Введение к работе
Актуальность темы
Более 100 лет прошло со дня первой успешной сквозной пересадки роговицы, выполненной Э. Цирмом, однако и в настоящее время наибольшее распространение в области трансплантологии остается за кератопластикой (Плескова А.В., Хватова А.В., 2002). Высокая потребность в кератопластике приводит во всем мире к возрастанию потребности в пластическом материале и в совершенствовании методов его консервации (Каспаров А.А., Магден Ю., 2001; Heck E., Krachmer J.H., Mannis M.J. Holland E.J., 2005). В связи с возросшим риском опасных инфекций и повышенных требований к качеству трансплантационного материала необходимо полноценное его обследование, требующее дополнительных затрат времени, что, в свою очередь, вызывает необходимость кратковременной консервации с гарантией сохранения жизнеспособности трансплантата (Сурков А.А., 2003).
Как только в трансплантационной хирургии возросли требования к пересаживаемому материалу, возникла необходимость в создании и развитии службы заготовки и консервации донорских тканей. Огромный вклад в создание сегодняшних глазных банков во всем мире внес академик В.П. Филатов. Он создал и возглавил первую специализированную лабораторию консервации тканей при Одесском научно-исследовательском Институте глазных болезней. Им в 1934 году было предложено донорское глазное яблоко хранить в стеклянном сосуде при температуре +2-+4С.
Существует множество методов консервации роговицы, однако не все они нашли широкое распространение. Один из методов, который продолжают использовать и в настоящее время, заключается в обезвоживании роговичных трансплантатов над силикагелем (Волков В.В., Шиляев В.Г., 1976; Гольфельд Н.Г., 1976). Метод прост и позволяет длительно сохранять трансплантационный материал, однако консервированная роговица лишена жизнеспособности.
Предлагались использовать в качестве консервантов различные жидкие среды. Офтальмологам Мак Кери и Кауфман (1974) удалось создать среду, названную в их честь, которая позволила надежно консервировать роговицу на срок до 96 часов. В последующем появились ее производные с более длительным сроком хранения: Chondroitin Sulphate (Kaufman H.E., 1984), K-sol (Lindstrom R.L., 1990), Dexol (Lindstrom R.L., 1990), Optisol (Williams K.A., Coster D.J., 1993), среда Борзенка-Мороз (Борзенок С.А., Мороз З.И., Комах Ю.А. и др., 2002). Технические достижения к настоящему времени позволили предложить такие методы консервации роговицы как криоконсервация (-196С) в жидком азоте с использованием различных крио-протекторов (Дронов М.М., 1987; Williams K.A., Muehlberg S.M., Lewis R.F., CosterD.J., 1995), гипербарическая оксигенация при гипотермии (Линник Л.Ф., Подопригора Р.Н., 1976), в вакууме (Канюков В.Н., Подопригора Р.Н., 2006) в том числе контейнеры с наноструктурированным углерод содержащим покрытием (Мусина А.Д., 2006)
До настоящего времени не существует единого мнения относительно наилучшего способа сохранения роговицы человека. Значительное количество существующих методик консервации роговицы свидетельствует об отсутствии совершенных технологий. Следует также отметить недостаточные морфологические обоснования предложенных методик в аспекте изучения диапазона изменчивости ткане- и органоспецифичности консервируемых объектов. Все это стимулирует дальнейший поиск в этом направлении.
Учитывая положительные результаты консервации донорской роговицы путем лиофилизации с последующим прозрачным приживлением послойных трансплантатов (Бордюгова Г.Г., 1980; Илатовская Л.В., 1980), мы сочли целесообразным провести исследования по разработке метода консервации роговицы в вакууме при гипотермии.
Цель исследования: морфофункциональное обоснование возможности использования трупных донорских роговиц, консервируемых в условиях вакуума при гипотермии, для выполнения сквозных и послойных кератопластик.
Задачи:
1. Изучить на светооптическом и ультраструктурном уровнях морфофункциональную характеристику трупных донорских роговиц, консервируемых в условиях вакуума при гипотермии.
2. Определить оптимальные сроки вакуумной консервации донорских роговиц.
3. Провести экспериментально-гистологические исследования биологических свойств трансплантатов (диапазона их гисто- и органотипической реорганизации) в условии культивирования донорского материала по методу Ф.М. Лазаренко.
4. Обосновать возможность применения предложенного способа консервации трупных донорских роговиц в условиях вакуума при гипотермии в клинике для выполнения сквозных и послойных кератопластик.
Научная новизна
Впервые экспериментально-гистологически, включая ультраструктурный и иммуноцитохимический анализ, выявлены структурно-функциональные изменения роговицы, консервированной в вакууме при гипотермии, определен уровень апоптоза в материале, предназначенном для трансплантации в аспекте прогнозирования исходов операций по трансплантации донорских роговиц, консервированных различными способами.
Впервые изучены имплантаты консервированной роговицы (в вакууме при гипотермии) для получения результатов цитофизиологической характеристики пересаживаемых структур, их потенциальных репаративных и индуцирующих возможностей, в условиях культивирования по методу Ф.М. Лазаренко (1959).
Практическая значимость
Разработан альтернативный способ консервации роговицы в условиях вакуума при гипотермии. Исходя из полученных данных о высоких пластических свойствах консервированной роговицы, предлагается использовать для этих целей вакуумную установку, которая эргономична, легка в обращении, экономически выгодна. Возможность хранения роговицы с сохранением ее биопластических свойств позволяет иметь достаточные запасы качественного донорского материала.
Использование для трансплантации качественного донорского материала обеспечивает благополучный исход операции, уменьшает риск послеоперационных осложнений, гарантирует успешное приживление трансплантата.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Структурно-функциональная оценка донорской роговицы, консервированной в вакууме (3-10 сутки) показывает сохранность фенотипических свойств трансплантата, коллагеновых фибрилл, что свидетельствует об устойчивости (толерантности) соединительнотканных структур роговицы к данным условиям консервации.
2. При консервации роговицы наблюдаются явления угнетенного синтеза генов белков (bcl-2, р53) и изменения в соотношении их экспрессии, что свидетельствует о нарушениях клеточных циклов, как эпителиоцитов, так и фибробластов.
3. Культивирование фрагментов роговицы, консервированной в вакууме, по методу Ф.М. Лазаренко (1959) показало морфологические признаки, характеризующие механические, прочностные ее характеристики, активизацию клеток фибробластического ряда, что свидетельствует о возможности ремоделирования, которое будет инициировать процессы репаративного гистогенеза соединительной ткани.
4. В своей совокупности полученные результаты обосновывают целесообразность использования роговицы, консервированной в вакууме для послойной кератопластики.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «ОрГМА», кафедре медико-биологической техники ГОУ ВПО «ОГУ».
Полученные данные структурно-функциональной характеристики донорской роговицы, консервированной в вакууме, служат теоретическим обоснованием использования данной роговицы для послойной кератопластики в условиях офтальмохирургических отделений и клиник города.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены и обсуждены на Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза (актуальные вопросы морфогенеза и регенерации в офтальмохирургии) (Оренбург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии» (Чебоксары, 2007); VII Западно – Сибирская межрегиональная научно – практическая конференция «Новое в офтальмологии» (Новосибирск, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Высокие технологии в офтальмологии» (Краснодар, 2008); III Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2008); Международной научно-практической конференции «Современные технологии лечения заболеваний переднего и заднего сегментов глаза» (Уфа, 2008); Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008); Российской научно-практической конференции «Новые технологии микрохирургии глаза (офтальмопатология детского возраста)» (Оренбург, 2008); IV Межрегиональной научно-практической конференции «Метрология и инженерное дело в медико-биологической практике» (Оренбург, 2009); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чиения – 2009» (Москва, 2009), Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы офтальмологии» (Уфа, 2009), Российский общенациональный офтальмологический форум МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 2009), VI съезд анатомов, гистологов и эмбриологов России (Саратов, 2009), Всероссийская научная конференция с международным участием «Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия в XXI веке» (Оренбург, 2009).
По теме диссертации опубликовано 17 научных работ из них 4 в центральной печати рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 30 рисунками, 2 таблицами. Список литературы содержит 220 источников, в том числе 101 иностранных. Диссертация изложена на русском языке.
