Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современные представления о методах консервации роговицы для осуществления кератопластики 9
1.1 Классификация методов трансплантации, основных методов консервации роговицы и оценки ее жизнеспособности 9
1.2. Информативность различных методов оценки жизнеспособности роговицы 14
1.3. Преимущества и недостатки основных методов консервации донорской роговицы 21
Глава 2 Материал и методы исследования 28
2.1 Общая характеристика объекта исследований 28
2.2 Консервация роговицы 28
2.3 Культивирование по Ф.М. Лазаренко 31
2.4 Послойная кератопластика 33
2.5 Светооптическое исследование 35
2.6 Электронно-микроскопическое исследование 35
2.7 Иммуноцитохимическое исследование 36
Глава 3 Результаты собственных исследований 37
3.1 Светооптическая и ультраструктурная характеристика донорских роговиц, консервированных в условиях вакуума 37
3.2 Экспериментально-гистологические исследования биологических свойств роговичных трансплантатов в условиях культивирования in vivo по методу Ф. М. Лазаренко 58
3.3 О возможности применения донорских роговиц, консервированных в условиях вакуума, для целей офтальмохирургии 71
Глава 4 Обсуждение полученных результатов 75
Выводы 85
Список литературы 87
- Информативность различных методов оценки жизнеспособности роговицы
- Преимущества и недостатки основных методов консервации донорской роговицы
- Культивирование по Ф.М. Лазаренко
- Экспериментально-гистологические исследования биологических свойств роговичных трансплантатов в условиях культивирования in vivo по методу Ф. М. Лазаренко
Введение к работе
Более 100 лет прошло со дня первой успешной сквозной пересадки роговицы, выполненной Э. Цирмом, однако и в настоящее время наибольшее распространение в области трансплантологии остается за кератопластикой (Плескова А.В., Хватова А.В., 2002). Высокая потребность в кератопластике приводит во всем мире к возрастанию потребности в пластическом материале и в совершенствовании методов его консервации (Каспаров А.А., Магден Ю., 2001; Heck Е., Krachmer J.H., Mannis M.J. Holland E.J., 2005). В связи с возросшим риском опасных инфекций и повышенных требований к качеству трансплантационного материала необходимо полноценное его обследование, требующее дополнительных затрат времени, что, в свою очередь, вызывает необходимость кратковременной консервации с гарантией сохранения жизнеспособности трансплантата (Сурков А.А., 2003).
Как только в трансплантационной хирургии возросли требования к пересаживаемому материалу, возникла необходимость в создании и развитии службы заготовки и консервации донорских тканей. Огромный вклад в создание сегодняшних глазных банков во всем мире внес академик В.П. Филатов. Он создал и возглавил первую специализированную лабораторию консервации тканей при Одесском научно-исследовательском Институте глазных болезней. Им в 1934 году было предложено донорское глазное яблоко хранить в стеклянном сосуде при температуре +2-+4°С.
Существует множество методов консервации роговицы, однако не все они нашли широкое распространение. Один из методов, который продолжают использовать и в настоящее время, заключается в обезвоживании роговичных трансплантатов над силикагелем (Волков В.В., Шиляев В.Г., 1976; Гольфельд Н.Г., 1976). Метод прост и позволяет длительно сохранять трансплантационный материал, однако консервированная роговица лишена жизнеспособности.
Предлагались использовать в качестве консервантов различные жидкие среды. Офтальмологам Мак Кери и Кауфман (1974) удалось создать среду, названную в их честь, которая позволила надежно консервировать роговицу на срок до 96 часов. В последующем появились ее производные с более длительным сроком хранения: Chondroitin Sulphate (Kaufman Н.Е., 1984), К-sol (Lindstrom R.L., 1990), Dexol (Lindstrom R.L., 1990), Optisol (Williams K.A., Coster D.J., 1993), среда Борзенка-Мороз (Борзенок C.A., Мороз З.И., Комах Ю.А. и др., 2002).
Технические достижения к настоящему времени позволили предложить такие методы консервации роговицы, как криоконсервация (-196°С) в жидком азоте с использованием различных крио-протекторов (Дронов М.М., 1987; Williams К.А., Muehlberg S.M., Lewis R.F., CosterD.J., 1995), гипербарическая оксигенация при гипотермии (Линник Л.Ф., Подопригора Р.Н., 1976), в вакууме (Канюков В.Н.,ра Р.Н., 2006), в том числе контейнеры с наноструктурированным углерод содержащим покрытием (Мусина А.Д., 2006).
До настоящего времени не существует единого мнения относительно наилучшего способа сохранения роговицы человека. Значительное количество существующих методик консервации роговицы свидетельствует об отсутствии совершенных технологий. Следует также отметить недостаточные морфологические обоснования предложенных методик в аспекте изучения диапазона изменчивости ткане- и органоспецифичности консервируемых объектов. Все это стимулирует дальнейший поиск в этом направлении.
Учитывая положительные результаты консервации донорской роговицы путем лиофилизации с последующим прозрачным приживлением послойных трансплантатов (Бордюгова Г.Г., 1980; Илатовская Л.В., 1980), мы сочли целесообразным провести исследования по разработке метода консервации роговицы в вакууме при гипотермии.
Цель исследования - морфофункциональное обоснование возможности использования трупных донорских роговиц, консервируемых в условиях вакуума при гипотермии, для выполнения сквозных и послойных кератопластик. Для реализации этой цели поставлены следующие задачи:
1. Изучить на светооптическом и ультра структур ном уровнях морфофункциональную характеристику трупных донорских роговиц, консервируемых в условиях вакуума при гипотермии.
2. Определить оптимальные сроки вакуумной консервации донорских роговиц.
3. Провести экспериментально-гистологические исследования биологических свойств трансплантатов (диапазона их гисто- и органотипической реорганизации) в условии культивирования донорского материала по методу Ф.М. Назаренко.
4. Обосновать возможность применения предложенного способа консервации трупных донорских роговиц в условиях вакуума при гипотермии в клинике для выполнения сквозных и послойных кератопластик. Научная новизна исследования
Впервые экспериментально-гистологически, включая ультраструктурный и иммуноцитохимический анализы, выявлены структурно-функциональные изменения роговицы, консервированной в вакууме при гипотермии, определен уровень апоптоза в материале, предназначенном для трансплантации в аспекте прогнозирования исходов операций по трансплантации донорских роговиц, консервированных различными способами.
Впервые изучены имплантаты консервированной роговицы (в вакууме при гипотермии) для получения результатов цитофизиологической характеристики пересаживаемых структур, их потенциальных репаративных и индуцирующих возможностей, в условиях культивирования по методу Ф.М. Назаренко (1959).
Практическая значимость работы
Разработан альтернативный способ консервации роговицы в условиях вакуума при гипотермии. Исходя из полученных данных о высоких пластических свойствах консервированной роговицы, предлагается использовать для этих целей вакуумную установку, которая эргономична, легка в обращении, экономически выгодна. Возможность хранения роговицы с сохранением ее биопластических свойств позволяет иметь достаточные запасы качественного донорского материала.
Использование для трансплантации качественного донорского материала обеспечивает благополучный исход операции, уменьшает риск послеоперационных осложнений, гарантирует успешное приживление трансплантата.
Внедрение результатов исследования
Полученные данные морфофункциональной реорганизации роговой оболочки, консервированной в вакууме при гипотермии, служат теоретическим обоснованием возможности использования данного метода в офтальмохирургической практике.
Согласно новым данным по апоптозу и культивированию по методу Ф.М. Назаренко консервированной роговой оболочки, возможно применение данных методик в клинической практике с целью прогнозирования исходов трансплантации.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Структурно-функциональная оценка донорской роговицы, консервированной в вакууме (3-Ю сутки) показывает сохранность фенотипических свойств трансплантата, коллагеновых фибрилл, что свидетельствует об устойчивости (толерантности) соединительнотканных структур роговицы к данным условиям консервации.
2. При консервации роговицы наблюдаются явления угнетенного синтеза генов белков (bcl-2, р53) и изменения в соотношении их экспрессии, что свидетельствует о нарушениях клеточных циклов, как эпителиоцитов, так и фибробластов.
3. Культивирование фрагментов роговицы, консервированной в вакууме, по методу Ф.М. Лазаренко (1959) показало морфологические признаки, характеризующие механические, прочностные ее характеристики, активизацию клеток фибробластического ряда, что свидетельствует о возможности ремоделирования, которое будет инициировать процессы репаративного гистогенеза соединительной ткани.
4. В своей совокупности полученные результаты обосновывают целесообразность использования роговицы, консервированной в вакууме, для послойной кератопластики.
Апробация работы и публикации результатов исследования Материалы диссертации представлены и обсуждены на Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии микрохирургии глаза (актуальные вопросы морфогенеза и регенерации в офтальмохирургии)» (Оренбург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в офтальмологии» (Чебоксары, 2007); VII Западно-Сибирская межрегиональная научно-практическая конференция «Новое в офтальмологии» (Новосибирск, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Высокие технологии в офтальмологии» (Краснодар, 2008); III Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2008); Международной научно-практической конференции «Современные технологии лечения заболеваний переднего и заднего сегментов глаза» (Уфа, 2008); Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (Оренбург, 2008); Российской научно-практической конференции «Новые технологии микрохирургии глаза (офтальмопатология детского возраста)»
(Оренбург, 2008); IV Межрегиональной научно-практической конференции «Метрология и инженерное дело в медико-биологической практике» (Оренбург, 2009); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения — 2009» (Москва, 2009), Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы офтальмологии» (Уфа, 2009), Российский общенациональный офтальмологический форум МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 2009), VI съезд анатомов, гистологов и эмбриологов России (Саратов, 2009), Всероссийская научная конференция с международным участием «Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия в XXI веке» (Оренбург, 2009).
По теме диссертации опубликовано 17 научных работ из них 4 в центральной печати рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, главы обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами, 30 рисунками. Список литературы содержит 220 источников, в том числе 101 иностранных. Диссертация изложена на русском языке.
Информативность различных методов оценки жизнеспособности роговицы
Общеизвестно, что для успешной трансплантации роговицы, как и других органов и тканей, необходимо получение после консервации качественных жизнеспособных тканевых структур. Главным критерием жизнеспособности донорской роговицы принято считать сосгояние ее эндотелиальных клеток, обеспечивающих гидратацию и прозрачность трансплантата (Федоров С.Н., РонкинаТ.И., ЯвишеваТ.М., 1993; Bourne W.M. et al., 1985; Bourne W.M., 1986; Abramo F., Bohnke M., Draeger J., 1990; Hsu J.K.W. et al., 1999; Hwang D.G., 2005). Важную роль для сквозной кератопластики играют также фиброциты собственного вещества роговицы, обеспечивающие нормальную гидратацию стромы роговицы (Buschke W., 1951; Duke-Elder S., 1960; Leign A.G., 1966).
Обычные гистологические методы оценки трансплантата не всегда пригодны для определения жизнеспособности ткани (Войно-Ясенецкий В.В., 1953; Назаренко В.И., Васильев Н.И., Николаева 1-І.А., 1975; Юрченко Т.Н., Шарлай Т.М., Волков В.В. и др., 1986).
Более совершенными лабораторно-морфологическими методами являются гистохимические, которые заключаются в изучении активности дыхательных ферментов, отражающих энергетическую функцию эндотелиальных клеток роговицы (Шарлай Т.М., 1977; КопаеваВ.Г., 1982; Юрченко Т.Н., 1982; Kaufman Н.Е., CapellaJ.A., Robins J.E., 1964; Pera-Carrillo H.E., PolackF.M., 1964; Robins J.E., CapellaJ.A., Kaufman H.E., 1965; Bauer F., 1968).
Наиболее ранние функциональные нарушения на ультраструктурном уровне в клетках можно выявить с помощью электронной микроскопии (Авцын А.П., Шахламов В.А., 1979). Этими методами изучены ультраструктурные изменения в клетках фибробластического ряда и эндотелиальных клетках роговицы, в частности в их митохондриях, в различные сроки после смерти донора, после консервации донорской роговицы и в процессе ее приживления в эксперименте (Травкин А.Г., Деревянко В.П., 1978; ЯвишеваТ.М., 1990; РонкинаТ.И., 1994; Tamaki К. et al., 1987; Farge E.J. et al., 1989).
Помимо трансмиссионной, применяется и сканирующая электронная микроскопия, которая позволяет детально изучить эндотелиальные клетки роговицы и межклеточные взаимодействия (Федоров С.Н., Ронкина Т.И., ЯвишеваТ.М.,1993).
Очевидно, что для оценки жизнеспособности роговицы необходима информация и о структуре, и о метаболизме эндотелиальных клеток и кератоцитов донорских роговиц, то необходима комплексная структурно-функциональная ее характеристика (Травкин А.Г. с соавт., 1977; Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Кирпатовский В.И., 1983; Федоров С.Н. с соавт., 1998; Tsubota К. et al., 1988; Lass J.H. et al., 1991).
По критерию интегративности достаточно информативными лабораторно-функциональными методами являются культуральные: метод органных и метод клеточных культур (Болдырев В.П., Туринцева Г.Г., 1976; Мальханов В.Б., Азнабаев М.Т., 1998; Stacker G.W. et al., 1959; Reim М., 1987; Tsubota К. et al., 1988). При культуральном методе, прежде всего, изучаются закономерности взаимодействия эпителия и эндотелия и сроки сохранения прозрачности роговицы (Мальханов В.Б. с соавт., 1999).
Разновидностью культуральных методов, в которых определяется жизнеспособность трансплантируемых тканей in vitro, является культивирование тканей in vivo по Ф.М. Назаренко (1959). При этом методе осуществляется имплантация кусочков органа одного животного другому. В отличие от обычных трансплантаций, при которых стремятся к приживлению органа или его части в организме реципиента, данная методика направлена на получение пролиферации тканей из подсаженного кусочка органа и образование органных структур, которые являются основным объектом дальнейшего исследования.
Преимуществом использования культивирования по методу Ф.М. Лазаренко является изучение процесса трансплантации тканей, как сложного взаимосвязанного биологического явления, исход которого зависит не только от гистологических свойств пересаживаемых тканей, но и от структурных особенностей ложа реципиента. При этом учитывается, что достижение эффективности связано не только с механическим, но и с биостимулирующим воздействием трансплантата на ткани реципиента. Отсюда вытекает необходимость учета гистогенетических особенностей совмещаемых тканей, т.е. подбора «трансплантируемых объектов с учетом возможной реализации ими гистобластических и органотипических потенций в зависимости от структурных особенностей воспринимающего ложа реципиента» (Канюков В.Н., Стадников А.А., Трубина О.М., 2005).
Данная методика использовалась в двух исследованиях по офтальмологии, касающихся пересадки роговой оболочки, консервированной в условиях гипербарической оксигенации при гипотермии (Линник Л.Ф., Подопригора Р.Н., 1978; Подопригора Р.Н., 1985), и аллотрансплантации аорты в пластической офтальмохирургии (Канюков В.Н., Стадников А.А., Трубина О.М., 2001).
Преимущества и недостатки основных методов консервации донорской роговицы
Разработка проблемы сохранения донорской роговицы путем ее консервации была начата в работах В.П.Филатова (1934; 1935). Им был предложен уникальный метод продления жизни группой роговицы во влажной камере, заключающийся в том, что свсжеэнуклеированное в асептических условиях трупное глазное яблоко помещается в стерильную стеклянную или фарфоровую емкость с крышкой, содержащую концентрацию паров воды. Метод широко применялся в офтальмохирургии, и в литературе имеются различные высказывания о сроках сохранности роговицы при его использовании. На основании многочисленных экспериментальных исследований и клинических наблюдений В.П. Филатова (1938, 1954) установлено, что оптимальными условиями влажной камеры для сохранения жизнеспособности роговицы является консервация трупных глаз при температуре +2- +4С в течение 1-3 суток. В других исследованиях имелись указания о сохранности донорской роговицы, при консервации глазных яблок по В.П. Филатову для сквозной кератопластики в течение 2-5 суток (Горгиладзе Т.У., 1983) и даже до 5-7 суток, а для послойной кератопластики до 10-15 суток (Савушкина Н.М., 1962). Однако, в других исследованиях установлено, что при консервации глаза во влажной камере роговица подвергается процессам аутолиза (постепенный распад белка, снижение интенсивности углеводного обмена и активности некоторых ферментов) и что предельно допустимое снижение ее жизнеспособности наступает уже через 18-24 часа после смерти донора (Фукс Б.Б., 1956; КопаеваВ.Г., 1973, 1982; Федоров С.Н., Копаева В.Г., 1974; Schaeffer Е.М., 1963; Pera-Carrillo P., PolackF.M., 1964; Heydenreich A., 1968).
Таким образом, следует считать, что консервированная по В.П. Филатову роговица обладает, как правило, достаточной дыхательной функцией и остается жизнеспособной в течение одних суток.
В дальнейшем для краткосрочного хранения роговицы была предложена гипотермическая консервация трупных донорских роговиц в жидких культуральных средах. Прежде всего, значение приобрела предложенная офтальмологами В.Е. МсСагеу и H.E.Kaufman (1974) среда, названная в их честь МК-средой, которая состоит из культуры клеток ТС-199, нетоксической буферной системы, высокомолекулярного декстрана, цветного индикатора рН и антибиотиков широкого спектра. Авторы обосновали состав предложенной среды с учетом предъявляемых к ней требований: сохранение метаболизма клеток роговицы, поддержание осмотической резистентности клеток и стромы роговицы (для препятствия отеку), достаточная буферная емкость (поддержание рН), сохранение стерильности (Lindstrom R.L., 1990; Williams К.Л., Coster D.J., 1993; Williams К.А. et al., 1995).
На основе среды MK были созданы различные производные среды (К-Sol, Dexol, Optisol и др.), позволившие увеличить максимальное время хранения роговицы до 10 дней (Kaufman Н.Е. et al., 1984; Lindstrom R.L., 1990; Williams К.A., Coster D.J., 1993).
Как указывает C.A. Борзенок (2008), при конструировании оптимальных сред для консервации роговицы малоперспективно добавление в ее состав факторов роста и различных регуляторных пептидов, так как для осуществления пролиферативных процессов у человека и теплокровных животных необходима нормотермия, в условиях же гипотермии они происходить не будут.
Адекватным направлением развития гипотермической консервации донорских роговиц автор считает осуществление профилактики окисления липидов клеточных мембран и развития энергодефицитного состояния. В настоящее время установлено, что среда K-Sol (Kaufman Н.Е. et al., 1985), которая готовится на HEPES-буфере и содержит вместо декстрана хондроитин-сульфат, обеспечивает сохранность жизнеспособности донорских роговиц для сквозной кератопластики в течение двух недель, между тем как в других жидких средах, включая МК, этот срок ограничивается 7 днями (Busin М. et al., 1986). J. 1-І. Lass, S.K. Medcalf, M. McBride et al. (1988) методом 31Р-ЯМР спектрографии установили, что среда K-Sol эффективна для поддержания энергетического метаболизма роговиц в процессе их среднесрочной консервации.
Интерес представляют культуральные среды Optisol (Kaufman Н.Е. et al., 1991), содержащая оптимальное соотношение декстрана и хондроитин-сульфата, и среда Chen (Chen С.Н., Chen S.С, 1998), содержащая гидроксибутират натрия. L.R. Nelson, D.O. Hodge, W.M. Bourne (2000), W.M. Bourne, L.R.Nelson, L.J. Maguire et al. (2001) сравнили эффективность консервации донорских роговиц в средах Chen и Optisol путем учета толщины, плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц человека и клинических данных по результатам сквозной кератопластики этих роговиц. При этом не выявилось достоверных различий в потере эндотелиальных клеток, ультраструктуре и приживлении трансплантатов в зависимости от среды их консервации, но было выявлено, что в среде Chen эндотелиальные клетки донорских роговиц имели более длительную функциональную активность. По данным C.H.Chen и S.C.Chen (1998) роговицы, консервированные в предложенной ими среде, сохраняли в течение 11 суток активный гликолиз и нормальную функцию дыхания клеточных популяций всех трех слоев роговицы, а в средах Dexol и Optisol показатели гликолиза не регистрировались уже через 5 суток консервации роговиц.
Отечественная среда, разработанная в 1990г. С.А. Борзенком и З.И. Мороз на основе среды МК, была названа их именем в 1995г. на европейской конференции по Глазным банкам. Преимущества использования среды Борзенка-Мороз для консервации роговиц получили подтверждение и в клинических исследованиях (Комах Ю.А., 1995; Джавришвили Г.В., 2004;
Мороз З.И., 2005). Существенным является включение в среду оксибутирата-гамма-оксимасляной кислоты (ГОМК), которая имеет выраженные антигипоксические свойства, имитирует оптимизацию липидного обмена и поддерживает нативные свойства клеточных мембран.
Культивирование по Ф.М. Лазаренко
Для фрагмента работы по культивированию использовалась роговица на стадии консервации 7 суток. Консервированная роговица переносится в подготовленную чашку Петри с физиологическим раствором. Затем роговица многократно разрезается и измельчается изогнутыми глазными ножницами (до размеров около 0,5мм). Полученная липкая кашица слегка промывается в физрастворе и смешивается с заранее приготовленным измельченным целлоидином (в соотношении 1:3). У животного-реципиента (половозрелые кролики самцы массой 3,5-4,0кг) на брюшной стенке параллельно белой линии производился разрез кожи в 2-2,5см. Формировались карманы между фасцией и мышцами брюшной стенки глубиной 2-Зсм. В сформированные карманы производилась имплантация кусочков роговицы с целлоидиновым песочком. У каждого животного было сформировано по 4 имплантата (рис 5). Имплантаты экстирпировали на 3, 6, 10 и 15 сутки.
Было исследовано 24 имплантата роговицы консервированной в вакууме при гипотермии и 12 имплантатов роговицы консервированной в среде Борзенка-Мороз.
С целью определения трансплантабельности аллогенных донорских роговиц, консервированных в вакууме при гипотермии, нами были проведены экспериментально-клинические исследования биологического результата приживления послойных трансплантатов аллогенных роговиц у кроликов породы Schinschilla.
Из свежеэнуклеированных глаз кроликов после соответствующей обработки иссекался корнеосклеральный лоскут и хранился в условиях вакуума при гипотермии. Сроки консервации донорских роговиц составляли 4 и 7 суток.
У кроликов реципиентов при помощи трепана диаметром 8,0мм формировался дефект роговицы на Уг стромы. Из донорской роговицы формировался подобный трансплантат и сажался на место сформированного дефекта, и фиксировался узловыми швами. В послеоперационном периоде ежедневно 4 раза в день в конъюнктивальную полость инсталлировали раствор тобрадекса (рис 6).
Было выполнено 12 послойных кератопластик с роговицей, консервированной в вакууме при гипотермии, на 12 кроликах. Пересаженные роговицы были подвергнуты структурно-функциональному исследованию на 10 и 30 сутки со дня пересадки. Объектом морфологических исследований служили комплексы: трансплантат роговицы + ложе реципиента.
Эксцизивные фрагменты участков роговицы фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина. После стандартной гистологической проводки материал заливали в парафин-целлоидин. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином с последующим анализом и микрофотографированием при помощи цифровой фотокамеры Canon IXUS 800 IS.
Материал фиксировали в охлажденном (t+4C) 2,5% растворе глютарового альдегида на S-коллединовом буфере (рН=7,3)- Постфиксацию проводили в 1% растворе четырехокиси осмия по Millonig (1961). В дальнейшем кусочки обезвоживали при комнатной температуре в серии спиртов возрастающей крепости (50-100) и абсолютном этаноле, после чего заключили в смолу ЭПОН-812 (Уикли, 1975). Полимеризацию объектов проводили при t+60C (в течение 3-х суток). С каждого блока на ультратоме УМТП-4 получали полутонкие срезы (1 мкм), которые окрашивали метиленовым синим и основным фуксином по прописи Sato et Shamoto (1973). Полутонкие срезы использовали при подготовке блоков к прицельной заточке, необходимой для изготовления ультратонких срезов (40-60 нм) на ультратоме LKB-5 (Sweden-Bromma).
Ультратонкие срезы подвергали двойному контрастированию в насыщенном растворе уранилацетата при t+37C в течение 30 минут и цитрате свинца по Reynolds (1963). Изучение ультратонких срезов и их фотографирование производили на электронном микроскопе ЭМВ 100АК при увеличении отх8 000 до 40 000.
С целью проведения иммуноцитохимического исследования материал (нативная роговица, роговица, консервированная в вакууме и в среде Борзенка-Мороз) фиксировали в 12% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. В дальнейшем на парафиновых гистосрезах проводили двухэтапные реакции по идентификации белка-маркера апоптоза - р53 и антиапоптического белка - bcl-2.
На первом этапе депарафинированные срезы подвергали высокотемпературной обработке и инкубации с первыми (специфическими) моноклональными антителами (фирма «Дако», Дания) в рабочем разведении 1:50. Для визуализации позитивного (р53) иммунного окрашивания клеток применяли стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод с последующим докрашиванием ядер гематоксилином Майера.
Параллельно для определения внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag Plus Peroxidaze in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Intergin», Канада) с докрашиванием ядер клеток 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере.
На втором этапе осуществляли инкубацию гистосрезов с моноклональными антителами bcl-2 и авидин-биотин-пероксидазным комплексом с последующим выявлением пероксидазы диампн-бензидином. Подготовленные таким образом гистологические срезы докрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Подсчет р53 и bcl-2 позитивных клеток производили методом их визуализации в каждом гистологическом срезе (при стандартном увеличении 900, не менее 200 клеток) в соответствии с рекомендациями А.А. Жданкииой (2006).
Экспериментально-гистологические исследования биологических свойств роговичных трансплантатов в условиях культивирования in vivo по методу Ф. М. Лазаренко
В целях определения диапазона реактивности и пластичности тканевых и клеточных элементов донорских роговиц, реализуемых в условиях асептического воспаления, мы использовали оригинальную методику имплантации органов и тканей (культивирование in vivo) по Ф.М. Лазаренко (1959). Данный метод широко используется в оренбургской научной гистологической школе для изучения гистобластических и органотипических свойств органов и тканей различного генеза (А.А. Стадииков, 1995). Следует отметить, что для целей обоснования новых технологий в офтальмохирургии данный методический прием был успешно использован для определения возможностей тканей роговицы, консервированной в условиях гипербарической оксигенации, к пролиферации (P.M. Подопригора, 1985), а также для обоснования целесообразности аллотрансплантации дефектов склеры аортой (В.Н. Канюков, А.А. Стадииков, О.М. Трубима, 2001).
Для решения же сформулированных нами задач исследования метод культивирования по Ф.М. Лазаренко ранее не применялся. Наши исследования показали, что в 1-е - 3-е сутки после начала опыта (имплантации) фрагментов донорской роговицы, в тканях реципиента (область под апоневрозом мышц живота кролика) возникает воспалительная реакция. Причинными факторами для этого являлись: введение кусочков донорской роговицы, механическая травматизация тканей реципиента при формировании "пазухи" в подкожной клетчатке и субаионевротическом районе, внесение индифферентного материала в виде целлоидинового "песочка". В своей совокупности указанные факторы приводили у реципиента к вазодилятации сосудов микроциркуляторного русла, экссудации плазмы крови и миграции лейкоцитов, формированию малодифференцированной соединительной ткани (рис 21). Отечная жидкость не только окружает имплантаты по поверхности, но и проникает внутрь их, расслаивая целлоидиновые кусочки, и измельченные фрагменты роговицы друг от друга (рис 22). Следует отметить, что, по мнению автора данного экспериментально-гистологического метода, экссудативная жидкость несет в себе определенные регуляторные факторы, предопределяющие дальнейший ход регрессивных и прогрессивных процессов (Ф.М. Назаренко, 1959). К 3 суткам эксперимента по поверхности имплантированного материала, а также по межцеллоидиновым промежуткам, образуется малодифференцированная соединительная ткань (рис 23), содержащая гемокапилляры, фибробласты, пролиферирующие периваскулярные клетки. К 6 суткам опыта одновременно с формированием соединительнотканной капсулы имплантатов происходит активное врастание кровеносных капилляров в межцеллоидиновые перегородки. Таким образом, в организме реципиента создается своеобразная биологическая камера, в которой тканевые элементы донорской роговицы претерпевают ряд последовательных структурных превращений. Изложение результатов в данной серии опытов мы проводим в сравнительном аспекте, учитывая два способа консервации роговицы, которые мы избрали (в условиях предлагаемой методики в вакууме и при использовании среды Борзенка-Мороз). Прежде всего, необходимо подчеркнуть, что в условиях культивирования in vivo фрагментов донорских роговиц, консервированных указанными способами, мы получили сведения, свидетельствующие об иммунологической толерантности организма реципиента к имплантированным объектам (в наблюдаемые нами сроки опытов). Так через 3 суток культивирования роговицы, консервированной в среде Борзенка-Мороз, передний эпителий сохраняет свою гистологическую структуру и лишь в некоторых небольших участках пласта он расслаивается лейкоцитами на уровне слоя шиповатых (крыловидных) клеток (рис 24). В этих же участках (через 6 суток) отмечены погружные эпителиальные разрастания в собственное вещество роговицы (рис 25). При этом данная структура роговицы отечна, а среди расслоенных коллагеновых пластин регистрируются гемокапилляры. В эти сроки культивирования задний эпителий роговицы (эндотелий) сохранен частично и не покрывает фрагменты роговицы на всем протяжении. В более поздние сроки культивирования (6-10 сутки) возрастает складчатость эпителия и пластинчатых структур собственного вещества роговицы и их расслоение (дискомплексация фибриллярных структур). Боуменова и десцеметова мембраны приобретают выраженный складчатый характер, и слабо контурируются. Электронно-микроскопические данные свидетельствуют о дезорганизации стромальных компонентов роговицы, что подтверждается также результатами гистохимических исследований (понижение содержания гликозаминогликанов и возрастание нейтральных фракций гликопротеидов). Анализ гистологических препаратов показал, что при культивировании роговицы, консервированной в среде Борзенка-Мороз на стадии 6-Ю суток, происходят деструктивные изменения с передним эпителием, нарастают явления отека и дискомплексации фибриллярных структур собственного вещества роговицы. При этом обнаруживаются полиморфно-клеточные локальные инфильтраты в периваскулярных зонах. В более поздние сроки культивирования (15 суток) на месте данных полиморфно-клеточных инфильтратов формируются кистозные полости, расслаивающие соединительнотканные пластинки собственного вещества роговицы, что существенно нарушает прочностные качества материала (рис26).
