Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из наиболее быстро развивающихся направлений современной медицины является создание новых высокоэффективных и малоинвазивных инструментальных методов диагностики. Огромный потенциал методов ЯМР в медицине не исчерпывается применением лишь МРТ. Совершенствование импульсных спектрометров ЯМР высокого разрешения привело к многократному росту их чувствительности и разрешающей способности (Э.Дероум, 1992) и открыло возможность проведения количественного анализа с помощью ЯМР большинства биологических жидкостей in vitro (J.C.Lindon и соавт., 2001; D.C.Robertson и соавт., 2005). Метод ЯМР позволяет обнаруживать и количественно определять сотни компонентов, в том числе важнейшие метаболиты и биомаркеры, выявлять на ранних стадиях развития многие патологические состояния, отслеживать реакции организма на воздействия различных патогенных факторов, токсических веществ и лекарственных препаратов в динамике (J.C.Lindon и соавт., 2000; J.K.Nicholson и соавт., 1989).
Спектроскопия ЯМР высокого разрешения на ядрах 1Н оказалась особенно подходящей для исследования составов биожидкостей, поскольку интенсивность сигналов в спектрах ЯМР пропорциональна числу магнитных ядер, спектр которых регистрируется, и не зависит от того, в каком структурном окружении эти ядра находятся. Именно поэтому МР-спектроскопия позволяет количественно определять одновременно сотни компонентов за относительно короткое время. В этом отношении метод ЯМР существенно превосходит масс-спектрометрию, которая, как правило, не позволяет в одном эксперименте одновременно количественно определять несколько компонентов разной химической природы. При МР-спектроскопии возможно многократно использовать пробу. Существенно и то, что спектр ЯМР содержит всю информацию о структуре определяемого соединения, достаточную для его надежной идентификации без привлечения других методов (J.K.Nicholson и соавт., 2002).
Очень немногочисленные литературные данные о составе ЦСЖ в норме неоднозначны и противоречивы (K. Diem и соавт., 1970; М. Garseth и соавт., 2000; J.Lynch и соавт., 1993), что обусловлено малым количеством наблюдений, использованием различных по своим техническим характеристикам спектрометров (S. Maillet и соавт., 1998; E.H. McGale и соавт., 1977), а также различных методик приготовления образца для проведения МРС (L.R. White и соавт., 2004; J.R. Youmans, 1982). В связи этим необходимо провести изучение влияния ряда факторов, таких как влияние pH, сроки хранения, условия хранения на получаемые результаты и составить стандартизованный протокол исследования.
В настоящее время практически отсутствуют данные о метаболическом профиле ЦСЖ здоровых людей по данным МРС высокого разрешения на ядрах водорода, а также информация об изменениях данного профиля при БДН и ишемическом инсульте. Таким образом, актуальным является проведение 1Н МРС ЦСЖ при спорадической БДН в сопоставлении с метаболическим профилем ЦСЖ лиц без неврологических, хронических соматических, инфекционно-воспалительных, эндокринных, наследственных и прочих заболеваний потенциально приводящих к изменению состава ЦСЖ.
Представляет интерес сравнительное исследование состава ЦСЖ при БДН (нейродегенеративном заболевании, поражающем преимущественно серое вещество головного и спинного мозга с интактным гематоэнцефалическим барьером) и ишемическом инсульте, при котором происходит как нарушение целостности гематоэнцефалического барьера, так и вовлечение в процесс белого и серого вещества головного мозга.
Болезнь двигательного нейрона (БДН) — заболевание, сопровождающееся гибелью центральных и периферических мотонейронов, прогрессирующим течением и летальным исходом. Согласно современным представлениям, развитие БАС обусловлено взаимодействием наследственных и экзогенных провоцирующих факторов. Наличие множественных патологических изменений в нейронах позволяет предположить многовариантность этиологии данного заболевания (W.G.Bradley и соавт., 1983; D.W.Cleveland и соавт., 2000; M.J.Strong и соавт., 2003) .
Этиология и патогенез БДН остаются неизвестными, и знаний, необходимых для разработки эффективных методов лечения и диагностики данного заболевания на ранних этапах, до настоящего времени накоплено недостаточно (D.W.Cleveland и соавт., 2000). Несмотря на относительно невысокий показатель заболеваемости, следует отметить, что БДН поражает лиц преимущественно зрелого и трудоспособного возраста, как правило, с высоким интеллектуальным и профессиональным потенциалом, неизбежно приводит к тяжелой инвалидизации и смерти больных, и это, с учетом отсутствия эффективных методов лечения, обосновывает актуальность изучения данного заболевания (О.А.Хондкариан и соавт., 1970; P.N.Leigh и соавт., 1995). Существующие на сегодняшний день методы медикаментозного лечения не приносят значимых результатов и носят паллиативный характер.
Множество проведенных молекулярно-генетических, биохимических и других исследований выявили большое многообразие изменений в клетках нервной системы — структурная дезорганизация нейрофиламентов, нарушение работы транспортных мембранных систем мотонейронов, токсическое влияние внутриклеточных белковых агрегатов, изменение метаболизма свободных радикалов, развитие оксидантного стресса, нарушения работы системы энергетического обеспечения клетки и другие.
Столь широкое разнообразие патологических проявлений БДН, преимущественно обнаруженных в условиях эксперимента, не может не находить отражения в метаболических профилях биологических жидкостей. Учитывая, что заболевание поражает клетки нервной системы, наиболее целесообразно исследование цереброспинальной жидкости. Изучение состава ликвора у больных с БДН представляет большой интерес в изучении патогенеза, диагностики и разработки методов прогнозирования характера течения заболевания. Существует достаточное количество литературных данных об изменениях качественного состава (высокомолекулярных соединений) цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) при БДН (D. Devos и соавт., 2004; J. Ilzecka и соавт., 2004; E. Kaufmann, 2004; S.D. Sussmuth и соавт., 2003). Однако, применение описанных в литературе методик для диагностики и прогнозирования течения заболевания для скрининговых целей не представляется возможным по причине высокой стоимости исследования, высоким расходом биологического материала, малым числом идентифицируемых метаболитов, что не позволяет всесторонне оценить метаболический профиль ЦСЖ.
ЯМР-спектроскопический анализ биологических жидкостей являтся перспективным методом получения важнейшей диагностической информации о низкомолекулярной составляющей метаболического профиля, недоступного для исследования иными методами.
Работа выполнена на базе кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (заведующая кафедрой — член-корр. РАМН, профессор В.И. Скворцова), НИИ Инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (директор — член-корр. РАМН, профессор В.И. Скворцова), городской клинической больницы №31, учебно-научного межфакультетского и междисциплинарного центра магнитной томографии и спектроскопии (ЦМТС) МГУ (директор — профессор Ю.А. Пирогов )
Цель работы
Изучить значение изменений химического состава цереброспинальной жидкости по данным магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах водорода у больных с различными неврологическими заболеваниями.
Задачи исследования
-
Разработать протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н. Определить влияние ряда физических факторов на получаемые спектры.
-
Оценить метаболический профиль цереброспинальной жидкости у пациентов, не страдающих неврологическими заболеваниями и иными патологическими состояниями, потенциально ведущими к изменению качественного состава ЦСЖ.
-
Провести качественную и количественную оценку полученных метаболических профилей в группах больных с БДН, ишемическим инсультом и контрольной группе.
-
Сопоставить полученные результаты по характеристикам метаболического профиля в группе пациентов с БДН с основными клиническими характеристиками заболевания (возрастом, формой, дебютом и вариантом, скоростью прогрессирования).
-
Провести оценку диагностических возможностей магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах 1Н при ишемическом инсульте и болезни двигательного нейрона.
Научная новизна
Разработан протокол исследования ЦСЖ методом спектроскопии ЯМР на ядрах 1Н. Показано, что увеличение срока заморозки ЦСЖ до 11 мес, а также незначительное колебание pH не оказывают значимого влияния на получаемые спектры. Выявлены различия частоты идентификации метаболитов при использовании различных импульсных методик подавления воды. Исследован метаболический профиль ЦСЖ практически здоровых лиц, идентифицировано 29 низкомолекулярных метаболитов. Установлено отсутствие статистически значимых различий качественного состава компонентов метаболического профиля цереброспинальной жидкости в норме и при болезни двигательного нейрона.
Впервые проведено исследование ЦСЖ пациентов с ишемическим инсультом in vitro методом МРС. Выявлено отсутствие корреляционных связей между характеристиками БДН (вариант, форма, скорость прогрессирования) и составом ЦСЖ. Обнаружены значительные количественные изменения состава ЦСЖ у пациентов с ишемическим инсультом. На основании сравнительного анализа метаболических профилей ЦСЖ при ишемическом инсульте, БДН и группы сравнения выявлены маркеры нарушения гематоэнцефалического барьера.
Разработан алгоритм статистической обработки массива диагностической информации, который может лечь в основу методики проведения дифференциальной диагностики патологических состояний по образцам биожидкостей c использованием магнитно-резонансной спектроскопии. Проведены проверка и доказательство эффективности разработанного алгоритма.
Практическая значимость работы.
Усовершенствован протокол проведения МРС нативной ЦСЖ на спектрометре высокого разрешения. Показано влияние ряда физических и химических факторов на получаемые спектры, а также выяснены особенности применения различных импульсных последовательностей на спектр. Предложен новый подход к оценке результатов исследования биологических жидкостей in vitro при различных неврологических заболеваниях с использованием магнитно-резонансной спектроскопии высокого разрешения на ядрах 1Н. Оценивая данные по маркерам нарушения гематоэнцефалического барьера, возможно использование их для прогнозирования исходов и течения заболевания. Показана возможность применения метода МРС в качестве универсального диагностического инструмента в клинической практике, в исследовании биологических жидкостей организма.
Внедрение в практику
Результаты настоящего исследования применяются при изучении биологических жидкостей в Центре магнитно-резонансной томографии и спектроскопии МГУ им. М.В.Ломоносова.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Длительное хранение образцов ЦСЖ при температуре –20 оС, повторное замораживание-размораживание образцов, а также добавление к ним буферного раствора существенно не влияет на качество получаемого спектра и на количественный состав образца.
-
Метод спектроскопии ЯМР высокого разрешения на ядрах 1Н расширяет спектр идентифицируемых метаболитов в ЦСЖ, выявлены 27 низкомолекулярных соединений с известной химической структурой и 2 соединения с неизвестной химической формулой.
-
Метаболические профили ЦСЖ больных БДН и образцов группы сравнения не имеют качественных и статистически значимых количественных различий.
-
В образцах ЦСЖ пациентов с ишемическим инсультом значимо повышены концентрации изучаемых метаболитов.
-
В ЦСЖ пациентов, страдающих БДН, не выявлено связи между характером метаболического профиля и основными клиническими характеристиками заболевания (возрастом, формой, дебютом и вариантом, скоростью прогрессирования).
-
Алгоритм описания данных МРС 1H ЦСЖ, основанный на МРС высокого разрешения, может быть использован для построения диагностической модели при различных заболеваниях, сопровождающихся изменениями состава ЦСЖ.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава, сотрудников НИИ Инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, врачей городских клинических больниц №20 и №31 г. (протокол № 11 от 27 февраля 2008 года).
Основные результаты исследования были доложены на III Международной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine» в г. Новосибирске 16 Июля 2006 года; на II Российском Международном конгрессе «Цереброваскулярная патология и инсульт» в г. Санкт-Петербург, 20 сентября 2007 г.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в центральной печати.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включает 21 рисунок, 32 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, 2 приложений и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы состоит из 181 источника, включая 36 отечественных и 145 зарубежных источников.
