Введение к работе
Актуальность работы. Проблема регенерации уже длительное время является одной из наиболее актуальных проблем клеточной биологии, иммунологии и фундаментальной медицины. Во всем мире идет интенсивное изучение процессов восстановления, что можно объяснить чрезвычайной важностью процессов регенерации для решения многих вопросов теоретической биологии и репаративной медицины (., 2011; ., 2010; ., 2009; Бабаева А.Г., 1985; Горышина Е.Н., 1990). При этом способность к регенерации является универсальным свойством всех живых организмов. Однако степень выраженности этой способности у разных групп очень отличается по механизмам, формам и продолжительности. Несмотря на большую актуальность данной проблемы и масштаб исследований, на сегодняшний день нет единого общепринятого подхода к процессу регенерации, и, что не менее важно, к его регуляции. Тем не менее, благодаря использованию современных методов клеточной и молекулярной биологии, биологии развития, иммуногистохимии, клеточные основы репаративного процесса млекопитающих исследуется довольно быстрыми темпами (., 2009; ., 2011). В гораздо меньшей степени это пока относится к регуляции репаративных процессов на уровне организма, пока только в общих чертах описано значение нервной и иммунной систем для инициации репаративного процесса (Бабаева А.Г., 1985), а также роль тканеспецифических факторов в ходе репарации. При этом основные исследования направлены на изучение процесса репарации у млекопитающих, обладающих очень сложной системой тканей и многофакторными регуляторными процессами. При этом млекопитающие составляют довольно молодой в филогенетическом плане класс, поэтому его изучение не может в полной мере раскрыть процесс становления механизмов регуляции регенерационных процессов и указать их древние, ключевые, а потому наиболее чувствительные к воздействию точки.
По этой причине представляется актуальным рассмотрение взаимосвязей защитных и репаративных реакций на разных эволюционных уровнях, начиная с самых древних форм, с целью проследить этапы становления комплексной защитно-репаративной реакции, формирование процесса взаимодействия иммунной и репаративной систем в разных таксонах и тем самым взглянуть на проблему в целом. Модель древнейших из ныне живущих низших хордовых животных (асцидии) очень удобна с той точки зрения, что они обладают всеми четырьмя классическими типами тканей, обладают циркуляторной системой, выполняющей как транспортные, так и защитно-репаративные функции, и при этом по общей степени сложности и интегративности тканевых систем существенно уступают млекопитающим. При этом асцидии, как все многоклеточные животные, обладают реакциями врожденного иммунитета и активно защищаются от проникновения патогенов во внутреннюю среду. Одновременно эти организмы обладают и системами репарации и регенерации (., 2010; ., 2010; ., 2010). При этом вопрос о наличии у асцидий механизмов приобретенного иммунитета остается открытым, однако есть основания предполагать наличие некоторых элементов системы приобретенного иммунитета, первые этапы её формирования (Tomaso A., 2008). Механизмы защитных реакций асцидий имеют много общих черт с реакциями, свойственными большинству беспозвоночных. С другой стороны, некоторые ответные реакции асцидий на введение чужеродных антигенов очень схожи с реакциями врожденного иммунитета позвоночных. Не случайно асцидии являются одним из главных модельных объектов по изучению этапов становления и механизмов аллораспознования, системы распознавания "своё" – "не своё" в целом (Fuke, 2001).
Изучение динамики клеточных популяций очень часто включает глубокий анализ системы циркулирующих форменных элементов. На сегодняшний день разные исследователи выделяют от 3 до 9 различных популяций циркулирующих клеток у асцидий, выделенных как правило с помощью классических гистологических и гистохимических методов исследования (Rowley, 1981; Smith, Peddie, 1992; Shirae, Saito 2000; Parrinello et al., 2007; Hirose еt al., 2003; Parrinello еt al., 2003). Лишь единичные работы предусматривают использование моноклональных антител против поверхностных антигенов и маркеров циркулирующих клеток человека (Cima F., 2006; Khalturin K., 2003). Тем не менее, единая общепризнанная классификация гемоцитов асцидий, основанная на гистогенетических связях, в настоящее время отсутствует. Неясным остается вопрос о способности циркулирующих клеток асцидий к пролиферации, что важно для понимания процесса становления системы стволовых клеток в высших таксонах позвоночных, механизмов их адгезии и миграции в очаг тканевого повреждения.
Цель работы: изучение динамики клеточных популяций асцидии Halocynthia purpurea в ответ на тканевое повреждение.
Задачи работы:
1. На основании морфологического анализа описать основные популяции гемоцитов H.purpurea, предложить их классификацию и изучить функциональные характеристики;
2. Оценить возможность использования и информативность применения метода проточной цитометрии для типирования неокрашенных циркулирующих клеток асцидий;
3. Исследовать способность циркулирующих гемоцитов к пролиферации в ответ на тканевое повреждение;
4. Изучить динамику клеточных популяций и экспрессии ими поверхностных маркеров в ответ на тканевое повреждение.
Научная новизна. Впервые проведено исследование различных популяций гемоцитов асцидии H.purpurea с применением методов проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Выявлена способность морулярных клеток к автофлуоресценции, что может служить основным критерием оценки относительного содержания клеток данной популяции в гемолимфе. С использованием двух методов оценки впервые показан факт пролиферации циркулирующих клеток асцидий в норме и в ответ на тканевое повреждение. Для исследования циркулирующих клеток беспозвоночных впервые были использованы трехпараметрические гистограммы, что позволило оценить клеточный состав гемолимфы и её отдельных фракций. Впервые была проведена оценка возможности использования моноклональных антител к адгезионным молекулам для типирования гемоцитов в норме и в ответ на тканевое повреждение.
Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Основным научным значением работы является важный теоретический результат, описывающий динамику и кинетику клеточных популяций асцидий в ответ на тканевое повржедение. Полученные результаты свидетельствуют о наличии у низших хордовых циркулирующих клеток-предшественников, способных к пролиферации и дифференцировке в различные морфотипы гемоцитов асцидий. Полученные новые данные о морфологии гемоцитов асцидий и экспрессии их поверхностных маркеров, обладающих антигенным перекрестом с ключевыми адгезионными молекулами стволовых клеток млекопитающих. Существенным теоретическим и практическим результатом является адаптация метода проточной цитометрии для изучения циркулирующих клеток беспозвоночных без использования моноклональных антител.
Полученные результаты найдут применение в фундаментальных сравнительно-гистологических и сравнительно-иммунологических исследованиях, в биологии стволовых клеток, в лекционных курсах по общей и сравнительной иммунологии, сравнительной гистологии и другим дисциплинам. Методические разработки могут быть использованы для изучения защитных реакций различных таксонов беспозвоночных и позвоночных животных.
Положения, выносимые на защиту.
1. Определены основные популяции циркулирующих клеток асцидии H.purpurea.
2. Циркулирующие гемоциты асцидии способны к пролиферации и отвечают повышением её уровня на тканевое повреждение.
3. Функциональная активность циркулирующих клеток асцидий (способность к эндоцитозу, продукции активных форм кислорода, синтезу цитокино-подобных факторов) меняется в ответ на тканевое повреждение.
4. Моноклональные антитела к адгезионным молекулам человека связываются с перекрестно-реагирующими детерминантами гемоцитов асцидий; уровень связывания меняется в ответ на травму.
Реализация работы. Результаты работы легли в основу 3 статей и 7 тезисов докладов.
Личный вклад в проведенное исследование. Личный вклад автора в выполненную работу включал самостоятельное проведение большинства исследований, разработку и адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов. Вклад соавторов ограничивался помощью в постановке и освоению новых методов исследования, технической поддержке при работе с аппаратурой и предоставлением в распоряжение автора ряда реактивов.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008), Всероссийской симпозиуме по биологии клетки в культуре на тему "" (Санкт-Петербург, 2009), Международной научной конференции "Молодь – медицинi майбутнього" (Одесса, 2010), совместном заседании отделов иммунологии и общей и частной морфологии НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2011).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов. Работы проиллюстрированы 47 рисунками и фотографиями и 10 таблицами. Библиографический указатель содержит 154 работы, в том числе 20 работ на русском языке и 134 – на иностранных языках.
