также у мышей, когда вместе мутируют костный морфогенетический белок 15 (BMP 15) и ростовой фактор дифференцировки 9 (GDF9) [Yan С. et al., 2001]. У человека, мутации в обоих этих генах ассоциированны с синдромом истощения яичников [Dixit Н. et al., 2005, 2006]. Считается, что сигналинг фактора некроза опухоли а (TNF) необходим для стимуляции апоптоза ооцита, который сопровождает разрушение «гнёзд» ооцита и сборку фолликулов [Marcinkiewicz J. L. et al., 2002; Morrison L. J., 2002]. Wnt-4, экспрессирующийся в гонадах во время эмбрионального развития, по-видимому, играет роль в обеспечении выживания половых клеток. У Wnt-4 нокаутных животных присутствует нормальное число половых клетки, но после рождения, когда начинается разрушение гнезда, нокаутные животные формируют менее чем на 10% число здоровых половых клеток относительно животных дикого типа [Vainio S. et al., 1999]. Очень похожий фенотип наблюдается у мышей, у которых мутирует ооцит-специфический фактор транскрипции Figa. У этих мышей, число морфологически здоровых ооцитов не изменено, но ооциты все умирают во время разрушения гнезда. При этом не образуется примордиальных фолликулов, и ооциты не созревают даже до стадии образования белков zona pellucida [Soyal S. M. et al., 2000]. Многие из этих генов, вызывающих разрушение гнезда у мышей также имеют важное значение в организме человека.
Морфологические методы исследования яичников
Снаружи, кроме области ворот, яичник покрыт эпителием, который именуется покровным, поверхностным, зачатковым, или герминативным [Волкова О.В., 1983].
В дефинитивном яичнике топографически различимы две зоны -корковое и мозговое вещество. Корковое вещество занимает периферическую часть яичника и характеризуется наличием овариальных фолликулов. Мозговое вещество расположено в центре и от фолликулов свободно. В нем располагаются крупные органные сосуды, которые распадаются на более мелкие ветви, уходящие в корковое вещество. Стромальная часть коркового и мозгового вещества яичника является производным мезенхимы и представляет собой специализированную рыхлую волокнистую соединительную ткань [Волкова О.В., 1999].
С наступлением репродуктивного периода в женских половых железах устанавливается циклическое созревание фолликулов и половых клеток. В течение каждого цикла в рост вступает несколько фолликулов, хотя заканчивают его лишь немногие (у моноовулирующих видов, к числу которых принадлежит человек, - только один фолликул). На основании морфогенетических преобразований, которые претерпевают фолликулы в процессе развития, предложено несколько вариантов классификаций стадий фолликулогенеза. Согласно Международной гистологической номенклатуре в яичнике женщины определяются фолликулы на различных стадиях развития [Salha О, et al., 1998]: 1. Примордиальный (I стадия) [Faddy М., et al., 1995] — ооцит частично или полностью окружен уплощенными клетками гранулёзы, размер фолликула около 30—40 мкм. 2. Первичный (II стадия) [Faddy М., et al., 1995] — ооцит окружен одиночным слоем кубических клеток гранулёзы. 3. Ранний вторичный — неполный второй слой кубических клеток гранулёзы. 4. Вторичный (III стадия) [Faddy М., et al., 1995] — два полных слоя клеток гранулёзы, размер фолликула около 50 мкм. 5. Преантральный (1-й класс) [Faddy М., et al., 1995] — ооцит увеличен в объеме и окружен более чем двумя слоями гранулёзы без образования полости, размер фолликула около 100 мкм. 6. Антральный (2—8-й класс) [Faddy М., et al., 1995] — ооцит увеличен в объеме и окружен несколькими слоями клеток гранулёзы с образованием полости. Размер фолликула более 0,2 мм в диаметре.
Наиболее подробными классификациями являются классификация фолликулов яичника человека [Gougeon., et al., 1986] и классификация фолликулов [Pedersen Т., et al., 1969], разработанная на мышевидных грызунах. Согласно этим классификациям, фолликулы поздраделяются на 8 классов (типов, или стадий) по диаметру фолликула и числу гранулезных клеток на максимальном сечении фолликула.
По классификации Pedersen, Peters (1969), с которой наиболее часто работают экспериментаторы, 1-За типы фолликулов - так называемые малые, Зб-5а типы -средние фолликулы, 56-8 типы - большие фолликулы. Данная классификация основывается на двух морфометрических показателях - размерах фолликулов и численности фолликулярных эпителиальных клеток на максимальном сечении фолликула. Группа больших фолликулов объединяет как бесполостные (56 тип), так и полостные (начиная с 6-го типа) фолликулы. Будучи подробной, классификация Pedersen, Peters позволяет производить тщательный анализ фолликулогенеза, однако рамки ее использования ограничены видовыми различиями [Волкова О.В., 1990].
Фолликулогенез можно разделить на следующие стадии: 1) формирование пула растущих фолликулов; 2) базальный рост (рост до стадии антрального фолликула 4-го класса); 3) селекция и созревание доминантного фолликула. Зависимость первых двух этапов от гипофизарных гонадотропинов, преимущественно от FSH, является непрямой и скорее опосредована внутрияичниковыми факторами, и лишь последний этап напрямую регулируется гипофизом [Волкова О.В., 1999].
К концу первой недели постнаталыюй жизни у мышевидных грызунов примордиальные фолликулы уже окончательно сформированы и часть из них вступает в большой рост. Полагают, что пул примордиальных фолликулов гонады формируют те фолликулы, которые образовались в процессе морфогенеза яичника последними, так как фолликулы, сформированные одними из первых, немедленно вступают в рост и в ходе этого роста подвергаются ускоренной элиминации [Волкова О.В., 1999].
Факторы, определяющие начало роста и дифференцировки примордиальных фолликулов, до сих пор не определены, однако ряд авторов высказывают предположение о том, что это некий внутрияичпиковыи гормонально-независимый фактор, связанный с образованием межклеточных контактов и поддерживающий фолликулы в состоянии покоя. Культивирование отделенных друг от друга фолликулов в среде ведет к их росту и дифференцировке. Эти данные позволяют предположить, что потеря межклеточных контактов может
быть пусковым фактором начала дифференцировки. Данная теория получила название теории латеральной спецификации (lateral specification). Согласно данной гипотезе, в рост идут те фолликулы, которые потеряли боковой контакт с соседними фолликулами, и обычно рост фолликулов происходит по краю яичника, а также в районе недавно образовавшегося желтого тела. Эта гипотеза объясняет наблюдения, что при делеции фолликулов при старении увеличивается относительное число растущих фолликулов. Как один из кандидатов на роль этого фактора, отвечающего за потерю межклеточных контактов и начала дифференцировки, был предложен продукт экспрессии гена Notch7" один из вариантов которого был выделен из яичника мыши. О гормонально-независимом характере начала роста фолликулов также говорит тот факт, что он происходит в аваскулярной зоне [Baker S., et al., 1999]. Выдвинута гипотеза, согласно которой плотное расположение фолликулов в корковом веществе яичника поддерживает фолликулы в покое, в то время как область около мозгового вещества представляет окружение, которое способствует росту [Teresa К. W., et al., 2010]. Кроме того, один из вероятных механизмов отбора примордиальных фолликулов для вступления в стадию большого роста предложен гипотезой трофического градиента. Согласно этой гипотезе, фолликулы, находящиеся в наиболее хорошо кровоснабжаемых участках гонады, имеют больше шансов продолжить развитие по сравнению с теми фолликулами, которые располагаются в менее гемообеспеченных областях [Teresa К. W., et al., 2010].
Характеристнка весовых параметров яичников экспериментальных животных
Овуляция, выброс яйцеклетки из зрелого фолликула, является кульминацией процесса продукции яйцеклетки и очень важна для обеспечения выживания вида [Быков В.Л., 2001]. Биохимические и клеточные события, которые происходят в яичнике в период овуляции, такие как гиперемия, выброс цитокинов, миграция и накопление лейкоцитов, активация протеолитических ферментов и разрушение ткани, приводят к овуляции, которая по своим процессам сходна с воспалительной реакцией [Espey L.L., 1980; Espey L.L., 1994; Terranova P.F. et al., 1997]. Согласованные действия множества гормональных и клеточных компонентов переднего гипоталамуса гипофизарно-яичниковой оси управляют этим процессом [Richards J. et al., 1980; 1994]. EDN2 вызывает сокращение фолликулярных гладкомышечных клеток стимулиррующее фолликулярный разрыв [CheMyong Ко et al., 2006].
Только ограниченное число примордиальных фолликулов в яичниках млекопитающих растёт и дифференцируется, достигая стадии доминантного фолликула и впоследствии овулирует. 99% фолликулов в яичнике подвергаются атрезии на различных стадиях развития. В репродуктивном возрасте атрезия совместно с формированием доминантного фолликула является одним из проявлений физиологии овариальной функции и фолликулогенеза: в ходе роста фолликулы соревнуются за лидерство, и поступательное развитие продолжают только те из них, которые способны обеспечить оптимальное морфофункционалыюе состояние собственного гистиона. В течение жизни в яичниках человека прогрессивно сокращается содержание половых клеток. Сравнительно небольшой процент этой убыли связан с созреванием и овуляцией овоцитов в репродуктивном периоде, и значительно больший - с атрезией овариальных фолликулов и гибелью половых клеток, происходящими практически в течение всей жизни. Апоптоз — фундаментальный механизм фолликулярной атрезии и постовуляторного регресса у млекопитающих [Wood A.W.etal.,2001].
Гранулезные клетки - основной тип клеток, подвергающихся апоптозу в яичнике в исследованиях in vivo и in vitro [Chun S.-Y., 1998]. Атрезия может начаться на любой стадии развития фолликулов. Морфологические изменения соответствующие апоптозу были описаны в клетках гранулезы из атретических фолликулов крыс [Hughes F.M., 1991; Boone D.L., 1997]. Подобно большинству типов клеток [Wyllie А.Н., 1972; Payne СМ.,1995], апоптотические клетки гранулезы демонстрируют фрагментацию хроматина, вакуолизацию цитоплазмы, цитоплазматическое пузыреыие, конденсацию и фрагментацию цитоплазмы и ядра и сегрегацию ядрышек.
К. Kugu и соавт. [1998] идентифицировали в яичниках белки bcl, bax и р53. Семейство белков bcl включает некоторые важнейшие регуляторы апоптоза. Среди них bcl—2 и bcl-xl предотвращают апоптоз, в то время как bax и bcl-xS индуцируют іслеточную смерть. Изменение регуляции этого процесса может привести к снижению клеточной смерти и развитию неопроцесса. Важным регулятором развития фолликула и желтого тела является р53 [Thompson W.E. 2001; Zwain I.H., 2001]. Апоптоз клеток гранулезы связан с экспрессией р53 [Tilly K.I., 1995], который запускает процесс апоптоза только в гранулезных клетках зрелого преовуляторного фолликула [Amsterdam А., 1998].
Кроме того, апоптоз гранулезных клеток яичника контролируют ген Fas и его лиганд FasL, где Fas выступает в роли рецептора, a FasL стимулирует апоптоз при связывании с Fas [Matsubara II., 2004]. Fas-зависимый апоптоз может быть приведен в действие FasL овоцитов в преантральных фолликулах, а также овоцитов или соматических клеток в антральных фолликулах. У мышей с потерей Fas накапливаются фолликулы средних размеров или развиваются кисты яичников [Sakamaki К., 1997; Xu J.P., 1998]. Оксид азота подавляет FasL-зависимый апоптоз, вызывающий фолликулярную атрезию [Chen Q., 2005].
Некоторые факторы роста и гормоны, включая эстрогены, подавляют апоптоз в яичниках [Svanberg В., 2000]. TGF-bl индуцирует и поддерживает апоптоз клеток яичника [Christopher В., 2000; Marcinkiewicz J.L., 2002; Morrison L.J., 2002; Rodriguez G.C., 2002]. Инсулиноподобный фактор роста подавляет апоптоз клеток яичника [Lee Y.S., 1998]. Концентрация в фолликулярной жидкости IGF-I является решающим фактором в определении, какой из фолликулов станет зрелым, а какой подвергнется атрезии [Yu Y.S., 2004]. Известно, что основной фактор роста фибробласта (оФРФ) подавляет апоптоз так же эффективно, как гонадотропины в преовуляторных фолликулах [McGee Е., 1997].-ИЛ-6 стимулирует апоптоз гранулезных клеток. Среди всех цитокииов ИЛ-1 играет важнейшую роль регулятора дифференцировки фолликулов. В культуре преовуляторных фолликулов ИЛ-lb подавляет апоптоз [Chun S.-Y., 1995].
Недавно было показано, что при нарушениях в яичниках может реализовываться восстановление запаса ооцитов за счёт стволовых клеток [Tilly, Jonathan L. et al., 2009].
Таким образом, яичник является уникальным органом, в котором в течении жизни женщины происходит постоянная перестройка микроциркуляторного русла, компонентов внеклеточного матрикса, миграция лейкоцитов и тучных клеток, формирование и рост различных функциональных структур: малых, средних, больших и атретических фолликулов, жёлтых тел. На основании данных литературы можно заключить, что генеративная и эндокринная функция яичников регулируется сложным комплексом гуморальных факторов. Глава II. Материалы и методы исследования.
Общая характеристика экспериментальных животных. В эксперименте были использованы белые лабораторные крысы (самки) породы «Вистар». Всего было использовано 232 животных, из них 70 составили взрослые крысы самки, 162 крысят из 79 пометов в различные сроки постнатального онтогенеза (на 1-ые, 15-ые, 30-е, 45-е и 60-ые сутки). Сроки исследования согласуются с общепризнанным подразделением возрастных периодов у данной группы животных: 1-5 день (период новорожденности), 6-21 день (подсосный период), 22-50 день (период становления половой зрелости) и 60 день (период половой зрелости) [Заподнюк И.П. и др., 1983].
Исходя из поставленных задач данного исследования, все экспериментальные животные были разбиты на 3 группы.
В первую группу были выделены животные от интактных родителей (контрольная группа животных) - «Контроль» (61 животных из 26 пометов) (рис. 1). Во вторую группу вошли животные от матерей, сенсибилизированных супернатантом Е. coli (Опытная группа 1) - «ОГ1» (50 животных из 23 пометов). В третью группу выделены животные от самок крыс с Б(+)-галактозаминовым поражением печени (Опытная группа 2) - «ОГ2» (51 животных из 21 помета). Исследования с экспериментальными животными проводили с учетом суточных и сезонных колебаний. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с одинаковым пищевым рационом. Работа с экспериментальными животными, а также выведение их из эксперимента проводились в полном соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 742 13.11.84 МЗ СССР) и Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в эксперименте и для других научных целей (№123, 1986 г.)
Содержание холестерина и аскорбиновой кислоты в фолликулярных и интерстициальных клетках яичника экспериментальных животных
У интактных животных к 30-му дню относительное содержание фолликулов в яичнике увеличивается, затем к 45-му дню незначительно уменьшается, и достигает максимального значения к периоду половой зрелости. Сходная закономерность выявлена у животных обеих подопытных групп. У животных первой опытной группы, отмечается снижение относительного содержания фолликулов на 30-й день жизни по сравнению с контролем. У животных второй опытной группы, напротив, отмечается увеличение относительного содержания фолликулов на 45-й и 60-й день жизни по сравнению с контролем.
Анализ полученных результатов позволяет выявить связь увеличения суммарного числа фолликулов с увеличением атрезии и наоборот уменьшения процесса атрезии с уменьшением суммарного числа фолликулов. Данная закономерность вероятно обусловлена изменением активности про- и антиапоптических сигналов в фолликулах.
Содержание холестерина и аскорбиновой кислоты в фолликулярных и интерстициальных клетках яичника экспериментальных животных. Одной из важных функций яичника является эндокринная функция [Волкова О.В., 1999]. Все стероиды яичника, а также те, которые продуцируются надпочечниками и плацентой, производятся из холестерина [Марри Р., 1998]. Известно, что эндокринная функция во многом зависит от налаженной поставки и синтеза различных промежуточных звеньев в производстве половых стероидных гормонов [Leung С.К. et al., 2004]. Среди субстратов, участвующих в производстве этих гормонов, особое место занимают холестерин и аскорбиновая кислота [Гинтер, 1973; Ни et al., 2010]. Именно их содержание и доступность _ определяет уровень биосинтеза стероидных гормонов [Sugawara et al., 2007].
Показано, что концентрация аскорбиновой кислоты в фолликулярной жидкости варьирует в зависимости от размера фолликулов, функционального состояния и стадии астрального цикла [Khan F. A., et al., 2011]. Аскорбиновая кислота играет важную роль в сложной системе окислительно-восстановительных реакций, участвующих в преобразовании холестерина. Она отличается способностью легко отдавать электроны из диенольной группы лактонового кольца, поэтому вместе с ферри-ионом (Fe+3) является кофактором ряда гидроксилаз, осуществляющих гидроксилирование субстратов. Fe+3 переносит электроны аскорбата на молекулярный кислород (02) с образованием -реактивного супероксиданиона (#02), который в свою очередь прямо окисляет производные холестерола. Интенсивность эндогенного синтеза холестерина находится в некоторой зависимости от обеспеченности организма аскорбиновой кислотой. При достаточном уровне аскорбиновой кислоты в организме ускоряется синтез холестерина и нормализуется его обмен. Аскорбиновая кислота стабилизирует физиологическое равновесие между биосинтезом холестерина и использованием его в тканях [Марри Р., 1998; Ginter Е., 1975; Turley S.D., et al., 1976].
В яичниках холестерин может синтезироваться de novo из двууглеродных. предшественников; другим его источником служат липопротеиды низкой плотности крови. В обоих случаях он служит субстратом образования стероидных гормонов [Марри Р. 1998]. Считается, что практичесіш все клетки яичника обладают полным набором ферментов, необходимых для превращения холестерина в эстрадиол [Марри Р., 1998]. Однако в яичнике клетки разных типов содержат неодинаковое количество этих ферментов, и поэтому в отдельных участках органа преимущественно вырабатываются те или иные стероиды. Например, желтое тело в основном вырабатывает прогестерон и 17— гидроксипрогестерои, а клетки теки, и стромы превращают холестерин в андрогены — андростендион и тестостерон. Клетки гранулезы особенно активны в превращении андрогенов в эстрогены, и в качестве субстратов этого процесса используют андрогены, синтезируемые не только в них самих, но и в соседних клетках теки [Leung С.К. et al., 2004].
Хотя любая клетка яичника содержит, вероятно, полный набор ферментов, требующихся для образования эстрадиола из холестерина, количество отдельных ферментов и соответственно главные синтезируемые гормоны в клетках разного типа оказываются неодинаковыми. В результате эти клетки вырабатывают преимущественно прогестерон и 17-ОН-прогестерон, андрогены и эстрогены соответственно [Leung С.К. et al., 2004]. LH регулирует главным образом первый этап биосинтеза стероидных гормонов, а именно превращение холестерина в прегненолон, а также участвует в индукции ферментов, катализирующих последующие стадии этого процесса. FSH же регулирует конечный этап, т. е. ароматизацию андрогенов в эстрогены. Таким образом, LH и без FSH способен усиливать поток субстратов и образование андрогенов и/или прогестерона, a FSH без LH неэффективен, так как снижается количество субстратов для ароматизации [Leung С.К. et al., 2004].
При изучении содержания гранул аскорбиновой кислоты была выявлена следующая закономерность (рис. 43). У интактных животных наблюдается снижение содержания гранул аскорбиновой кислоты от 23,88±1,275 на 15-й день до 15,67±1,300 к 30-му дню и увеличение к 45-му дню (30,24±3,092). К 60-му дню, содержание гранул аскорбиновой кислоты увеличилось и составило 35,70±1Д84. У крысят первой и второй экспериментальных групп выявлена аналогичная закономерность. Показано, что на большинстве сроков исследования содержание гранул аскорбиновой кислоты у экспериментальных животных не изменено относительно контроля.
