Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
1. ВВЕДЕНИЕ 8
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
2.1. Строение центросомы и ассоциированных с ней структур 12
2.1.1. Центросома на светооптическом уровне 12
2.1.2. Ультраструктура центриолярных цилиндров 14
2.1.3. Перицентриолярные сателлиты 19
2.1.4. Центриолярные придатки 21
2.1.5. Полярность центриоли 23
2.1.6. Различия в строении материнской и дочерней центриолеи 27
2.1.7. Перицентриолярный материал и связь между центриолями в клетке 29
2.1.8. Первичная ресничка 32
2.1.9. Исчерченные корешки 33
2.1.10. Другие структуры в составе интерфазной центросомы 35
2.1.11. Строение центросомы в митотических клетках 36
2.2. Механизмы и регуляция образования центриолеи в клетках 39
2.2.1. Механизмы образования центриолеи 39
2.2.2. Формирование de novo центриолярных цилиндров центросом и базальных телец 40
2.2.3. Дупликация центриолеи вблизи уже существующих в клетке центриолярных цилиндров 47
2.2.4. Соотношение центриолярного и клеточного циклов 51
2.2.5. Регуляция центросомального цикла 57
2.2.6. Поддержание центросомой центрального положения в клетке
2.3. Система микротрубочек в клетке и роль центросомы в её организации 60
2.3.1. Структура, динамические свойства микротрубочек и факторы влияющие на их гетерогенность в клетке 60
2.3.2. Гетерогенность изоформ альфа- и бета-тубулина, входящих в состав микротрубочек 66
2.3.3 Посттрансляционные изменения тубулинов — 70
2.3.4. Микротрубочко-ассоциированные белки 75
2.3.5. Факторы, участвующие в нуклеации микротрубочек 77
2.3.6. Нуклеация микротрубочек на центросоме 82
2.4. Центросома — мультибелковый комлекс 87
2.4.1. Новые белки тубулинового семейства 88
2.4.2. Нинеин 91
2.4.3. Белок Сер 110 92
2.4.4. Центрин 93
2.4.5. Ценексин — 95
2.4.6. Перицентрин 96
2.4.7. РСМ-белки 97
2.4.8. Белки СР60 и СР190. 98
2.4.9. Молекулярные шапероны. 99
2.4.10. Тектины. 100
2:4.11. Катании 101
2.4.12. Центросомин 103
2.4.13. Белок NuMA 104
2.4.14. Роль фосфорилирования в регуляции функциональной активности центросомы 104
2.4.15. Ассоциированные с МТ белки-моторы и их участие в процессе формирования митотического веретена 114 Цель и задачи работы 122
3. МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ 125
Принятые сокращения 125
3.1. Биологические материалы 125
3.2. Химические реактивы : 126
3.3. Прижизненные наблюдения за клетками 126
3.4. Ультрафиолетовое микрооблучение клеток 127
3.5. Антитела 129
3.6. Иммунофлуоресцентное исследование клеток 130
3.7. Авторадиографическое исследование клеток 131
3.8. Электронная микроскопия 132
3.8.1. Иммуно-электронная микроскопия 132
3.8.2. Негативное контрастирование препаратов для ЭМ 134
3.8.3. Крио-электронная микроскопия 135
3.9. Синхронизация клеток 135
3.10. Электрофорез и иммуноблоттинг белков 137
3.11 Афинная хроматография 137
3.12. Очистка тубулина 138
3.13. Выделение центросом из клеток КЕ37 141
3.14 Полимеризация МТ in vitro 146
3.15 Исследование киназной активности белков 147
3.16. Дифференциальная интерференционная микроскопия 148
3.17. Трансфекция клеток pEg2(GFP) 148
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 150
4.1. Исследование роли центросомы в клетке с помощью
ультрафиолетового микрооблучения 150
4.1.1. Нормальный митоз в клетках СПЭВ 150
4.1.2. Контрольное микрооблучение 151
4.1.3. Облучение центросомы в ранней метафазе 155
4.1.4. Облучение центросомы в поздней метафазе 162
4.1.5. Облучение центросомы в анафазе: поведение центросом, веретена, и хромосом; выход клеток в интерфазу 162
4.1.6. Интерфазные клетки с облученной центросомой: формирование ядра и рост клеток 168
4.1.7. Система МТ и ультраструктура центросом в интерфазных клетках с облученным в анафазе полюсом веретена 173
4.1.8. Влияние микрооблучения центросомы на внутриклеточный транспорт 181
4.1.9. Синтетическая активность и продвижение по клеточному циклу клеток с облученной центросомой 182
4.1.10. Влияние микрооблучения центросомы на её способность к репликации 186
4.1 Л1. Формирование ядрышек и накопление в них белка В23 в клетках с облученной в анафазе центросомой 190
Заключение к Главе 4.1. 193
4.2. Изучение динамики распределения гамма-тубулина в центросоме интер фазных и митотических клеток с помощью специфических антител 201
4.2.1. Характеризация антител к гамма-тубулину 201
4.2.2. Распределение гамма-тубулина в клетках при деполимеризации и стабилизации МТ 207
Заключение к Главе 4.2. 210
4.3. Локализация Аврора А киназы Хепорш laevis pEg2 и динамика экспрессии этого белка в клеточном цикле 213
4.3.1. Получение AT к Аврора А киназе Xenopus laevis pEg2 и локализация этого белка в клетке 214
4.3.2. Динамика экспрессии pEg2 в клеточном цикле 221
4.3.3. Распределение pEg2 в клетках при деполимеризации МТ 224 4
.3.4. Распределение pEg2 в клетках при стабилизации МТ 226
Заключение к Главе 4.3. 227
4.4. Взаимодействие Авроры А киназы Xenopus laevis pEg2 с белком
XlEg5 в процессе построения митотического веретена 231
4.4.1. Колокализация pEg2 и XlEg5 в митотических и интерфазных клетках 232
4.4.2. Взаимодействие pEg2 и XlEg5 in vitro и in vivo 234
4.4.3. Фосфорилирование XlEg5 киназой pEg2 in vitro и in vivo — 237
Заключение к Главе 4.4. 242
4.5. Роль МТ и актиновых микрофиламентов в процессе расхождения центросом в интерфазе и митозе 245
4.5.1. Разделение центросом в контрольных XL2 клетках 246
4.5.2. Деполимеризация МТ или актиновых филаментов блокирует разделение центросом в интерфазных клетках 250
4.5.3. После того как разделение центросом в интерфазных клетках произошло, дальнейшее их расхождение облегчается при деполимеризация МТ, но блокируется при деполимеризация актиновых филаментов 252
4.5.4. Расстояния между центросомами в профазных клетках при деполимеризация МТ и/или деполимеризации актиновых филаментов 254
4.5.5. В митозе, деполимеризация актиновых филаментов вызывает нарушение разделения центросом только в течение профазы и прометафазы 258
4.5.6. Продолжительность различных стадий митоза в присутствии латранкулина 261
Заключение к Главе 4.5. 264
4.6. Исследование влияния Авроры А киназы Xenopus laevis pEg2 на процесс полимеризации МТ и их нуклеацию на центросоме. — 273 4.6.1. pEg2 киназа стимулирует полимеризацию МТ в растворе in vitro 273
4.6.2. Центросомы клеток КЕ-3 7 теряют эндогенную человеческую Аврора А киназу в процессе выделения 282
4.6.3. Xenopus laevis Аврора А киназа pEg2 ингибирует нуклеацию
МТ на центросоме 284
4.6.4. AuroraA киназа из Xenopus laevis pEg2 взаимодействует с человеческими центросомами, полученными из клеток линии КЕ37 - 287
4.6.5. Преинкубация центросом с полноразмерными рекомбинантными киназами pEg2-(his)6 и pEg2-K/R-(his)6, но не с Nt-pEg2-(his)6 блокируют нуклеацию МТ на центросоме 290
4.6.6. Прямое наблюдение роста МТ на центросоме в присутствии pEg2-(his)6 и N-терминального домена pEg2 киназы с помощью видеомикроскопии с усилением контраста 292
4.6.7. Иммуно-ЭМ исследование взаимодействия pEg2 киназы с центросомами и МТ 295
4.6.8. Эффект супер-экспрессии pEg2 киназы на структуру системы МТ в XL2 клетках 298
Заключение к Главе 4.6. 301
5. ВЫВОДЫ 307
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 309
7. БЛАГОДАРНОСТИ 311
8. СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ — 313
9. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Центросомы и входящие в её состав центриоли, несомненно, являются наиболее удивительными компонентами эукариотической клетки. В ходе эволюционного развития центриоли появились у древних одноклеточных жгутиконосцев в виде базального тельца жгутика. Поразительная геометрически правильная пространственная организация, сочетающая в себе симметрию девятого порядка в поперечном направлении и полярность организации в продольном направлении, делает центриоль уникальным компонентом клетки, по степени упорядоченности расположения макромолекул, дающей основание сравнивать ее с вирусами. Функция формирования жгутика или реснички сохраняется у центриолей и в многоклеточных организмах - в клетках ресничного эпителия и в сперматозоидах. Однако в ходе эволюционного развития центриоли приобрели и другие важные для клетки функции. Этому способствовало то, что центры нуклеации МТ, расположенные на центриолях нуклеировали не только МТ ресничек, но и цитоплазматические МТ. Очевидное преимущество протекания многокомпонентных биохимических реакций на плоскости по сравнению с реакциями в объеме клетки привело в ходе эволюции к развитию сложно организованных мембранных органелл. Однако еще более термодинамически выгодно, если такие реакции происходят не на плоскости, а «в точке». Такой особой точкой в клетке в ходе эволюционного развития и стала центросома. Именно в центросоме концентрируются и взаимодействуют друг с другом многие регуляторные молекулы. Еще до того как при делении происходит разделение поровну между дочерними клетками хромосом и, тем более, до начала разделения цитоплазмы, в клетке образуются вместо одного центра два — центросома удваивается. Начало этого удвоения закладывается в инициации дупликации центриолей ещё в конце Gi-фазы клеточного цикла, что может служить первым морфологическим проявлением подготовки клетки к последующему митозу.
В митозе две центросомы, включающие в себя 4 центриоли, участвуют в построении веретена деления. Также как и в жгутике, структурную основу веретена деления составляют МТ — еще более древние, чем центриоли, «живые полимеры», которые встречаются во всех эукариотических клетках.
Все функции центросомы так или иначе связаны с организацией МТ. При образовании жгутика его МТ, кроме двух центральных, являются продолжением МТ центриолярного цилиндра. В веретене деления МТ или непосредственно нуклеируются в окружающем центриоли митотическом гало, или транспортируются туда моторными белками. Многие регуляторные молекулы, концентрирующиеся в районе центросомы, также доставляются туда по радиальной системе МТ интерфазных клеток. Таким образом, термин «центр организации МТ» (ЦОМТ) достаточно точно определяет центросому. Эти термины не вполне идентичны: в клетках могут быть ЦОМТ не совпадающие с центросомой, например в клетках ресничного эпителия базальные тельца ресЕїичек являются ЦОМТ, по не являются центросомами. Во многих типах дифференцированных клеток центросомы уже не являются ЦОМТ.
И в составе центриолей, и в веретене деления, и в жгутиках и ресничках, и в цитоплазме интерфазных клеток МТ имеют практически одинаковое строение. Не отличается, в целом, строение МТ и организмах различных таксономических групп, несмотря на существенные различия в аминокислотной последовательности составляющих их белков альфа и бета тубулинов. Функция центриолей в клеточном делении не так очевидна, как в процессе инициации роста жгутика или реснички. В этом случае МТ веретена не являются продолжением МТ центриолей, а растут от центров нуклеации, расположенных в окружающем центриоли митотическом гало. Кроме того, центриолей нет в полюсах веретена у высших растений, дрожжей и в полюсах мейотического веретена у многих организмов, в полюсах митотического веретена которых центриоли всегда имеются. Тем не менее бесцентриолярные полюса веретена деления содержат те же основные белки, необходимые для нуклеации МТ. Процесс формирования веретена в большой степени зависит от активности внутриклеточных белков-моторов, которые «фокусируют» минус-концы МТ и белка NuMA, который скрепляет эти концы МТ между собой. Такие искусственные веретена могут быть собраны без участия центросом. Однако в живой клетке в митозе две центросомы всегда выступают в качестве доминантных ЦОМТ, что обеспечивает формирование биполярного веретена и равномерное распределение генетического материала в две дочерних клетки.
В предлагаемом далее обзоре литературы рассматриваются история изучения и современное представление о различных морфологических составляющих центросомы, способах удвоения этой клеточной органеллы, а также биохимические свойства, составляющих структурную основу центриолей, МТ и функциональный анализ, входящих в состав центросомы белков.
