Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Клиническая картина и патогенез рассеянного склероза 10
1.2. Иммунологические и биохимические изменения при PC. 12
1.3. Роль адгезивных свойств лейкоцитов крови и адгезивных молекул при PC 22
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1. Общая характеристика клинических наблюдений 28
2.2. Методы исследования 33
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 39
3.1. Исследование адгезивной активности лейкоцитов крови и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки 39
3.2. Исследование клеточной реактивности к антигенам основному белку миелина (ОБМ), туберкулопротеину (ТП), ганглиозидам мозга (ГМ) с помощью метода
реакции подавления прилипания лейкоцитов (РГШЛ) 48
3.3. Определение субпопуляций лимфоцитов крови
(фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD20+) и
активированных клеток (CD25+, CD95+, HLA-DR+) при PC 55
3.4. Определение содержания иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM),
иммунных комплексов, их фракционного состава (крупно-,
средне-, и мелкомолекулярной фракций) в сыворотке крови
при PC 76
3.5. Сопоставления адгезивных свойств крови и показателей клеточного и гуморального иммунитета и клиническая гетерогенность PC 84
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 113
ВЫВОДЫ 129
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 131
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Клиническая картина и патогенез рассеянного склероза
- Общая характеристика клинических наблюдений
- Исследование адгезивной активности лейкоцитов крови и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки
Введение к работе
Актуальность. Проблема рассеянного склероза (PC) одна из актуальных в современной неврологии. PC - наиболее часто встречающееся хроническое аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС). По распространённости среди неврологических заболеваний ЦНС PC занимает четвертое место после инсультов, эпилепсии и паркинсонизма, в молодом возрасте - второе место после эпилепсии. В настоящее время в мире насчитывается более 2 млн больных PC, в том числе в России свыше 150 тысяч человек. Распространённость его растет во многих странах мира, что связано не только с удлинением жизни больных, но и с истинным увеличением заболеваемости [9]. Хроническое прогрессирующее течение PC, поражение преимущественно лиц молодого и среднего возраста, ранняя инвалидизация, недостаточная эффективность проводимой терапии подтверждают медицинскую и социальную значимость проблемы. [8,10,17,18].
Исследование последних лет показали сложность и многогранность патогенеза рассеянного склероза (PC). PC является заболеванием с выраженной клинической вариабельностью, непредсказуемостью прогноза.
Несмотря на активное изучение, этиология и патогенез PC остаются не вполне ясными. Актуальной проблемой является изучение механизмов развития неврологической симптоматики и вариантов течения заболевания. Очаги демиелинизации в ЦНС, выявляемые с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), не всегда и не в полной мере соответствуют клиническим данным. В последние годы большое внимание уделяется не только изучению иммунологических и биохимических нарушений, приводящих к обострению болезни и формированию ремиссий, но и также сопоставлению патогенетических особенностей различных вариантов течения PC.[4,10,25,30].
В последние годы установлено, что ключевую роль в миграции специфичных к антигенам нервной ткани (ОБМ и др.) аутореактивных Т-лимфоцитов через ГЭБ в ЦНС, играют молекулы адгезии, экспрессирующиеся
как на поверхности Т лимфоцитов, так и на эндотелиальных клетках [2,10, 14, 20,30,37,80]. На современном этапе, изучение адгезивных молекул является актуальным как в понимании патогенеза различных типов течения PC, так и разработки перспективных направлений патогенетической терапии PC. В последние годы проводятся исследования возможности использования моноклональных антител против некоторых форм МА с терапевтической целью. Одним из таких препаратов является натализумат, ингибирующий а-4-интегрин [16].
В осуществлении целого ряда физиологических и патологических процессов важнейшую роль играют адгезивные свойства лейкоцитов крови. Способность лейкоцитов крови к адгезии (прилипанию) была известна давно. Однако значимость этого свойства долгое время недооценивалась. В настоящее время адгезионным взаимодействиям различного типа клеток между собой, а также их взаимодействию с межклеточным матриксом отводится ведущая роль во многих процессах, развивающихся, как в физиологических условиях, так и в условиях патологии. К их числу относятся такие, как активация и дифференцировка иммунокомпетентных клеток, преодоление клетками гистогематических барьеров, развитие воспалительных реакций, передача всевозможных сигналов и другие [24, 65, 98, 105, 112].
Молекулы адгезии (МА) являются субстратом, опосредующим взаимную адгезию клеток и межклеточного матрикса, причём прилипание (или распластывание клеток на субстрате) служит одним из проявлений их функциональной активации. В целостном организме адгезия клеток развивается по отношению к другим клеткам, эндотелию сосудов, межклеточному матриксу, а в условиях in vitro она воспроизводится к неспецифическим субстратам, в частности, стеклу, пластиковой поверхности; при этом предполагается, что данное явление отражает способность клеток к прилипанию к эндотелию. Идентифицировано более 5 групп МА, в их числе интегрины, селектины, суперсемейство иммуноглобулинов и другие. Известно
7 существование двух различных форм МА: растворимой (рМА) и связанной с поверхностью клеточных мембран (мМА) [10].
Методы определения уровня молекул адгезии (МА) в клинических условиях, хотя принципиально и разработаны, однако остаются малодоступными в связи с большой трудоёмкостью и высокой стоимостью тест - систем для определения рМА, что объясняет ограниченное число исследований роли МА при PC.
Все вышеизложенное послужило основанием для определения и изучения клинического значения адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови при PC.
Цель настоящего исследования:
Провести клинико-иммунологическое исследование с оценкой различных параметров адгезивной активности клеток и сыворотки крови больных PC.
Задачи исследования
1. Изучить адгезивную активность лейкоцитов и сыворотки крови у
больных рассеянным склерозом (PC) с помощью оригинального нового
способа, разработанного на основе реакции подавления прилипания
лейкоцитов (РГТПЛ).
2. Провести сопоставление индекса спонтанной адгезии (ИСА) и эффекта
усиления адгезии под действием аутосыворотки (ЭУс-а) со степенью
активности патологического процесса, длительностью, тяжестью и
клиническими проявлениями заболевания.
3. Исследовать сенсибилизацию лейкоцитов крови к основному белку
миелина, смеси ганглиозидов из мозга быка (ГМ) и туберкулопротеину (ТП) с
помощью РППЛ у больных PC.
4. Уточнить состояние количественных показателей клеточного
иммунитета с помощью определения основных субпопуляций лимфоцитов
крови (фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD20+) и активированных
клеток (CD25+, CD95+, HLA-DR+) у больных PC.
Исследовать гуморальный иммунитет с определением содержания иммуноглобулинов G, А, М и иммунных комплексов (ИК) в сыворотке крови больных PC.
Изучить взаимосвязь показателей адгезии с другими показателями иммунного статуса больных PC, и оценить диагностическую и прогностическую значимость адгезивной активности лейкоцитов и сыворотки крови у больных PC.
Научная новизна
Впервые применён оригинальный метод определения суммарной адгезивной активности лейкоцитов и сыворотки крови. Получен патент на изобретение №2246728 "Способ определения адгезивных свойств лейкоцитов крови", приоритет изобретения от 03 апреля 2003; зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2005г.
Проведённое исследование позволило получить новые данные, характеризующие адгезивную активность лейкоцитов и сыворотки крови, взаимосвязи показателей адгезии с клиническими проявлениями у больных PC, а также с особенностями клеточного, гуморального иммунитета при различных типах течения, длительности и тяжести заболевания.
Сравнительный анализ показателей адгезии и иммунного статуса в зависимости от типа течения, длительности и тяжести заболевания показал значительные отличия в изменении изучаемых параметров, что отражает этапы демиелинизирующего процесса.
Теоретическая и практическая значимость работы
Установлены параметры показателей адгезии (значение индексов спонтанной адгезии и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки), которые могут быть использованы в качестве дополнительных лабораторных критериев прогнозирования характера течения PC. Предложенный способ определения показателей азгезии и вычисления величин ИСА и ЭУс-а позволил выявить повышение адгезивной активности
9 лейкоцитов и сыворотки при PC и использовать их для скринингового определения суммарного содержания мембранных и растворимых форм адгезивных молекул как при PC, так и при других заболеваниях. Проведённое комплексное клинико-иммунологическое исследование расширяет представление о механизмах формирования иммунного ответа при PC, и влияние факторов адгезии на гетерогенность клинических проявлений. Основные положения, выносимые на защиту
У больных PC обнаружено повышение адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови. Установлена взаимосвязь показателей адгезии с характером течения PC, активностью патологического процесса, а также с клиническими проявлениями заболевания.
Показатели адгезии (индекс спонтанной адгезии, эффект усиления адгезии под действием сыворотки) могут использоваться как критерий подтверждения развития обострения заболевания и выхода в ремиссию, а также прогнозирования типа течения PC.
Различный характер и особенности взаимосвязей иммунных параметров с показателями адгезии при разных клинических проявлениях PC подтверждают их существенный вклад в клиническую гетерогенность заболевания.
Клиническая картина и патогенез рассеянного склероза
Рассеянный склероз - хроническое аутоиммунное демиелинизирующее заболевание нервной системы, характеризующееся образованием множественных очагов демиелинизации, преимущественно в центральной нервной системе (ЦНС). Этим заболеванием страдают преимущественно люди молодого возраста, ведущие активную трудовую деятельность и социальную жизнь. PC характеризуется хроническим прогрессирующим течением, ранней инвалидизацией, недостаточной эффективностью проводимой терапии [9,10, 15, 27, 35, 37]. Более половины больных через 10 лет PC имеют трудности в выполнении профессиональных обязанностей, через 15 лет - более 50% имеют трудности в самостоятельном передвижении, а при длительности PC более 20 лет - проблемы в самообслуживании. Около 15% больных с самого начала имеют неуклонно прогрессирующий тип течения PC с быстрым нарастанием инвалидизации.
Различают несколько типов течения рассеянного склероза. Чаще всего имеет место ремиттирующее течение болезни, когда обострение сменяется ремиссией, в которую все нарушения полностью или частично проходят.
Другой вариант течения, менее благоприятный, это неуклонное прогрессирование логического процесса. Прогрессирующее течение заболевания с редкими периодами стабилизации и минимальными улучшениями может наблюдаться с самого начала PC, и соответствует первично-прогредиентному течению болезни. Течение заболевания считается вторично-прогредиентным, если ремитирующий характер PC сменяет постепенное прогрессирование с редкими выраженными обострениями, периодами стабилизации и без них. Диагноз прогредиентного течения PC ставился, согласно данным литературы, при неуклонном прогрессировании симптоматики в течение 12 месяцев [35, 87]. Исследование последних лет показали, что PC является мультифакториальным заболеванием. Важную роль в его развитии играют вирусная инфекция, наследственная предрасположенность, реализуемая полигенной системой, ответственной за формирования иммунного ответа и определенного типа метаболизма, а также неизвестные пока географические факторы [8,9, 28, 29, 50, 80, 82, 92, 95, 112].
Для рассеянного склероза характерно наличие множественной (рассеянной) симптоматики, раннее начало болезни с последующим «накоплением» симптомов и неуклонным их нарастанием.
Гистохимическое изучение очагов поражения (бляшек) в ЦНС, данные иммуногенетики PC, положительный эффект иммуномодулирующей и иммуносупрессивной терапии, данные изучения PC на животных моделях дают основание считать, что в основе патогенеза PC лежит аутоиммунный механизм [8, 9,10, 15, 17,27, 103, 106,107].
Наиболее полно аутоиммунные процессы выражены на начальных этапах заболевания, когда обострения PC сменяются периодами ремиссий. Последующая хроническая фаза заболевания характеризуется как дегенерацией миелинового волокна, синтезируемого олигодендроцитами, так и разрушением олигодендроцитов и аксонов. Исследования последних лет показали, что аксональная нейродегенерация может развиваться на самых ранних стадиях заболевания, ещё до клинических проявлений [8,9, 22, 46, 61, 108, 109].
Общая характеристика клинических наблюдений
В обследуемую клиническую группу вошли 100 больных рассеянным склерозом (PC). Контрольная группа состояла из 54 здоровых доноров крови, сопоставимых с больными PC по возрасту и полу. Группу сравнения составили 33 пациента, преимущественно с нейродегенеративными заболеваниями нервной системы (болезнью Паркинсона, Шарко-Мари, гепатоцеребральной дистрофией) - 24 больных (73%) и больные с болезнью Лайма - 9 пациентов (27%). Все клинико-иммунологическое исследование было построено на анализе трех групп: основной (I) группы, контрольной (II) группы и группы сравнения (III).
Объектом исследования основной группы были больные с достоверным диагнозом PC по критериям Позера [96]. Средний возраст пациентов составлял 34±10лет (M±SD). Обследованные лица были как мужчины, так и женщины в соотношении 47% к 53% соответственно. Распределение больных I группы в зависимости от пола и возраста представлены в таблице 1.
Среди больных PC отмечалось некоторое преобладание женщин 1:1,47. Возраст обследуемых больных PC был от 16 до 61 года. Больных моложе 20 лет было 10 человек, старше 50 лет- 7 человек. Преобладали больные в возрасте от 21 до 40 лет (66%) случаев.
Исследование адгезивной активности лейкоцитов крови и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки
Второй показатель, который анализировался в работе - эффект усиления адгезии под действием аутосыворотки (ЭУс-а), выявлялся у больных PC в 40% случаев, что значительно чаще (р=0,003), чем в группе практически здоровых лиц (17%) и в группе больных ДНЗ (24%). Группа ДНЗ не имела значимых различий с группой контроля, (табл. 6).
Следует отметить, что структура соотношения ЭУс-а и ИСА в группе ДНЗ не была схожа ни с одним из под типов течения PC.
Таким образом, результаты исследования ИСА и ЭУс-а в исследуемых группах отражают выраженное повышение уровня как мембранных, так и растворимых форм молекул адгезии при PC.
При проведении анализа показателей адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови в подгруппах больных PC с различным характером течения, а также с длительностью и тяжестью заболевания, выявлена их наибольшая взаимосвязь с типом течения PC (табл.8, рис.3). Максимально частое выявление высоких значения ИСА (р=0,0009) и ЭУс-а (р=0,0002) обнаружено при первично-прогредиентном течении PC, а также в стадии обострения (р=0,02 и р=0,01 соответственно) при ремиттирующей форме PC. При ПИРС ЭУс-а коррелировал с клиническими проявлениями поражения пирамидного тракта (г=0,90, п=4).
