Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Селезенка как периферический орган иммуногенеза в норме и при иммуномодуляционных воздействиях 11
1.1.1. Иммуноархитектоника маргинальной зоны селезенки 13
1.1.2 Иммуноархитектоника белой пульпы селезенки 14
1.1.2.1 Иммуноморфология В-клеточного субкомпартмента белой пульпы (лимфоидных узелков) 15
1.1.2.2 Стромальпо-паренхиматозные взаимоотношения в В-клеточном субкомпартменте селезенки 16
1.1.2.3 Иммуноморфология Т-зон селезенки 19
1.1.2.4 Недавние тимусные иммигранты и их роль в поддержании иммунного статуса организма 22
1.1.2.5 Стромальпо-паренхиматозные взаимоотношения в Т-клеточном субкомпартменте селезенки и происхождение стромальных клеток 26
1.1.3 Иммуноморфология красной пульпы селезенки 35
1.1.3.1 Стромально-лимфоидпые взаимоотношения в красной пульпе и маргинальной зоне 36
1.2 Микроархитектоника селезенки при иммуномодулирущих воздействиях 40
1.3 Стресс и его иммуномодулирующее действие 44
1.3.1 Влияние острого стресса на микроструктуру селезенки 47
1.3.2 Влияние хронического стресса на иммуноархитектонику селезенки 51
Глава 2. Материал и методы исследования 62
Глава 3. Результаты исследования 68
3.1. Влияние разных видов хронического стресса на массу тела и органометрические параметры экспериментальных животных 68
3.2. Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика селезенки крыс в норме на разных этапах раннего постнатального онтогенеза 71
3.3. Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика селезенки при хроническом действии психологического стрессора 86
3.4 Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика селезенки крыс при хроническом действии физического стрессора 98
3.5 Количественный иммуногистохимический анализ селезенки неполовозрелых крыс разных возрастных групп при хроническом стрессе 108
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 119
Выводы 129
Список литературы 131
- Стромальпо-паренхиматозные взаимоотношения в Т-клеточном субкомпартменте селезенки и происхождение стромальных клеток
- Влияние острого стресса на микроструктуру селезенки
- Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика селезенки крыс в норме на разных этапах раннего постнатального онтогенеза
- Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика селезенки крыс при хроническом действии физического стрессора
Введение к работе
Актуальность исследования Стресс запускает в организме цепь интегрированных реакций нервной, эндокринной и иммунной систем, обусловленных активацией гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и симпато-адреналовой осей, приводящих к сложным иммуномодуляционным изменениям, которые особенно легко провоцируются в раннем постнатальном онтогенезе из-за морфо-функциональной незрелости лимфоидных органов, отсутствия устойчивых связей между ними, их компартментами и субкомпартментами, иммуноцитами и их микроокружением При этом стресс-ассоциированная иммуномодуляция является многофакторным явлением, и различные стрессоры и характеристики стресса могут оказывать различное действие на иммунный ответ, что необходимо учитывать при прогнозировании диапазона, амплитуды и направленности стресс-ассоциированных иммуномодуляционных сдвигов в растущем организме (М Р Сапин и Д.Б Никитюк, 2000, ИЛ Акмасв, 2003; НЛ akeuchi et al, 2001; К.В Koh et al., 2006).
Селезенка является крупнейшим лимфоидным органом в организме человека и млекопитающих, вносящим весомый вклад в развитие и поддержание клеточного и гуморального иммунного ответа, врожденного и приобретенною иммунитета, количественный и качественный состав иммуноцитов крови, лимфы и других лимфоидных органов (Л.А Прасолова и др, 2004, M.C.Karlsson et al, 2004; R.E.Meb»us et al., 2004; P.Balogh et al., 2004) Ее развитие в раннем постнатальном онтогенезе сопровождается взаимодействием и установлением связей между гемопоэтическими и стромальными клеточными популяциями многочисленных микроанаюмических зон на территории органа Лимфодеструктивное, лимфодегенеративное и лимфопролиферативное действие стресса способно изменить эти взаимоотношения и привести к продолжительному нарушению иммунного ответа (Y.X Fu et al., 1999; L. Dommguez-Gerpe et al., 2001; J.I.EIlyard et al, 2005, E.Satoh et al, 2006). Однако до сих пор не достигнуто полного понимания природы стромальных клеток селезенки, их происхождения, закономерностей распределения по субкомпартментам органа и механизмов влияния на лимфоидные клетки при стрессе не определена природа фолликулярных
дендритных клеток, существуют разногласия в понимании происхождения и дифференцировки дендритных интердигитирующих клеток, их взаимодействия с Т-клеточными популяциями и тд, что связано с недостатком исследований лимфоидной и стромапьной архитектоники органов иммуногенеза, особенно в детском возрасте, и затрудняет понимание закономерностей становления эффективного иммунного ответа и иммуномодуляционных процессов в раннем постнатальном онтогенезе (M.de la Mata et al., 2001; G. Martinez del Hoyo et al., 2002; M.Svensson et al., 2004; L.Alos et al., 2005; J.Diao et al., 2006, T.Kaneko et al, 2006, H.Karsunky et al., 2006).
Основным проявлением стресс-ассоциированных иммуносуппрессивных сдвигов в иммунных органах, в частности в селезенке как наиболее компартментализованном среди них, является гипоцеллюлярность лимфоидной ткани, среди причин которой указывают нарушение трафика иммуноцитов (как притока, так и оттока), избыточную гибель, заторможенную пролиферацию и нарушение сигнальных взаимодействий При этом было неоднократно продемонстрировано, что по мере старения организма механизмы постстрессовой иммуномодуляции претерпевают определенную динамику, однако в раннем постнатальном онтогенезе она остается мало изученной (К А.Гарунова и др., 2004; М.Ю.Капитонова и др., 2006; Н Aviles et al., 2004; V.P.Makarenkova et al., 2006, D.Yin et al., 2006; K.C. Zheng et al., 2007)
Ввиду выше изложенного, мы провели изучение действия различных видов хронического стресса на иммунный статус организма экспериментальных животных на уровне периферического звена иммунной системы и его крупнейшего органа -селезенки - на ранних этапах постнатального онтогенеза с использованием методов количественной иммуногистохимии
Цель исследования. Целью настоящего исследования является выявление закономерностей адаптации селезенки при хроническом действии стресса в раннем постнатальном онтогенезе
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи
Охарактеризовать возрастные иммуномодуляционные сдвши в селезенке в раннем постнатальном онтогенезе
Изучить динамику лимфоидных и стромальных клеточных популяций различных компартментов селезенки при хроническом действии физических и психологических стрессоров
3 Определить механизмы постстрессовых иммуномодуляционных сдвигов на
уровне периферического звена иммунной системы растущего организма
Научная новизна исследования Впервые с применением количественного иммуноцитохимического анализа выявлены иммуномодуляционные изменения в селезенке неполовозрелых крыс различных возрастных групп при хроническом стрессе, вызванном различными по природе стрессорами (физическими и психологическими) и определены их диапазон и амплитуда
Теоретическое значение работы заключается в выяснении механизмов иммуносуппрессивных сдвигов на уровне периферического звена иммуногенеза с учетом их возрастной специфичности в раннем постнатальном онтогенезе
Практическая значимость работы заключается в выделении критериев оценки глубины стресс-ассоциированной иммуносупрессии на уровне крупнейшего периферического органа иммунной системы - селезенки - для использования их при разработке новых терапевтических стратегий профилактики и лечения иммунодефицитных состояний
Внедрение в практику полученные научные данные используются в учебном процессе на кафедре анатомии человека и кафедре иммунологии и аллергологии ВолГМУ
Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации докладывались на VII конгрессе международной ассоциации морфологов, Казань, 16 сентября 2004 года, на юбилейной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», посвященной 10-летию Российской академии естесствознания, г Москва, 5-6 декабря 2005 г, на конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы
медицины и биологии», Дубай, ОАЭ, 13-20 октября 2006 г, на конференции, посвященной 70-летию Тверской государственной медицинской академии и 100-летию со дня рождения основателя кафедры анатомии человека, проф И С Кудрина, Тверь, сентябрь, 2006, на III конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», 1-8 октября 2006 г, Лутраки (Греция), на заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов, март, 2007
Основные положения, выносимые на защиту.
Постстрессовая динамика клеточных популяций иммуноцитов в различных компартментах селезенки растущего организма имеет возрастную зависимость и определяется видом действующего стрессора
Стресс-ассоциированные иммуномодуляционные сдвиги в селезенке экспериментальных животных в раннем постнатальном онтогенезе имеют как гемопоэтическое, так и стромальное происхождение, в соотношениях, опосредованных онтогенетически
Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, излагающего современные представления о гистофизиологии селезенки как периферического органа иммуногенеза и об иммуномодулирующем действии стресса, и части II, содержащей 3 главы с описанием материалов и методов исследования, его результатов, обсуждения полученных данных и выводов Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 55 рисунками, среди них 45 -микрофотографии гистологических препаратов Библиографический указатель содержит 240 источников, в том числе 23 отечественных и 217 зарубежных
Стромальпо-паренхиматозные взаимоотношения в Т-клеточном субкомпартменте селезенки и происхождение стромальных клеток
В Т-зонах селезенки важнейшим стромальным клеточным элементом являются дендритные клетки [257, 171]. Дендритные клетки представляют собой самые эффективные АПК, они являются единственным видом клеток, способным запустить первичный иммунный ответ. Они используют определенные наборы рецепторов для идентификации «своего» и «чужого», а также обнаруживают «опасные» сигналы от микробных частиц, некротизирующихся и злокачественных клеток. На различных стадиях своего жизненного цикла дендритные клетки играют ключевую роль в поддержании периферической толерантности по отношению к аутоантигенам и инициировании эффективного иммунного ответа [171, 200, 201]. Хотя в последние годы наше понимание биологии дендритных клеток значительно улучшилось, точной характеристики различных субпопуляций дендритных клеток, особенно в плане их фенотипа и межлинейных взаимоотношений, до сих пор не составлено [40,124].
Дендритные клетки присутствуют в интерстициальных пространствах и в периферических органах, включая селезенку, кровь, кожу, печень, но, исключая особые иммунопривилепірованньїе органы, защищенные гистогематическими барьерами, такие как мозг или яички [163]. Хорошо известно, что фенотип дендритных клеток может меняться в зависимости от тканевого происхождения. Более поздние исследования продемонстрировали гетерогенность дендритных клеток в пределах одного органа [235, 202]. Частично эта гетерогенность может быть объяснена существованием дендритных клеток на разных стадиях созревания. Однако, уже сегодня ясно, что не все клетки являются представителями одной клеточной линии, а могут происходить из различных гематогенных предшественников. Например, дендритные клетки крови человека относятся по меньшей мере к двум популяциям: одна экспресснрует CD 11с, а другая - рецептор к IL-3-альфа (CD123) [198].
Дендритные клетки селезенки несут маркеры: CD 11с, 0X6, ОХ62 и бывают двух типов: I и И. Большинство клеток I типа экспрессируют CD11с, имеют неправильный профиль, типичные цитоплазматические отростки, их среди дендритных клеток подавляющее большинство. Большинство клеток II типа экспрессируют ОХ62, имеют мелкий овальный профиль, немного тонких коротких отростков, иногда они обнаруживаются при прохождении через сосудистую стенку. Чаще обнаруживаются взаимодействия между лимфоцитами и дендритными клетками I типа. Таким образом, дендритные клетки представляют собой гетерогенные популяции различного фенотипа, морфологии и дифференцировочных антигенов [124].
Важнейшим маркером дендритных интердигитирующих клеток является ОХ-62 - иммуноглобулин G1, монокл опальное антитело, выработанное против вуалевых (дендритных) клеток лимфы. Иммуногистохимическое окрашивание показало, что ОХ-62 антитела метят не только классические дендритные клетки, и не все дендритные клетки оказываются помеченными ими. В лимфоидных тканях окрашивание коррелировало с содержанием дендритных клеток, в то время как в коже ГКГ класса II клетки были ОХ-62-отрицательными, а другие клетки, с фенотипом CD3+ и дендритной морфологией были резко ОХ-62+. Вероятно ОХ-62 антитела могут быть связаны с дендритными клетками и гамма-дельта Т-клетками. ОХ-62 антитела могут использоваться для выявления клеток дендритной морфологии в различных лимфоидных и нелимфоидпых тканях, а также для выявления гамма-дельта Т-лимфоцитов (CD3+). В селезенке ОХ62 клетки расположены в Т-зонах (вокруг центральных артериол), а также рассеяны по красной пульпе, немного в маргинальной зоне и по периферии белой пульпы. В красной пульпе клетки округлые и ярче окрашены, в белой пульпе - слабее окрашены, контуры нечеткие [58].
Две субпопуляции дендритных клеток были идентифицированы у млекопитающих на основе экспрессии CD8alpha: CD8alpha(+) лимфоидного происхождения и CD8alpha(-) мнелоидного происхождения. Именно CD8alpha(+), а не CD8alpha(-) дендритные клетки селезенки происходили от лимфоидного предшественника CD4+(HII3K), не имеющего мнелоидного реконституционного потенциала. Хотя CD8alpha(-) дендритные клетки описаны были как CD4 (-), однако позднее было показано, что около 70% из них CD4(+). CD4(-) CD8alpha(-), и CD4(+) CD8alpha(-) дендритные клетки имеют сходный фенотип и потенциал стимулировать Т-клетки, хотя последние имеют более высокую эндоцитозную способность. Эксперименты по реконституции дендритных клеток после облучения показали, что и CD8alpha(-), и CD8aIpha(+) дендритные клетки происходят от СБ4(низк)+ предшественника. Таким образом, приведенное исследование опровергает концепцию о происхождении этих видов дендритных клеток от миелоидных и лимфоидных источников соответственно. Вероятно, либо обе популяция происходят от одного независимого нелимфоидного немиелоидного источника, либо CD8alpha(-) дендритные клетки происходят от мнелоидного прдшественника в популяции С04(низк), однако обе эти теории должны быть проверены на клоналыюм уровне. Авторы склоняются к тому, что оба вида дендритных клеток селезенки происходят от одного лимфоидного предшественника [154]. Этого же мнения придерживаются другие исследователи [155], показавшие, что дендритные клетки селезенки могут происходить из одной популяции предшественников, а именно: CD8alpha-дендритные клетки могут приобретать фенотип CD8alpha+ в ходе дифференцировки с усилением экспрессии CD8alpha, DEC-205, и CD24 и параллельным снижением дифференцировки CDllb, F4/80, and CD4. Таким образом, по мнению авторов, CD8alpha+ дендритные клетки происходят из CD8alpha- дендритных клеток; и CD8alpha-, и CD8alpha+ дендритные клетки представляют собой различные стадии дифференцировки или зрелости одной и той же популяции клеток, а именно: CD8alpha+ дендритные клетки представляют собой последнюю стадию дифференцировки дендритных клеток, играющую важную роль в индукции Т-клеточного ответа благодаря своему антиген-презентирующему потенциалу, способности кросс-примирования и секреции большого количества ключевых для иммунного ответа цитокинов, таких как ИФГ и 11-12 [155].
Результаты, полученные этими исследователями, согласуются с данными авторов, предпринявших детальное исследование дендритных клеток селезенки мыши [163]. Показано, что в ней содержатся CD4+, С08альфа+, и С04-/С08альфа- дендритные клетки в соотношении 2:1:1. [240, 162]. Анализ 70 поверхностных и цитоплазменных антигенов выявил различную экспрессию антигенов у этих трех подгрупп дендритных клеток. Примечательно, что CD 103 (мышиный аналог крысиного маркера 0X62) специфически экспрессировались С08альфа-иммунореактивными дендритными клетками. Все типы дендритных клеток присутствовали в Т-зонах, а также в маргинальной зоне селезенки, и обладали сходной миграционной способностью в коллагеновых решетках [240, 122]. Таким образом, С08альфа+ дендритные клетки были очень слабыми стимуляторами или активированных аллогенных CD8+ Т клеток [204,240, 162], даже при наличии высоких показателей соотношения стимуляторов и респондентов, хотя этот недостаток мог быть преодолен при наличии оптимального соотношения дендритных клеток и Т-лимфоцитов. С08альфа-или С08альфа+ дендритные клетки презентировали аллоантигены с одинаковой эффективностью для лизиса цитотоксическими Т-лимфоцитами, и скорость оборота их пептидных комплексов ГКГ I класса была одинаковой. С08-альфа+ дендритные клетки не обеспечивают активации Т-клеток in vitro [138]. In vivo, СЭ8альфа+ дендритные клетки способны индуцировать противовирусный иммунный ответ, однако они в несколько раз менее эффективны, чем С08-альфа-негативные дендритные клетки. Интересно, что С08альфа- дендритные клетки более эффективны в презентировании растворимых антигенов CD4+ Т клеткам, в то время как С08альфа дендритные клетки превосходят по своей способности кросс-презентации растворимых и клеточно-ассоциированных антигенов. Неспособность СЭ8альфа+ дендритных клеток стимулировать CD8+ Т клетки ограничена до определенных ситуаций in vitro, в которых отсутствуют усиливающие сигналы, которые присутствуют при взаимодействиях in vivo между С08альфа+ дендритными клетками и CD8+ Т клетками [163].
Итак, первоначальные исследования показали, что С08альфа+ дендритные клетки в селезенке мышей могут играть роль в обеспечении толерантности Т-клеток. Последующие исследования продемонстрировали, что, действительно, у этой популяции дендритных клеток существенная способность примировать Т-клетки отсутствует [138]. Однако отсутствие у них ингибирующего эффекта по отношению к пролиферации Т-клеток, которым обладают другие популяции дендритных клеток, и нормальный уровень пролиферации Т-клеток, которые они обеспечивают в трансгенной Т-клеточной системе, доказывают, что С08альфа+ дендритные клетки не являются супрессирующими по отношению к Т-клеточной активации, а способны стимулировать Т-клеточный ответ [163].
CD8 альфа4" дендритные клетки - главные продуценты IL-12, и некоторые последние работы подчеркивают наличие ТЫ-клеточной стимулирующей активности у CD8+ разновидности дендритных клеток [1531.
Установлено, что у мыши дендритные клетки тимуса и 60% дендритных клеток селезенки имеют лимфоидный фенотип, а именно CD8(+) ОЕС-205(высок) Мас-І(низк), в то время как 40% дендритных клеток селезенки имеют миелоидный фенотип, а именно: CD8(-) DEC-205(HII3K) Mac-1 (высок), причем лимфоидные клетки экспрессируют LFA-1 [40].
Несколько иная информация получена с помощью комбинации методов иммуногпстохимии и проточной цитометрии о дендритных клетках селезенки крыс, которые представлены в сравнении с их аналогами в костном мозге. В селезенке крысы от 19% до 48% (в среднем 27%) дендритных клеток экспрессируют С08-альфа. Кроме того, 41-59% (в среднем 52%) дендритных клеток селезенки ОХ62+. Миелоидные дендритные клетки, происходящие из костного мозга, являются негативными по CD8a и ОХ62. По крайней мере часть дендритных клеток селезенки являются одновременно СЭ8альфа+ и ОХ62+. При этом С08а(-)дендритные клетки в селезенке более эффективны в запуске иммунного ответа, чем С08альфа+ клетки, и инициированный ими первичный иммунный ответ более мощный, чем у С08а+клеток [71].
Относительно происхождения дендритных клеток селезенки в литературе сохраняются и другие представления разных авторов. Так было показано, что моноциты способны дифференцироваться в дендритные клетки под действием ГМ-КСФ и 11-4, сначала они достигают в своей дифференцировке уровня незрелых дендритных клеток, которые обладают высокой активностью в захвате антигена, его процессировании, однако имеющие низкую активность в выработке 11-12 и в стимулировании Т-клеток.
Влияние острого стресса на микроструктуру селезенки
На смену представлений об иммуносупрессивном действии стресса пришло понимание того, что острый стресс сопровождается целым рядом изменений в лимфоидных органах, характеризующих усиление иммунного ответа, по меньшей мере в некоторых его проявлениях [12, 26, 114]. Ряд исследований посвящено оценке влияния острого хирургического стресса на иммунную систему. Хирургическое вмешательство вызывает серьезную иммуносупрессию и нарушение функционирования всей системы иммунных органов. Изменение сосудисто-стромального комплекса приводит к изменениям сосудистого эндотелия и популяции клеток-предшественников. Нарушаются метаболические основы транспортных и синтетических процессов в эндотелии. Резко снижается уровень пролиферации у клеток-предшественников лимфоцитов, в то время как функция Т-супрессоров усиливается. Десинхроннзация изменений активности ферментов в сосудах селезенки и лимфоидных образований может расцениваться как показатель дезинтеграции иммунной системы при остром хирургическом стрессе [35, 73].
Стресс вызывает нарушение трафика лимфоцитов, в частности задержку их в костном мозге. В селезенке при этом снижается число CD4+, CD8+, CD20+ лимфоцитов, что предполагает нарушение как клеточного, так и гуморального иммунного ответа [90].
После острого комбинированного психо-эмоционального стресса (иммобилизация с электростимуляцией кожи в течение 1 ч.) изучены изменения клеточного состава и цитоархитектоники различных функционально активных зон селезенки на мазках крови и гистологических срезах селезенки крыс Wistar. На фоне уменьшения числа малых лимфоцитов в ПАЛВ выявляется увеличение числа клеток с признаками деструкции по сравнению с данными контрольных групп животных (от единичных клеток на препаратах у животных контрольных групп до 7,7% и 1,5%, у крыс экспериментальных групп, предрасположенных и устойчивых к эмоциональному стрессу соответственно). Доля Т-лимфоцитов на единице площади в ПАЛВ селезенки у крыс, предрасположенных и устойчивых к стрессу, через 1 ч. после эмоционального стресса снижалась в 1,6 и 1,2 раза соответственно по сравнению с данными контрольных групп [7]. Эти исследования перекликаются с другими по изучению морфологических характеристик селезенки у серых крыс контрастного поведения (агрессивных и ручных) по отношению к человеку. Показано, что по массе тела, абсолютной и относительной массе селезенки, по диаметру лимфоидных узелков интактные ручные крысы значимо превосходят агрессивных. Гуморальный иммунный ответ на введение эритроцитов барана у ручных крыс значимо ниже, чем у агрессивных. Рестрикционный стресс при 4-часовом воздействии стимулирует образование антителообразующих клеток в селезенке и увеличивает различия в гуморальном иммунном ответе между крысами контрастного поведения. У агрессивных крыс при стрессе значимо увеличиваются диаметры лимфоидных узелков и герминативных центров, у ручных - ширина маргинальной зоны. Впервые полученные данные представляют собой описание различий в морфофункциональных показателях активности селезенки в ответ на рестрикционный стресс у животных разного поведения [23].
В то время как острый стресс нарушает Т-клеточный ответ, умеренная физическая нагрузка может оказывать благоприятное воздействие на иммунную функцию. В эксперименте крысы Wistar разделены на 4 группы: нетренированные, нетренированные + стресс (60 мин в стеклянном пенале), тренированные (бег в течение 8 недель), тренированные + стресс. Исследование показало, что острый стресс высоко достоверно повышает концентрацию кортикостерона у всех крыс, кроме тренированных. У нетренированных крыс при стрессе повышался апоптозный индекс лимфоцитов, снижался уровень конканавалин А-индуцированной пролиферации лимфоцитов в тимусе и лимфатических узлах, повышалось число лимфоцитов в селезенке, а у тренированных эти изменения отсутствовали. Таким образом, острый стресс связан с нарушением функции Т-лимфоцитов, в то время как умеренная физическая нагрузка ослабляет эффект стресса посредством механизма, связанного с активацией ГГНО и повышением толерантности лейкоцитов [140].
В целом зрелые CD3+ лимфоциты в периферических органах иммуногенеза менее подвержены действию стресса (гибели апоптозом), чем незрелые клетки иммунной системы, такие, например, как корковые тимоциты. Вместе с тем и в периферических лимфоидных органах, в частности, в селезенке, лимфоциты гибнут при стрессе апоптозом. Подверженность апоптозу связана с экспрессией bcl-2, которая выше у спленоцитов, чем у тимоцитов. Однако не только экспрессия bcl-2 определяет стресс-ассоциированный уровень апоптоза спленоцитов. Например, он одинаков у NK- и ТКР+ клеток, но CD3+ клетки более резистентны к апоптозу, чем NK-клетки, что предполагает участие других механизмов в формировании резистентности к апоптозу [210].
Другая ситуация наблюдается в различных органах по чувствительности к КРФ. При иммобилизационном стрессе число клеток крови, содержащих рецепторы к кортикотропин-рилизинг-фактору (CRF-R1) резко увеличивается в селезенке (в 8 раз), снижается в тимусе и практически не изменяется в лимфатических узлах [196]. Острый физический стресс (принудительный бег) вызывал у самок мышей наряду с резким повышением уровня кортикостероидов значительное снижение в периферических иммунных органах доли и общего числа CD3+ и CD4+CD8- лимфоцитов. Одновременно с этим доля нулевых клеток увеличивалась сразу после стресса, a CD 19+ В-лимфоцитов - через 24 часа после него, при этом общее число этих клеток не изменялось. Таким образом, острый стресс благодаря выбросу кортикостероидов приводил к снижению доли и общего числа Т-лимфоцитов в периферических иммунных органах, что не может не иметь клинического значения у спортсменов [194]. К сожалению, авторы не расшифровывают механизмов описанного изменения клеточной динамики иммуноцитов у экспериментальных животных.
Острый 2-часовой иммобилизационный стресс повышает концентрацию не только кортикостерона, но и свободного цитозольного кальция, а также усиливает способность конканавалина А - Т-клеточного митогена - интенсифицировать пролиферацию Т-лимфоцитов, но не способность липополисахарида (В-клеточного митогена) увеличивать пролиферацию В-лимфоцитов. Это усиление пролиферации связано с увеличением концентрации кальция, и оно блокировалось верапамилом (блокатором кальциевых каналов). Данное исследование является одним из немногих, в которых проводилось изучение возможных путей постстрессовой иммунокоррекции [205].
Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика селезенки крыс в норме на разных этапах раннего постнатального онтогенеза
На следующем этапе исследования - оценке микроструктуры селезенки на гистологических препаратах, окрашенных рутинными методами, отмечены возрастные и стресс-ассоциированные изменения, свидетельствующие о выраженных иммуномодуляционных сдвигах в организме на уровне периферического звена органов иммунной защиты, связанных с видом стрессорного воздействия и зависящих от исходного возраста экспериментальных животных. В младшей возрастной группе, исходный возраст животных в которой соответствовал грудному периоду, селезенка контрольных особей оставалась морфологически незрелой: с очагами миелопоэза в красной пульпе, с небольшим объемом белой пульпы, представленной, главным образом, ПАЛВ, преимущественно мелкими и средними, и формирующимися лимфоидными узелками, окруженными ободками маргинальной зоны с недостаточно четкими границами (рис.4).
Иммуногистохимическое окрашивание на белок S100, выявляющее фолликулярные дендритные клетки (ФДК) [38], показало наличие большого количества формирующихся лимфоидных фолликулов (рис.5), содержащих рыхлую мелкопетлистую иммунореактивнуїо сеть. При окрашивании серийных срезов селезенки на CD20, выявляющем зрелые В-лимфоциты, видно гомогенное заполнение этой сети иммунореактивными клетками, а при окрашивании на ОХ-62, маркер дендритных клеток (рис.6), выявлялась строма ПАЛВ, заполняемая Т-лимфоцитами с фенотипом CD3+ (маркер зрелых Т-клеток), CD4+ (маркер Т-хелперов и некоторой части макрофагов и дендритных клеток), CD8+ (маркер Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов, NK-клеток и части дендритных клеток) (рис.7), CD90+ (маркер НТИ). При этом обращало на себя внимание, что в то время как ОХ-62 иммунореактивные клетки располагались преимущественно в наружной зоне ПАЛВ (рис.6), так же как и CD90-позитивные НТИ, в то время как С08+клетки локализовались в большей степени во внутренней зоне ПАЛВ (рис.7), что согласуется с данными других исследователей о том, что большая часть дендритных клеток в селезенке крыс являются клетками нелимфоидного происхождения [154]. Окрашивание на CD45RC, выявляющее В-лимфоциты, Т-супрессоры и часть Т-хелперов, показало наличие нешироких маргинальных зон вокруг ПАЛВ и формирующихся лимфоидных узелков; последние окрашивались наиболее интенсивно. В ПАЛВ иммунореактивные клетки были единичными.
Окрашивание на PCNA показало, что в данной возрастной подгруппе достаточно интенсивно протекают пролиферативные процессы в белой пульпе, причем в В-клеточных субкомпартментах более интенсивно, чем В-клеточных. Окрашивание на каспазу-3 показало, что доля гибнущих апоптозом клеток невелика в обоих субкомпартментах в данный возрастной период. Также мало было содержание С068-иммунореактивных клеток в белой пульпе, в то время как красная пульпа содержала их в большом количестве. В целом доля CD8+ иммунореактивных клеток в селезенке у данной возрастной группы была выше, чем доля СО20+клеток, аналогично число ОХ-62-иммунореактивных клеток выше, чем С08+клеток, что соответствует уровню развития Т- и В-клеточных субкомпартментов в данный возрастной период. Вместе с тем, окрашивание на CD20 и S100 позволило выявить более раннее становление В-клеточного субкомпартмента у крыс в раннем постнаталыюм онтогенезе, чем это было известно ранее из исследований, выполненных без применения иммуногистохимических методов окраски.
В средней возрастной группе, исходный возраст которой соответствовал периоду перехода на самостоятельное питание, объем белой пульпы значительно возрастал: увеличивался диаметр ПАЛВ за счет появления крупных лимфоидных влагалищ, в разрастающихся лимфоидных фолликулах появлялись центры размножения (рис.8). Окрашивание на белок S100 выявило резкое увеличение объема лимфоидных узелков, стромальный каркас которых эти клетки образовывают (рнс.9, 10). Соответственно большая плотность расположения СО20+клеток (рис.П) и С045ЯС+клеток (рис.12) отмечалась в этих лимфоидных фолликулах. CD45RC-mieTKH образовывали более широкие ободки маргинальных зон вокруг ПАЛВ и лимфоидных узелков по сравнению с младшей возрастной группой (рис. 12). При окрашивании на ОХ-62 даже на качественном уровне было заметно увеличение доли иммунореактивных клеток в ПАЛВ (рис.13), где они тянулись прерывистыми рядами вдоль артерий белой пульпы. Здесь же несколько возрастало число СОЗ+клеток, представляющих собой популяцию зрелых Т-лимфоцитов (рис.14), СО90-иммунореактивных клеток и существенно больше - Т-супрессоров, выявляемых окраской на CD8. Доля пролиферирующих клеток при окраске на PCNA (рис. 15) и гибнущих апоптозом клеток (рис. 16) в описываемый возрастной период заметно не изменялась.
В старшей возрастной группе белая пульпа достигала наибольшего объема, она четко отграничивалась от маргинальной зоны, а маргинальная зоны - от окружающей красной пульпы, в которой происходило угасание миелопоэза (рис.17). В ПАЛВ дифференцировались внутренная и наружная зона, а среди лимфоидных узелков появлялось все больше вторичных. В последних появлялась очень плотная сеть из иммунореактивных клеток при окрашивании на белок S100 (рис. 18). Возрастал объем маргинальной зоны, которая, как показало окрашивание на CD20 (рис.19) и CD45RC (рис.20), становилась крупнейшим В-клеточным компартментом. Окрашивание на ОХ-62 продемонстрировало продолжающееся увеличение доли иммунореактивных клеток в ПАЛВ, соответственно ему в последних увеличивалась доля СО90-иммунореактивных клеток (рис.21), СОЗ+клеток (рис.22) и С08+клеток (рис.23); последние начинали образовывать некрупные конгломераты. Так же, как и в средней возрастной подгруппе С068-клетки (зрелые макрофаги) практически отсутствовали в белой пульпе, в то время как красная пульпа была практически нафарширована ими (рис.24). Как и в предыдущей возрастной группе, доля пролиферирующих (рис.25) и гибнущих апоптозом клеток изменялась мало. При этом по сравнению со средней возрастной группой относительно несколько меньше
PCNA-иммунореактивных клеток отмечалось в Т-клеточных субкомпартментах и несколько больше - в В-клеточных. Таким образом, проведенное иммуногистохимическое изучение распределения различных популяций лимфоидных и стромальных клеток белой и красной пульпы селезенки уже на качественном уровне выявило очень динамичное развитие Т- и В-клеточных компартментов в изучаемые возрастные периоды раннего постнаталыюго онтогенеза и отчетливую возрастную динамику их клеточных популяций: различных субпопуляций Т-лимфоцитов (зрелых Т-клеток, недавних тимусных иммигрантов, супрессоров) с параллельным нарастанием количества дендритных клеток в ПАЛВ, CD20+ иммунореактивных В-клеток и белок SlOO-позитивных фолликулярных дендритных клеток. Неожиданным было обнаружение значительного количества лимфоидных фолликулов с центрами размножения уже в 20-дневном возрасте, как показало окрашивание на CD45RC, CD20 и белок S100, а также огромного количества зрелых макрофагов в красной пульпе в возрасте, соответствующем периоду грудного вскармливания. Естественно было предположить, что продолжающее столь динамично развитие селезенки, особенно ее белой пульпы, в раннем постнатальном онтогенезе найдет свое отражение в закономерностях формирования иммуномодуляционных сдвигов в органе при хроническом действии стрессоров, изучению которых посвящен следующий раздел настоящего исследования.
Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика селезенки крыс при хроническом действии физического стрессора
Хроническое действие стрессора преимущественно физической природы (водной иммерсии) на иммуноархитектонику селезенки существенно отличалось от влияния чисто психологического стрессора.
В младшей возрастной группе он вызывал дезорганизацию белой пульпы, распад и исчезновение лимфоидных узелков, сокращение объема и деструктуризацию маргинальной зоны и ПАЛВ (рис. 43). Особенно заметно этой было на препаратах, окрашенных на белок S100 (рис.43), CD45RC и CD20. Тем не менее при окраске на ОХ-62 иммунореактивная строма ПАЛВ во многих случаях сохранялась (рис.44), несмотря на резкое снижение в них Т-клеточных субпопуляций, выявляемых окраской на CD8 (рис.45), CD90 и CD3. Даже на качественном уровне имелась возможность отметить снижение уровня пролиферации лимфондных клеток как в Т-, так и в В-зонах, а также усиления уровня апоптоза в обоих субкомпартментах.
В средней возрастной группе изменения микроархитектоники иммунодепрессивного характера были еще более драматичными (рис.46). Как показало окрашивание на белок S100 (рис.47), CD20 и CD45RC, практически не оставалось интактных лимфондных узелков, отмечались дезорганизация и распад их иммунореактивной стромы, исчезновение центров размножения на фоне резкого усиления лнмфофагоцитоза в уцелевших лимфондных узелках (рис.48,49,50,51). Имело место сокращение Т-клеточного субкомпартмента: выраженная лимфоидная деплеция в них, резкое усиление лнмфофагоцитоза не только в лимфондных узелках, но и в ПАЛВ, определяемые при окраске на CD90, CD3 и CD8. Еще большее по сравнению с младшей возрастной группой имело место снижение PCNA-иммунореактивных клеток и повышение каспаза-3-иммунореактивных клеток как в Т-, так и в В-зонах белой пульпы.
В старшей возрастной группе изменения иммуноархитектонике были сравнимы с таковыми в средней возрастной группе, причем по некоторым параметрам изменения были более, а по некоторым - менее выраженными, чем в более младших возрастных группах. Имело место резкое сужение маргинальной зоны как вокруг ПАЛВ, так и вокруг лимфондных узелков до полного ее локального исчезновения (рис.52). Герминативные центры в лимфондных узелках не определялись, сами они уменьшались в числе и размерах, накапливали наибольшее количество макрофагов с неокрашенной цитоплазмой, захватившей большое количество апоптозных телец. При этом явления лнмфофагоцитоза были так же широко распространены в ПАЛВ, в которых уровень лимфоидной деплеции достигал максилыюго значения, как показали различные имлгуногистохимические реакции, включая окрашивание на CD45RC (рис.53), CD90 (рис.54) и CD8 (рис.55), показавшее наличие в опустошенных ПАЛВ лишь единичных иммунореактивных клеток. В связи со столь резким усилением лимфофагоцитоза максимального значения достигало повышение доли иммунореактивных клеток при окраске на CD68, выявившем многочисленные иммунопозитивные клетки в ПАЛВ (рис.56).
Таким образом, при хроническом стрессе в селезенке отмечались структурные и иммуногистохимические изменения, указывающие на замедление развития и достижения функциональной зрелости органа при действии психологического стрессора, а также дегенерация и деструкция лимфоидной ткани селезенки при физическом стрессе, диапазон и выраженность которых были предопределены исходным возрастом животного. К изменениям, свидетельствующим об иммуносупрессивном характере хронического стресса, относились уменьшение объема белой пульпы и ширины маргинальной зоны, разрушение лимфоидных узелков и исчезновение в них герминативных центров, дезорганизация ПАЛВ, появление в лимфоидных узелках и ПАЛВ множества макрофагов с неокрашенной цитоплазмой, содержащей многочисленные апоптозные тельца, что свидетельствовало об усилении гибели спленоцитов апоптозом.
Окрашивание на различные субпопуляции Т-клеток (CD3, CD8, CD90, CD45RC), В-клеток (CD20, CD45RC), стромальных клеток (белок S100, CD68, ОХ-62), а также маркеры пролиферации апоптоза выявило уже на качественном уровне отчетливые возрастные преференции иммуносупрессивных сдвигов на уровне периферического звена иммунной системы, но для более точной их характеристики потребовалось провести количественное иммуногистохиимическое исследование иммуноархитектоники селезенки в норме и при хроническом действии различных стрессоров.
![Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тимуса при различных видах хронического стресса на ранних этапах постнатального онтогенеза [Электронный ресурс]](/i/i/4435/180136.png "Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тимуса при различных видах хронического стресса на ранних этапах постнатального онтогенеза [Электронный ресурс] Федорова Ольга Валентиновна")
