Введение к работе
Актуальность проблемы
Несколько десятилетий назад исследователи стали обращать внимание на роль в этиологии бесплодия человека так называемого мужского фактора По сообщениям из различных источников, примерно в 30% случаев бесплодие супружеских пар обусловлено суб- или инфертильностью супруга. Сравнительный анализ многочисленных данных по показателям спермиологического обследования мужчин, выполненных в 23 странах, показал, что за последние 50 лет уменьшение количества сперматозоидов у населения Европы и Северной Америки составило примерно 50% и представляет собой глобальную проблему (Carlsen E., 1992; Swan et al., 2000). Было показано существенное уменьшение концентрации сперматозоидов (с 113 до 66 млн/мл) и объема эякулята (с 3,4 до 2,75 мл) в период с 1938 по 1990 г.г. Исследование Парижского банка спермы показало, что ежегодно концентрация сперматозоидов у доноров уменьшается на 2,6%, подвижность – на 0,3%, содержание морфологически нормальных сперматозоидов – на 0,7% (Auger J. et al., 1995). По данным Брагиной Е.Е., Абдумаликова Р.А. (2002) в Москве из 1000 мужчин около 10% имеют подвижность сперматозоидов, соответствующую нормативам ВОЗ (WHO, 1992, 2000). При этом около 30% всех случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, то есть бесплодию с невыясненной этиологией.
В информационном письме МЗ РФ от 11 апреля 2003 г. «Современные технологии в сохранении и восстановлении репродуктивной функции» приводятся данные о том, что, согласно данным эпидемиологических исследований, частота бесплодных пар колеблется от 8 до 15%, а в ряде регионов Российской Федерации имеет тенденцию к увеличению. Таким образом, проблема фертильности является одной из актуальных проблем гинекологии и андрологии.
Основным методом первичной диагностики мужского бесплодия является традиционный метод спермиологического обследования, позволяющий поставить предварительный диагноз и наметить пути дальнейшего обследования больных. Определение количества сперматозоидов, характеристика их подвижности и морфологических свойств дает общие представления об оплодотворяющей способности спермы (Menkveld R. et al., 2001). В последние годы предложены компьютерные методы анализа репродуктивной ценности параметров спермограммы (Гончаров Н.П. и соавт., 2006; Calamera J. et al., 1994; Kruger T. et al., 1995; Hofman G. et al., 1996). В случаях так называемого «идиопатического» нарушения фертильности инструкция ВОЗ (WHO, 1992, 2000) рекомендует проведение функциональных тестов, позволяющих выяснить механизмы аномалий сперматозоидов. Метод количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов человека позволяет выявлять первичный или вторичный характер нарушения фертильности, связь нарушения фертильности с генетическими аномалиями либо с действием экзогенных факторов. На основании ретроспективного анализа результатов электронно-микроскопических исследований сперматозоидов большой группы фертильных мужчин (Bartoov B. et al., 1994; Bacetti B. et al., 2002) получены количественные данные о том, какие аномалии сперматозоидов совместимы с фертильностью.
Имеются сведения о выделении вируса простого герпеса из материала спонтанно абортированных плодов человека и животных (Sifakis S. et al., 1998; Rappersberger K., 1999; Mukaiya R. et al., 2000; Spano L. et al., 2002; Moore D. et al., 2003), причем инфицирование эмбриона при спонтанных абортах может быть значимо выше частоты инфицирования матери, что позволяет думать о негативном влиянии на течение беременности каких-либо других факторов помимо генитального герпеса матери (Барановская Е.И. и соавт., 2004). О роли мужского фактора в аномальном течении беременности при генитальном герпесе опубликованы единичные работы. Морфология сперматозоидов была подробно описана в классических работах 70-х годов прошлого столетия (Fawcett D. et al., 1971; Fawcett D., 1975). Однако в последние годы появляются публикации, содержащие сведения о новых деталях структуры мужских половых клеток, не описанных ранее. Брагина Е.Е. (2001) обнаружила в цитоплазматической капле сперматозоидов структуры, идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса и предположила, что такие сперматозоиды могут содержать вирусную ДНК. Было высказано предположение о роли подобных атипичных сперматозоидов в развитии аномальной беременности человека. Однако до настоящего времени отсутствовали доказательства вирусной природы обнаруженных включений. Не была выяснена роль сперматозоидов, содержащих инородные включения, в развитии патологических процессов репродуктивной системы мужчин и женщин.
Цель работы: выявить ультраструктурные, иммунохимические и молекулярно-биологические изменения сперматозоидов при идиопатическом нарушении фертильности, а также доказать наличие внутриклеточного герпетического инфицирования мужских гамет при некоторых формах нарушения репродуктивного здоровья.
Задачи:
провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов у пациентов при различных видах патоспермии (астенозооспермия, тератозооспермия, глобулозооспермия);
провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с идиопатическим бесплодием, результаты традиционного спермиологического обследования которых соответствуют нормативным показателям;
установить природу инородных вирусоподобных включений в сперматозоидах морфологическими, вирусологическими и молекулярно-биологическими методами;
исследовать цитологические закономерности спермограммы пациентов, в эякуляте которых содержатся инфицированные вирусом сперматозоиды;
выявить сперматозоиды, инфицированные вирусом простого герпеса, в подвижной фракции эякулята;
провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов из эякулята пациентов, у которых обнаруживали внутригаметное герпетическое инфицирование;
определить частоту анеуплоидий хромосом 1, X и Y в половых клетках эякулята пациентов, у которых обнаруживали сперматозоиды, инфицированные вирусом простого герпеса;
изучить особенности сперматогенеза с помощью метода количественного анализа незрелых половых клеток эякулята у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами.
Научная новизна
Описан новый тип синдромной патоспермии, при котором выявлена следующая совокупность симптомов: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии, тотальное нарушение ультраструктуры центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка развития полученных с помощью ИКСИ (ICSI, интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов – intracytoplasmic sperm injection) эмбрионов на 2-3 сутки после оплодотворения.
Методом количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией выявлены множественные аномалии микротрубочек аксонемы, не носящие синдромного характера.
Методом количественного электронно-микроскопического анализа в эякуляте пациента с идиопатическим бесплодием выявлены множественные аномалии постакросомальной зоны головки сперматозоидов.
Впервые инородные вирусоподобные включения, содержащиеся в сперматозоидах и идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены в кариоплазме ядер сперматозоидов, в перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки. Установлено, что в подвижных сперматозоидах могут выявляться белки всех стадий жизненного цикла вируса простого герпеса (сверхранние, ранние и поздние белки), либо белки одной или двух стадий жизненного цикла.
Впервые методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии. Методом гибридизации in situ установлено, что вирусная ДНК может присутствовать в сперматозоидах как при выявлении белков всех стадий жизненного цикла вируса (, и ), так и при выявлении белков одной или двух стадий, то есть при абортивной форме инфекции. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии позволяет сделать заключение о возможности оплодотворения инфицированными сперматозоидами.
Методом количественного анализа незрелых половых клеток эякулята выявлен выраженный цитопатический эффект, обусловленный присутствием сперматозоидов, содержащих вирус простого герпеса. Изменение количественного состава незрелых половых клеток свидетельствует о том, что действие вируса простого герпеса на сперматогенез осуществляется на уровне клеток сперматогенного эпителия.
Впервые показано, что сперматозоиды с включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены у 68% пациентов, у жен которых в анамнезе отмечено невынашивание беременности. В группе пациентов, у которых вирус простого герпеса выявлен вирусологическими методами, но в анамнезе жен не имелось прерывания беременности, сперматозоиды с вирусными капсидами не обнаружены.
Практическая значимость работы
В эякуляте пациентов с идиопатическим бесплодием с помощью метода количественного электронно-микроскопического исследования половых клеток обнаружены нарушения структуры сперматозоидов, не выявляемые с помощью традиционного спермиологического обследования (повышенное содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным «незрелым» хроматином, аномалии акросомы и постакросомальной зоны).
Показано, что причиной идиопатического бесплодия и неудач применения метода репродуктивной технологии могут быть аномалии строения центриоли сперматозоидов.
Установлена герпетическая природа инородных вирусоподобных включений в сперматозоидах человека. Показано, что подвижные сперматозоиды нормальной морфологии могут содержать ДНК вируса простого герпеса, что создает риск вертикальной передачи вируса.
Изменение количественного состава незрелых половых клеток у пациентов, в эякуляте которых выявлены сперматозоиды, содержащие вирус простого герпеса, свидетельствует о том, что селекция поврежденных при инфицировании клеток происходит на стадии сперматогенеза. Показатели традиционного спермиологического обследования не позволяют сделать заключение о наличии внутригаметного герпетического инфицирования.
Показана взаимосвязь наличия у пациентов сперматозоидов с инородными вирусоподобными включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, и анамнеза жен этих пациентов, у которых регистрировались беременности, не закончившиеся родами.
Полученные данные дают основание рекомендовать проведение количественного электронно-микроскопического исследования и вирусологического исследования половых клеток мужчин при патоспермии, при идиопатическом бесплодии, при использовании репродуктивных технологий и при аномалиях беременности в анамнезе у жен пациентов.
Положения, выносимые на защиту
1. Метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов может применяться для выявления ультраструктурных нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с патоспермией и для оценки функционального состояния сперматозоидов у пациентов с идиопатическим бесплодием и у пациентов, в анамнезе жен которых имеется спонтанное прерывание беременности. Применение электронно-микроскопического исследования позволяет выяснить механизмы фертилизационной неэффективности сперматозоидов, идентифицировать генетически обусловленные и приобретенные формы патоспермии у пациентов с патоспермией и при идиопатическом нарушении фертильности.
2. У пациентов с идиопатическим бесплодием с помощью количественного электронно-микроскопического анализа выявлено повышенное содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным «незрелым» хроматином и аномалии акросомы и постакросомальной зоны.
3. Выявлен новый тип синдромной патоспермии, при котором имеется следующая совокупность симптомов: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии, тотальное нарушение ультраструктуры центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка на 2-3 сутки развития эмбрионов, полученных с помощью интрацитоплазматиченской инъекции сперматозоидов.
4. Вирусоподобные инородные включения, содержащиеся в сперматозоидах и идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены в кариоплазме ядер сперматозоидов, в перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки.
5. В подвижных сперматозоидах нормальной морфологии выявлена ДНК вируса простого герпеса. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах с нормальной морфологией позволяет сделать заключение о возможности оплодотворения инфицированными сперматозоидами.
6. Изменение количественного состава незрелых половых клеток, отсутствие анеуплоидии и отсутствие выраженных изменений в параметрах традиционного спермиологического обследования и в параметрах количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов позволяет сделать заключение о том, что на стадии сперматогенеза происходит селекция поврежденных при инфицировании клеток. В то же время не все инфицированные клетки подвергаются селекции, так как с помощью гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена во фракции подвижных сперматозоидов с нормальной морфологией.
Внедрение
Результаты исследования сперматозоидов человека при патоспермии и идиопатическом нарушении фертильности; исследование сперматозоидов человека при наличии включений, идентифицированных как капсиды вируса простого герпеса, а также результаты их влияния на фертильность используются в работе лаборатории генетики нарушения репродукции ГУ Медико-генетического научного центра РАМН, а также при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы
Основные результаты исследования были представлены на: 4-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), втором конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (г. Москва, 2003 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – ХХI век» (г. Саратов, 2004 г.), I-ой Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва 2004 г.), 3-ем, 4-ом и 5-ом Российских научных форумах «Мужское здоровье и долголетие» (г. Москва, 2005, 2006, 2007 г.г.), международной конференции по андрологии (г. Дагомыс, 2006 г.), 1-ом региональном научном форуме «Мать и дитя» (г. Казань, 2007 г.), 4-ой конференции с международным участием «Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.), XVII ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (г. Казань, 2007 г.), I международной конференции «Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций» (г. Москва, 2008 г). Результаты работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной биологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (май, 2008 г.), межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (сентябрь, 2008 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 32 работы, из них 8 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 2 методические рекомендации.
Структура и объем диссертации
![Характеристика системы иммунитета и овариальной функции у женщин с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс]](/i/i/4499/207873.png "Характеристика системы иммунитета и овариальной функции у женщин с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс] Айзикович Ирина Валентиновна")
