Введение к работе
Актуальность проблемы
В последнее время становится все более очевидным, что изучение морфофункциональной организации ядерных структур в оогенезе млекопитающих выходит из разряда «прикладных», обслуживающих только сугубо специфические вопросы развития женских гамет. Накопленные к настоящему моменту сведения, полученные на ооцитах млекопитающих (см. обзор Зыбина, Зыбина, 1992), дают на наш взгляд перспективу для современного анализа морфогенетических трансформаций хромосомного аппарата, нуклеол, многочисленных экстрахромосомных телец, становления компартментализации кариоплазмы, и позволяют считать изучение ядра ооцитов млекопитающих актуальным для решения общецитологических проблем.
Представляется особенно важным исследование ядерных структур, в отмеченных аспектах, на заключительных этапах оогенеза (непосредственно перед созреванием ооцита), когда проходит окончательная «доводка» закладывающейся проморфологии будущего эмбриона, когда, очевидно, происходит накопление ядерных макромолекулярных комплексов, способных обеспечить начальные фазы эмбриогенеза при неактивном геноме зародыша. В современных работах указывается на существенный вклад в поддержании раннего развития млекопитающих процессов, происходящих на поздних стадиях диплотены мейоза (см. напр. Dean et al., 1989; Wassarman, Kinloch, 1992). Несомненно возрастание важности анализа ядерной организации в позднем оогенезе при переходе к материалу человека. Однако именно ядро поздних (преовуляторных) ооцитов человека оказалось слабо изученным в рамках современных подходов. Это тем более парадоксально, поскольку в последнее время, в клинической практике получило широкое распространение культивирование ооцитов из антральных фолликулов человека с последующим оплодотворением in vitro.
Вплоть до наших исследований практически неизученной оставалась ультраструктурная организация ядра ооцита человека в этот период. Не получила
должного освещения синтетическая активность этих ядер, исследованная лишь с помощью световой авторадиографии. Не были выявлены, при ультраструктурном анализе, особенности организации уникальной структуры инактивированных ядер ооцитов человека - кариосферы. Не было проведено сравнения организации кариосферы человека с подобной структурой в ооцитах других животных, где она довольно подробно изучена (Gruzova, Parfenov 1993). Своего решения требовала проблема организации и состава ядрышкоподобного тельца, занимающего центральное положение в кариосфере человека. Нуждались в расшифровке многочисленные ядерные тельца, накопившиеся к концу оогенеза. Последние, вероятно, и обеспечивают ту гетерогенность кариоплазмы ооцита, анализ которой поможет приблизиться к пониманию компартментализации клеточного ядра, его доменной организации. Вопрос о доменной организации ядерного содержимого все более активно выдвигается на передний край современных исследований по клеточной биологии ядер позвоночных (Ascoli, Maul, 1991; Spector, 1993). Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлся анализ морфофункциональной организации ядер ооцитов из антральных фолликулов человека на трех последовательных стадиях развития, включая изучение поэтапного формирования комплекса внутриядерных структур - кариосферы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
С помощью электронномикроскопических методов описать организацию ядер ооцитов из антральных фолликулов человека на трех последовательных стадиях развития, характеризующихся разной степенью агрегации внутриядерных структур.
-
Изучить ультраструктуру кариосферы из ядер ооцитов человека и проанализировать, на основании литературных данных, ее сходство или различие с кариосферами других позвоночных.
-
Для определения корреляции морфологических преобразований ядер с их синтетической активностью, требовалось, используя электронномикроскопическую авторадиографию, показать уровни транскрипционной активности ядер на диплотенной стадии развития ооцитов.
-
Дать описание строения ядерных телец и с помощью иммуноэлектронной микроскопии идентифицировать те из них, которые содержат компоненты созревания пре-мРНК. В связи с этим, предстояло показать гомологию этих
ядерных телец подобным образованиям в клетках соматического происхождения.
-
Для сравнительного изучения ядерных телец, содержащих факторы созревания пре-мРНК, в разных группах млекопитающих следовало показать их ультраструктурную организацию и состав в ооцитах из преовуляторных фолликулов мыши.
-
Для выявления гомологии между некоторыми ядерными тельцами позднего оогенеза и раннего эмбриогенеза представлялось целесообразным дать иммунофлуоресцентный анализ ядерных телец двухклеточных эмбрионов мыши.
Научная новизна результатов.
Дано первое ультраструктурное описание преобразований внутриядерной организации ооцитов из антральных фолликулов человека. Впервые детальное изучение морфодинамики ядерных структур в поздней диплотене человека было сопряжено с электронноавторадиографическим анализом особенностей чередующихся стадий транскрипционной активности ядер.
Впервые на примере человека показаны особенности ультраструктурной организации кариосферы млекопитающих.
Представлены первые иммуноэлектронные данные по составу ряда внутриядерных структур человека.
Впервые проведенные иммуноэлектронные исследования ядер преовуляторных ооцитов человека подтвердили гипотезу о накоплении в позднем оогенезе млекопитающих некоторых макромолекул, обеспечивающих потребности раннего эмбриогенеза.
Впервые в женских гаметах млекопитающих, на примере преовуляторных ооцитов человека, показана роль ядерных структур (ядрышкоподобного тельца и кластеров интерхроматиновых гранул - КИГ) в депонировании компонентов, связанных с процессами созревания РНК.
Впервые выявлено селективное накопление факторов созревания РНК в пределах одной ядерной структуры - КИГ ооцитов человека. Даны первые описания фибриллярных зон в составе КИГ.
Представлены первые сведения, позволяющие провести гомологию между кластерами интерхроматиновых гранул ооцитов человека и соматических клеток млекопитающих.
Научно-практическая ценность работы.
Выявление в дишютенных ооцитах человека преобразований ядерных структур, имеющих одинаковую с другими позвоночными направленность, имеет теоретическое значение для построения общей схемы трансформации внутриядерной организации гамет в позднем оогенезе позвоночных разного систематического положения. Полученные данные по депонированию компонентов, связанных с метаболизмом РНК, в определенных ядерных структурах позднедиплотенных ооцитов человека, расширяют представления о функциях части ядерных структур в один из ответственных периодов проэмбрионального развития организмов.
Результаты работы по анализу организации ядра ооцитов из антральных
фолликулов человека могут представлять интерес для клиницистов,
использующих методы культивирования ооцитов, с последующим
оплодотворением in vitro.
Материалы, полученные в работе, могут быть включены в курсы лекций по биологии развития и клеточной биологии для студентов соответствующих кафедр медицинских и биологических высших учебных заведений. Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на 9-ом Международном конгрессе по цитологии, Брюссель, Бельгия, 1986 г.; на IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" Черноголовка,1987 г.; на 4-ом Французско-чехословацком совещании «Через ооцит к эмбриону» Прага, Чехословакия, 1990 г.; на семинарах лаборатории морфологии клетки, а также на совещаниях кафедры гинекологии Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И.И.Мечникова.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена найЬтраницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего $/ названий. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 3 таблицами.
Автор благодарен сотрудникам лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН за постоянную помощь и поддержку в работе. Автор надеется, что представленные в ней результаты внесут скромный
вклад в развитие направления, связанного с изучением организации ядра ооцита, основанного И.И.Соколовым и плодотворно продолженного М.Н.Грузовой. Автор выражает признательность за помощь в работе К.Г.Мурти и Д.Девис (Детский исследовательский госпиталь, Мемфис, США). Автор благодарен Д.Ф.Костючек за помощь в получении материала (Санкт-Петербургская Государственная Медицинская Академия им. И.И.Мечникова).
