Введение к работе
Актуальность темы. Грибовидный микоз (ГМ) является наиболее распространенным видом первичных Т-клеточных лимфом кожи (R. Willemze и соавт., 2005). Диагностика грибовидного микоза, особенно на ранних стадиях (I-II), является одной из наиболее сложных проблем в практике дерматовенеролога. В настоящее время не существует единого диагностического алгоритма грибовидного микоза. Однако большинство авторов считает, что диагностика грибовидного микоза основывается на клинической картине заболевания, данных гистологического и иммунофенотипического исследований. Определение клональной перестройки гена Т-клеточного рецептора методом ПЦР является вспомогательным методом диагностики (Клинические рекомендации. Дерматовенерология, 2008, P. Lenane и соавт., 2007, N. Pimpinelli и соавт., 2005, S.J. Whittaker и соавт., 2003).
Трудности диагностики грибовидного микоза заключаются в разнообразии его клинических проявлений, а также их сходстве с проявлениями хронических воспалительных дерматозов (А.А. Каламкарян, 1983, И.Б. Трофимова, 1997, H.S. Zackheim и соавт., 2002). Более того, некоторые дерматозы имеют сходные с грибовидным микозом иммунопатологические механизмы, например псориаз, как Th1-опосредованное заболевание (E.W.Cowen и соавт., 2007, K. Ghoreschi и соавт., 2007).
Точность клинического диагноза ГМ, подтвержденного гистологическим методом, составляет от 50 до 75% (А.Н. Родионов, 1997, S.J. Whittaker и соавт., 2003). По данным G. Burg и соавт., точность иммунофенотипического исследования на поздних стадиях ГМ достигает 80% (G. Burg и соавт., 2005), однако на ранних стадиях заболевания точность диагностики оказывается ниже. Кроме того, все перечисленные методы диагностики требуют проведения биопсии кожи.
Для своевременной диагностики наиболее перспективным в настоящее время является поиск сывороточных биомаркеров (M.A. Tainsky, 2009). С этой целью успешно применяются протеомные технологии, которые представлены широким спектром различных методов. Одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия MALDI-TOF, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков (В.М. Говорун и соавт., 2002, T.C. Poon, 2007). Однако применение масс-спектрометрии ограничивается чувствительностью этого метода. Для изучения белков, представленных в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем находится порог чувствительности масс-спектрометрических методов, возможно применение технологии xMAP. Данный метод дает возможность проводить количественное определение десятков целевых белков одновременно. В качестве целевых белков в настоящем исследовании были выбраны цитокины, так как они играют ведущую роль в патогенезе грибовидного микоза. В этом случае продукция цитокинов осуществляется как атипичными лимфоцитами, так и различными иммунными клетками микроокружения. В отечественной литературе отсутствуют работы, выполненные с применением протеомных технологий при изучении различных аспектов грибовидного микоза, а количество работ иностранных исследователей весьма ограничено, что определило актуальность данного исследования.
Цель исследования: Установить молекулярные маркеры грибовидного микоза на основании результатов изучения протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови с целью разработки алгоритма диагностики заболевания.
Задачи исследования:
-
Провести анализ анамнестических данных больных грибовидным микозом для оценки своевременности диагностики данного заболевания
-
Исследовать протеомные профили сывороток крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров крови методом масс-спектрометрии MALDI-TOF
-
Изучить уровень цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с помощью технологии xMAP на различных стадиях заболевания
-
Провести сравнительное изучение протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров с целью выявления молекулярных маркеров грибовидного микоза
-
Разработать алгоритм диагностики грибовидного микоза на основании данных, полученных в результате исследования профилей белков и цитокинов сыворотки крови.
Научная новизна
- впервые в России изучен протеомный профиль сыворотки крови больных грибовидным микозом с применением метода MALDI-TOF масс-спектрометрии. При сравнении протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, больных псориазом и здоровых людей – доноров крови выявлены пики белков, которые достоверно отличаются у обследованных лиц.
- впервые изучен широкий профиль из 27 цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с применением технологии xMAP. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов IP-10 и IL-10, а также обратная корреляционная связь концентрации цитокина RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что подтверждает патогенетическую значимость данных цитокинов.
- впервые в сыворотке крови больных грибовидным микозом установлено достоверное увеличение концентрации цитокина IP-10 по сравнению с концентрацией этого цитокина у больных псориазом, а также увеличение концентрации цитокинов IP-10, IL-4, IL-1ra и G-CSF по сравнению с их концентрацией в сыворотке крови здоровых доноров. На основании проведенных исследований установлено, что цитокин IP-10 может использоваться в качестве диагностического маркера грибовидного микоза.
- впервые разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, обладающий высокой точностью и основанный на определении в сыворотке крови концентрации цитокина IP-10. При дифференциальной диагностике грибовидного микоза и псориаза алгоритм основывается на последовательном определении концентрации в сыворотке крови концентрации цитокинов IP-10 и IL-6 и имеет вид «древа принятия решений».
Практическая значимость:
В сыворотке крови обследованных больных выявлены молекулярные маркеры грибовидного микоза. С применением данных маркеров разработан алгоритм, позволяющий диагностировать грибовидный микоз и, в необходимых случаях, провести его дифференциальную диагностику с псориазом. Применение алгоритма диагностики грибовидного микоза позволит своевременно выявить больных «группы риска» по развитию данного заболевания для диспансерного наблюдения.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания у пациентов до постановки диагноза «грибовидный микоз» составляет от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом у 23,1% больных грибовидный микоз диагностируется на третьей стадии заболевания.
-
Выявлены масс-спектрометрические пики белков, являющиеся молекулярными маркерами грибовидного микоза. Точность диагностики с применением данных маркеров составляет 69-75%, качество диагностики по данным ROC-анализа расценивается как хорошее (AUK>0,7).
-
Выявлены 4 цитокина (IP-10, IL-4, IL-1ra и G-CSF), уровень экспрессии которых достоверно отличается у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови (р<0.05). Уровень экспрессии цитокина IP-10 у больных грибовидным микозом достоверно выше, чем у больных псориазом (р<0,001), что позволяет использовать его в дифференциальной диагностике этих заболеваний.
-
Установлена прямая корреляция концентрационная связь цитокинов IP-10 и IL-10 и обратная корреляционная связь цитокинов RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что свидетельствует об их патогенетической роли при данном заболевании.
-
Показана высокая точность разработанного алгоритма диагностики грибовидного микоза, а также возможность выявления с его помощью больных, относящихся к группам риска по развитию грибовидного микоза.
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ «Протеомные технологии в дерматовенерологии» (Москва, 2007 г.)
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в лекционный курс кафедры дерматовенерологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета и врачей ординаторов ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, из них 1 - в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК РФ.
