Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
Микроскопическое исследование 12
Микологическое (культуральное) исследование 21
Новые методы диагностики онихомикозов 38
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования 52
Общая клиническая характеристика обследованных 52
Молекулярно-генетические методы исследования 55
Генодиагностика грибковой инфекции Trichophyton rubrum и Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale 56
Микробиологические методы исследования 60
1.5. Статистическая обработка данных 61
ГЛАВА 2. Оценка соответствия результатов ПЦР и регламентированных методов
лабораторной диагностики онихомикозов 62
Общие результаты ПЦР, микроскопии и культивирования 62
Результаты обследования с помощью регламентированных методов на фоне положительных результатов ПЦР 64
Результаты ПЦР на фоне положительных результатов обследования с помощью регламентированных методов 66
Результаты обследования с помощью регламентированных методов на фоне отрицательных результатов ПЦР 69
Результаты ПЦР на фоне отрицательных результатов обследования с помощью регламентированных методов 71
Перекрестное сопоставление результатов обследования с помощью ПЦР и обоих регламентированных методов 75
Статистическая достоверность соответствий результатов ПЦР, микроскопии и культивирования 79
ГЛАВА 3. Оценка точности ПЦР диагностики в процессе лечения онихомикоза 83
Расчеты диагностической точности ПЦР с помощью катамнестического анализа 83
Диагностическая точность ПЦР на фоне динамики лечения и при контрольном обследовании 84
Оценка точности ПЦР по результатам повторного обследования 86
3.4. Сроки негативации ПЦР в процессе лечения 88
ГЛАВА 4. Изучение этиологии онихомикозов на основе изучения результатов
ПЦР .' 92
Оценка этиологии онихомикоза с помощью ПЦР 92
Видовая, родовая и групповая этиология онихомикоза по данным культивирования 95
Сопоставление этиологической картины по результатам ПЦР и культивирования 97
Сравнительный анализ этиологической картины онихомикоза с помощью регламентированных методов диагностики 98
Оценка этиологических групп при онихомикозе по результатам ПЦР и регламентированных методов 100
ПЦР как средство конечной этиологической диагностики онихомикозов.. 104
4.7. Концепция ПЦР-негативного онихомикоза 107
ГЛАВА 5. Новый алгоритм диагностики онихомикозов 111
Расчет минимальной диагностической точности ПЦР относительно данных регламентированных методов обследования при онихомикозах 111
Расчет диагностической точности ПЦР для диагноза микоза ногтей (МКБ-10 В35.1) 115
Расчеты диагностической точности ПЦР общепринятыми методами 116
ПЦР как новый золотой стандарт диагностики онихомикозов 121
5.5. Новый алгоритм диагностики онихомикозов 124
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129
ВЫВОДЫ 142
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 144
УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ДНК гДНК
киотос
МКБ-10
п.н.
CHS-1
KONCBE
KONCPA
MALDI-TOF
PATHPAS
RAPD
RFLP
дезоксирибонуклеиновая кислота
рибосомальная ДНК
клинический индекс оценки тяжести онихомикозов Сергеева
международная классификация болезней 10 пересмотра
пар нуклеотидов
полимеразная цепная реакция
площадь под кривой
ген хитин-синтазы 1
внутренний транскрибируемый спейсер
микроскопия с окраской хлоразоловым черным
микроскопия с окраской PAS
матричная лазерная десорбционная ионизационая
масс-спектрометрия
нетранскрибируемый спейсер
гистологическое исследование с окраской PAS
случайная амплификация полиморфной ДНК
полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
характеристика зависимости результатов
Введение к работе
Дерматомикозы относятся к числу наиболее распространенных инфекций человека. В международных исследованиях установлено, что грибковые инфекции ногтей обусловливают до 25% обращаемости к дерматологу [Roseeuw D., 1999]. Данные сплошной диспансеризации в России показали, что онихомикоз может быть выявлен у 5% взрослого городского населения [Сергеев А.Ю. и соавт., 2002].
До настоящего времени диагностика микозов кожи и ногтей включала методы, которые требуют либо существенных временных и материальных затрат (микробиологическая, реже гистологическая и иммунологическая диагностика), либо недостаточно чувствительны и зависят от субъективного мнения врача-лаборанта (световая микроскопия) [Lawry М.А. и соавт., 2000; Lilly К.К. и соавт., 2006; Weinberg J.M. и соавт., 2003]. Для того чтобы преодолеть эти недостатки в повседневной практике, приходится выполнять повторные или множественные исследования [Kane J. et al. 1997; Суколин Г.И. и соавт., 2005]. До сих пор существуют разногласия в интерпретации результатов микологического исследования, оценки роли разных видов и групп грибов в этиологической структуре онихомикоза [Степанова Ж.В., 2002; Summerbell R.C. и соавт., 2005].
Новое развитие лабораторная диагностика микозов получила с появлением молекулярно-генетических методов, позволяющих выделить ДНК возбудителей [Verweij Р.Е. и соавт., 2000]. В данной области появляется возможность разрабатывать эффективные, применимые на практике, организационно и экономически приемлемые методики. Возможность использования одношагового подхода к диагностике (в частности, ПЦР), доступного во многих лабораториях и не требующего переподготовки персонала, не нуждающегося в дополнительной обработке материала или особых предосторожностях по сбору образцов, делает
разработку этого метода перспективной для врачей общей практики [Feuilhade de ChauvinM., 2005; TietzHJ., 2005].
Вплоть до настоящего времени за рубежом не удалось внедрить и на достаточном числе больных показать эффективность и практическую применимость какой-либо одношаговой технологии по определению возбудителей дерматомикозов непосредственно в клиническом материале. Внедрение нового метода, претендующего на роль золотого стандарта в диагностике онихомикозов, требует тщательной оценки точности, чувствительности и специфичности, для чего необходимы повторные обследования значительных контингентов, катамнестические наблюдения.
Учитывая перечисленные выше факты, разработка и внедрение микологической ПЦР диагностики представляет актуальную задачу современной дерматологии, решение которой будет способствовать эффективному выявлению и совершенствованию терапии онихомикозов.
Цель исследования
Оценить точность и возможности клинического использования метода полимеразной цепной реакции при онихомикозах для совершенствования на этой основе диагностики, лечения и профилактики заболевания.
Задачи исследования
Провести сравнительный анализ результатов регламентированных методов диагностики онихомикозов и ПЦР на различных стадиях заболевания и в различных группах обследованных.
Изучить точность, специфичность и чувствительность ПЦР как метода лабораторного подтверждения диагноза онихомикоза.
Изучить возможности ПЦР как метода контроля излеченности и оценки результатов лечения онихомикоза в динамике.
Изучить современную этиологию онихомикозов с помощью видоспецифичной генодиагностики.
Разработать алгоритм современной диагностики онихомикозов на основе применения полимеразной цепной реакции.
Научная новизна исследования
Впервые на большом клиническом материале изучены результаты использования отечественной диагностической ПЦР системы с использованием пары видоспецифичных праймеров Т. гиЪгит и Т. mentagrophytes var. interdigitale. Показаны высокая точность, специфичность и чувствительность нового метода.
Впервые на основе методов высокоточной видоспецифической молекулярной диагностики уточнена современная этиологическая картина онихомикозов, выявившая увеличение доли дерматофитов.
На основе полученных данных предложена новая концепция диагностики онихомикозов (выделяющая ПЦР-позитивный и ПЦР-негативный онихомикоз) и разработан эффективный диагностический алгоритм.
Основные положения, выносимые на защиту
Изученная методика ПЦР - высокоточный диагностический тест, результаты которого достоверно соответствуют результатам регламентированных методов диагностики онихомикозов. По выявляемое заболевания ПЦР превосходит регламентированные методы.
Применение ПЦР в изучении этиологии онихомикозов позволяет достоверно уточнять значение и роль дерматофитов в этиологической структуре заболевания.
Внедрение ПЦР позволяет повысить качество лабораторной диагностики онихомикозов и совершенствовать лечебно-профилактические мероприятия.
Практическая значимость
В клиническую практику предложен новый метод диагностики, позволяющий устанавливать диагноз онихомикоза с точностью, достоверно превосходящей существующие регламентированные методы.
Разработан новый диагностический алгоритм лабораторной диагностики онихомикозов, позволяющий резко сократить экономические и временные затраты на дорогостоящие микробиологические исследования у более 96% больных онихомикозами.
Метод ПЦР позволяет проводить экспресс-диагностику онихомикозов с одновременной видовой идентификацией главных возбудителей, что обеспечивает своевременную этиотропную терапию. Методика сбора материала не требует специальной подготовки и ПЦР можно рекомендовать для массовых обследований.
Метод ПЦР делает возможной раннюю оценку микологической излеченности и эффективности терапии онихомикозов в динамике, что позволит сократить сроки наблюдения больных.
Материалы исследования легли в основу «Инструкции по применению набора реагентов для определения ДНК Трихофитон рубрум (Trichophyton rubrum) и Трихофитон ментагрофитес, вар. интердигитале (Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale) методом полимеразной цепной реакции ТрифАм», утвержденной Приказом Росздравнадзора от 16 июля 2007 года № 1563-Пр-07.
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены и обсуждались на заседаниях 2 международной конференции Trends in medical mycology (Берлин, 2005), V Всероссийского конгресса по медицинской микологии (г. Москва,
2007 г.) и Московского научного общества дерматовенерологов имени А.И. Поспелова (г. Москва, 2007 г.), Областной научно-практической конференции врачей дерматовенерологов (г. Тула, 29.11.2007 г.), Юбилейной XXV научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские чтения. Современная дерматовенерология: от истории к инновациям», Москва 2008, II Съезде микологов России, Москва 2008.
Диссертация апробирована на научной конференции кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова.
Публикации
По теме диссертации опубликовано в печати 13 научных работ, в том числе глава в фонографии «Грибковые инфекции. Руководство для врачей», изд. 2-ое, М.: Бином-пресс, 2008.
Структура диссертации
Работа изложена на 159 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы и глав, содержащих изложение материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы.
Указатель литературы включает 29 отечественных и 137 зарубежных работ. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 43 таблицами.
