Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1.Эпндемнология атопического дерматита 10
1.2. Классификации и современные особенности течения атопического дерматита 11
1.3. Современные теории патогенеза атопического дерматита.. 15
1.3.1. Иммунопатогенетические механизмы развития атопического дерматита 17
1.3.2. Нарушение барьерной функции эпидермиса 19
1.3.3. Участие Т-лимфоцитов и сскретируемых ими цитокинов в развитии иммунного воспаления 21
1.4. Лечение больных атопическим дерматитом 23
1.4.1. Системная терапия 25
1.4.2. Наружная терапия 26
1.4.3. Фототерапия 28
1.5. Применеиие ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона в терапии больных атопическим дерматитом 29
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 35
2.1. Ход исследования 35
2.2.Критерин включения и исключения из исследования 36
2.3. Методы исследования 37
2.3.1. Определение тяжести клинических проявлений атопического дерматита с использованием индекса SCORAD 37
2.3.2. Изучение показателей клеточного иммунитета методом проточной цитофлуометрии 39
2.3.3. Иммуногистохимические исследования содержания CD4+, CD8+ лимфоцитов и уровня экспрессии у-интерферона в биоптатах кожи 40
2.4. Методы статистической обработки результатов исследования 42
ГЛАВА 3. Результаты исследования 43
3.1. Клиническая характеристика больных 43
3.2. Назначение терапии ультрафиолетовым излучением длиной волны 350-400 им больным атоническим дерматитом 49
3.3. Эффективность применения ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 им у больных атопичсским дерматитом 51
3.4. Результаты изучения показателей иммунного статуса больных в процессе проводимого лечения 62
3.5. Динамика содержания CD4+, CD8+ лимфоцитов и экспрессии у-интерферона в коже больных под действием терапии с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм 69
ГЛАВА 4. Заключение 80
Выводы 89
Практические рекомендации 91
Список литературы 92
- Классификации и современные особенности течения атопического дерматита
- Применеиие ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона в терапии больных атопическим дерматитом
- Определение тяжести клинических проявлений атопического дерматита с использованием индекса SCORAD
- Эффективность применения ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 им у больных атопичсским дерматитом
Введение к работе
Актуальность проблемы
Атопический дерматит (АтД) является хроническим рецидивирующим заболеванием кожи и представляет серьезную проблему для здравоохранения в связи с неуклонным ростом заболеваемости как на территории Российской Федерации, так и за рубежом (Балаболкин И.И. с соавт., 1999; Скрипкин Ю.К. с соавт., 1999; Кривонос О.В. с соавт., 2009; Asher M.I. et al., 2006).
Этиология АтД остается до конца не изученной. В патогенезе дерматоза, согласно современным представлениям, важную роль играют иммунные нарушения, характеризующиеся изменением соотношения Т-хелперов 2 типа (Т-х2) и 1 типа (Т-х1), приводящие к формированию в коже хронического воспаления с образованием в очагах поражения клеточных инфильтратов (Leung D.Y. et al., 2004; Darsow U. et al., 2009).
Применяемые в клинической практике медикаментозные методы терапии при среднетяжелом и тяжелом течении АтД недостаточно эффективны и не позволяют добиться ремиссии заболевания (Балаболкин И.И. с соавт., 1999; Скрипкин Ю.К. с соавт., 1999; Akdis C.A. et al., 2006; BuBmann C. et al., 2009).
К эффективным методам лечения АтД относятся некоторые методы ультрафиолетовой терапии: фотохимиотерапия, узкополосная средневолновая ультрафиолетовая терапия с длиной волны 311 нм (Каламкарян А.А. с соавт., 1986; Горячева Т.А., 2010; von Kobyletzki G. et al., 1999; Krutmann J., 2000; Valkova S. et al., 2004). Однако, их применение ограничено из-за наличия ряда противопоказаний и/или развития побочных эффектов (Каламкарян А.А. с соавт., 1986; Krutmann J., 2000; Ring J. et al., 2006; Kunisada M. et al., 2007).
В зарубежной литературе имеются публикации об эффективности использования в лечении больных АтД среднетяжелого и тяжелого течения заболевания дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии (УФА-1 терапия) - ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 340-400 нм (Krutmann J. et al., 1998; Dittmar H.C. et al., 2001; Dawe R.S., 2003; Polderman M.C., 2006; Rombold S. et al., 2008; Gambichler T., 2009;). В этих исследованиях клинический эффект достигался, в основном, при лечении пациентов высокими разовыми дозами излучения (130 Дж/см2), под влиянием которых в коже индуцируется апоптоз CD4+ лимфоцитов (Morita A. et al., 1997). Однако, безопасность применения таких больших доз УФА-1 излучения, в частности, канцерогенный потенциал и риск фотостарения кожи, окончательно не установлена. В экспериментальных исследованиях показано, что облучение лысых мышей альбиносов Skh-hr1 высокими дозами УФА-1 света может приводить к возникновению плоскоклеточного рака кожи (Sterenborg H.J., van der Leun J.C., 1990; Runger T.M., 1999).
О возможности использования низких и средних доз УФА-1 излучения в литературе имеются лишь единичные сообщения. Работ, посвященных изучению влияния низких и средних доз ультрафиолетового излучения длиной волны 340-400 нм на субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической крови больных АтД и показатели иммунного воспаления в коже, нами не обнаружено.
Все вышеперечисленное обуславливает актуальность, а также цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования
Оценить эффективность применения ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм в терапии больных атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения и его влияние на показатели клеточного иммунитета в периферической крови и очагах поражения кожи.
Задачи исследования
-
Оценить клиническую эффективность применения низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм в терапии больных атопическим дерматитом со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания.
-
Провести сравнительное изучение эффективности медикаментозной терапии больных и лечения с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм.
-
Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической крови и биоптатах пораженной кожи больных, а также его изменения в процессе проводимого лечения.
-
Исследовать в биоптатах кожи больных уровень экспрессии -интерферона до и после курса ультрафиолетовой терапии.
Научная новизна
Установлена высокая эффективность применения низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм в терапии больных атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения, а также хорошая переносимость данного метода лечения.
Дана сравнительная оценка терапии больных атопическим дерматитом с использованием ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм и медикаментозными средствами, показавшая более высокую эффективность фототерапии.
Получены новые данные о механизмах терапевтического действия ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм при атопическом дерматите. Выявлено ингибирующее влияние данного ультрафиолетового спектра на кожно-ассоциированные Т-хелперы и экспрессию -ИФН в очагах поражения. Уменьшение содержания Т-хелперов в пораженной коже коррелирует с регрессом клинических симптомов заболевания.
Установлено отсутствие негативного влияния ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона на показатели клеточного иммунитета в периферической крови пациентов.
Практическая значимость
Внедрение в клиническую практику метода терапии больных атопическим дерматитом среднетяжелого и тяжелого течения с применением ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм позволит повысить эффективность лечения, уменьшить частоту развития побочных эффектов и снизить количество назначаемых системных и наружных лекарственных средств.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Терапия с применением низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм является эффективным методом лечения больных атопическим дерматитом со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания.
-
Облучение пациентов ультрафиолетовым светом длиной волны 350-400 нм не оказывает влияния на показатели клеточного иммунитета в периферической крови больных атопическим дерматитом, за исключением снижения относительного содержания В-лимфоцитов.
-
Терапия с применением низких и средних доз ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона оказывает супрессивное действие на кожно-ассоциированные Т-хелперы, уровень которых значительно повышен в очагах атопического дерматита, по сравнению с кожей здоровых лиц.
-
Ультрафиолетовое излучение длиной волны 350-400 нм вызывает уменьшение продукции -интерферона в коже больных атопическим дерматитом, что способствует, таким образом, подавлению иммунного воспаления в очагах поражения.
Апробация работы
Основные положения доложены и обсуждены на II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007), III Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Казань, 2009), научно-практической конференции ФГУ «ЦНИКВИ Росздрава» (Москва, 2008; 2009).
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования используются в практической работе ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», клинике кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Росздрава.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них три в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 109 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав, содержащих описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 20 рисунками. Список литературы содержит 153 печатные работы, из них 41 отечественных и 112 зарубежных авторов.
Классификации и современные особенности течения атопического дерматита
В зарубежной литературе выделяют 2 формы АтД: экзогенную ("extrinsic"), ассоциированную с IgE-зависимой сенсибилизацией, и эндогенную ("intrinsic"), без IgE-зависимой сенсибилизации. Экзогенная форма АтД встречается у 70-80% пациентов АтД, а эндогенная - у 20-30% [102, 110].
Для оценки тяжести заболевания в 1994 году Европейской рабочей группой был предложен индекс SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis). Данный индекс включает в себя оценку врачом выраженности объективных (интенсивность и распространенность кожного процесса) и пациентом субъективных (нарушение сна и выраженность зуда) критериев тяжести АтД [135].
Клиническая картина АтД изменяется в возрастные периоды жизни пациента [2, 8]. У детей в возрасте до 2-х лет процесс носит экссудативный характер, при этом, отмечается острая или подострая воспалительная реакция. Наиболее часто проявления заболевания располагаются симметрично на коже лица, особенно на коже щек, на шее, разгибательной иоверхносги конечностей и характеризуются эритематозно-отечными очагами с нечеткими границами, моюгутием, образованием чешуек и серозных корок, папулами, везикулами. У большинства больных периорбитальная область, носогубный треугольник и подбородок сначала свободны от высыпаний [35].
У детей старше двух лет и взрослых течение АтД носит хронический рецидивирующий характер, острые воспалительные реакции и экссудация менее выражены. Высыпания наиболее часто локализуются симметрично на коже в локтевых и подколенных складках, сгибательных поверхностях голеностопных и лучезапястных суставов, шее. Кожа лица свободна от высыпаний, но могут сохраняться хейлит, периорбитальная инфильтрация. Отмечается появление у некоторых больных симптома Денни-Моргана -формирование дополнительной складки нижнего века. Кожа в очагах воспаления представлена эритемой, папулами, шелушением, появляется утолщение кожи в очагах поражения (инфильтрация), местами усилениется кожного рисунка (лихснизация), отмечаются множественные экскориации [32, 35]. При регрессе высыпаний на месте очагов поражения остаются участки гипо- или гиперпигментации.
В течение заболевания выделяют стадии обострения, полной и неполной ремиссии [2]. Период обострения у больных АтД характеризуется островоспалительной реакцией кожи и клинически представлен сильно зудящими эритематозными очагами с серозной экссудацией, папулами, множественными экскориациями. В период неполной ремиссии у больных АтД наблюдают уменьшение симптомов острого воспаления кожи с сохранением ее сухости, очагов поражения с преобладанием инфильтрации, лихенизации, шелушения. При полной ремиссии у больных АтД симптомы заболевания полностью отсутствуют [2,32, 35].
Морфологические изменения в коже больных АтД зависят от стадии заболевания. В период обострения очаги поражения характеризуются выраженным внутриклеточным отеком (спонгиозом) и рассеянными клеточными инфильтратами в эпидермисе, состоящими преимущественно из Т-лимфоцитов. В дерме имеются выраженные периваскулярные воспалительные клеточные инфильтраты из большого количества Т-лимфоцитов и немногочисленных моноцитов, макрофагов и тучных клеток, находящихся в различных фазах дегрануляции. Эозинофилы, базофилы и нейтрофилы редко встречаются в очагах поражения в период обострения [39, 102]. Лимфоцитарный инфильтрат содержит CD3, CD4, CD45RO [49, 102].
В очагах поражения с лихенификацией. гистологически отмечается акантоз эпидермиса с удлинением межсосочковых выростов, выраженный гиперкератоз и незначительный спонгиоз. Наблюдается увеличение числа IgH-секретирующих клеток Лангерганса в эпидермисе и преобладание макрофагов в дермальных мононуклеарных клеточных инфильтратах. В очагах поражения в хроническую фазу воспаления в дерме обнаруживается увеличение числа эозинофилов и тучных клеток с заполненными гранулами [39, 102].
Визуально неизмененная кожа у пациентов АтД характеризуется наличием умеренного гиперкератоза и редких перйваскулярных клеточных инфильтратов, состоящих преимущественно из Т-лимфоцитов [39,49, 125].
В 1980г. Hanifin JM. и Rajka G. предложили диагностические критерии АтД, которые были подразделены па большие и малые [77]. К большим критериям были отнесены зуд, характерные поражения кожи, расположенные на сгибательных поверхностях конечностей у взрослых, а на лице и разгибательных поверхностях конечностей у детей, хроническое рецидивирующее течение заболевания, наличие атопических заболеваний у пациента и/или его родственников. Малыми критериями считались: 1) признаки так называемого «атопического лица» (бледность или эритема лица, гипопигментированные пятна, потемнение периорбитальной области, инфраорбитальиая складка Денни-Моргана, . хейлит, рецидивирующий конъюктивит, складки передней поверхности шеи);- 2) факторы, провоцирующие АтД (пищевые продукты, эмоциональный стресс, факторы окружающей среды, кожные раздражители, такие как шерсть, растворители, пот); 3) осложнения АтД (тенденция к развитшо кожных вирусных и бактериальных инфекций, нарушения клеточного иммунитета, реакция немедленного типа в кожном тесте, повышенный уровень Ig Е в сыворотке крови, кератоконус, передняя субкапсулярная катаракта); 4) другие факторы (ранее начало заболевания, сухая кожа, ихтиоз, белый дермографизм, исчсрчсиность ладоней, фоликуллярный кератоз, дерматит ладоней и стоп, экзема сосков молочных желез, перифолликулярное подчеркивание). Для постановки диагноза АтД требовалось наличие 3 главных и 3 дополнительных критериев [77].
Применеиие ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона в терапии больных атопическим дерматитом
В 1981г. Muszhas MF. с соавт. опубликовали сообщение о создании ламп с новыми фильтрами, излучякшшми ультрафиолетовый свет спектра А в диапазоне 340-400 нм. Данные лампы были созданы для изучения фотобиологического действия ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 340-400 нм на кожу человека [108]. В 1992 Krutmann J. с соавт. впервые оценили эффективность ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона (дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии) при лечении больных с обострением АтД [94].
В настоящий момент под дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапией понимают воздействие ультрафиолетовым светом с длиной волны равной 340-400 нм [51, 59, 93, 119]. Описаны три различных способа применения УФА-1 терапии в зависимости от величины разовой и/или кумулятивной дозы: высокими, средними и низкими дозами. УФА-1 терапию высокими дозами проводят с использованием разовой дозы равной 90-130 Дж/см2 и кумулятивной дозы - 975-1840 Дж/см2. УФА-1 терапия средними дозами подразумевает лечение разовыми дозами 20-90 Дж/см2, при этом, кумулятивная доза на один курс лечения составляет 300-975 Дж/см2. При применении низких доз УФА-1 терапии используется разовая доза не более 20 Дж/см , а кумулятивная - не более 300 Дж/см [51].
Впервые Krutmann J. с соавт. (1992 г.) показали эффективность УФА-1 терапии у пациентов АтД, используя высокие дозы облучения (130 Дж/см2, общая кумулятивная доза 1950 Дж/см2) [94]. Tzaneva S. с соавт. (2001 г.) сравнили эффективность УФА-1 терапии высокими (130 Дж/см2) и средними (30 Дж/см2) дозами. По результатам исследования было показано, что эффективность изучаемых доз УФА-1 терапии сопоставима, при этом, рецидив заболевания возникал в среднем через 4 недели и не зависел от ранее полученной дозы облучения [145]. Позже, в исследовании Von Kobyletzki G. с соавт. (1999 г.), было продемонстрировано, что средние дозы УФА-1 (разовая доза 30 Дж/см2, кумулятивная доза 750 Дж/см2) также эффективны в лечении больных АтД, что проявлялось достоверным снижением индекса SCORAD [149]. Kowalzick L. с соавт. (1995 г.) установили, что УФА-1 терапия средними [104]. В 2010 году Tzancva S. с соавт. показали, что ПУВЛ-терапия более эффективна, чем УФА-1 терапия средними дозами в терапии больных с тяжелым течением АтД [144].
Тем не менее, на фоне дальней длинноволновой ультрафиолетовой терапии также могут наблюдаться побочные эффекты. Ранними побочными эффектами УФА-1 терапии высокими дозами являются развитие эритемы, пигментации, буллезиых высыпаний [59, І28]. Отдаленными побочными эффектами данного вида физиотерапевтического воздействия могут быть фотостарсние и развитие рака кожи [59, 93]. Так, Dawe R.S. был описан случай развития меланомы спустя 18 месяцев после окончания лечения пациента с пигментной крапивницей, который получал УФА-1 и ПУВА-терапию, хотя убедительных прямых доказательств влияния лечения на появление меланомы не было обнаружено [59]. В экспериментальных исследованиях было показано, что облучение лысых мышей альбиносов Skhhr-1 высокими дозами УФА-1 приводило к развитию базалыю-клеточного рака кожи [127, 139]. Mempel М. с соавт. (2000 г.) установили, что после 15 процедур УФА-1 терапии средними дозами 50 Дж/см2 (кумулятивная доза 750 Дж/см2) в коже больных АтД наблюдалось изменение метаболизма коллагена I и III типа [106].
Механизм действия УФА-1 терапии на кожный патологический процесс при АтД остается не до конца изученным. Morita А. с соавт.(1997 г.) считают, что излучение УФА-1 диапазона проникает в дермальный слой кожи глубже, чем излучение УФВ-диапазона [107]. По данным Bruls с соавт. (1984 г.) УФА-1 излучение проникает в дерму на глубину до 30%, в то время как, УФВ с длиной волны 290-320 нм - только до 10% [68].
Известно, что у больных АтД в очагах поражения наблюдается формирование клеточных инфильтратов в дерме, состоящих преимущественно из Т-лимфоцитов [102]. Под воздействием УФА-1 терапии происходит регресс клеточных инфильтратов в дерме [95]. Действие УФА-1 терапии обусловлено генерацией синглетного кислорода, приводящей к раннему апоптозу Т-лимфоцитов. В экспериментальных исследованиях Morita А. и соавт. (1997 г.) показали, что под влиянием сииглетиого кислорода в облученных Т-лимфоцитах происходит активация системы Fas/Fas-ligand, вызывающая программированную гибель клеток in vitro. Под воздействием УФА-1 терапии высоко специфично развитие раннего апоптоза [107]. Для его осуществления не требуется синтеза белков, в отличие от апоптоза, возникающего при использвании ПУВА-терапии [68, 96].
Существуют единичные сообщения об изучении механизмов клеточного иммунитета в коже больных АтД под влиянием УФА-1 терапии. По данным Mang R. с соавт. (1995 г.) под воздействием высоких доз УФЛ-1 терапии наблюдается исчезновение Т-лимфоцитов из очагов поражения при АтД, что сопровождается снижением уровня у-ИФН in situ и клинически соответствует ремиссии заболевания [105]. Grewe М. и соавт. (1994г.) выявили в очагах поражения больных АтД высокий уровень кодирующей у-ИФН мРНК, достоверно снижающийся после проведения курса УФА-1 терапии высокими дозами [72]. В дальнейшем опыте in vitro эти авторы, облучая культивируемые нормальные человеческие кератиноциты ультрафиолетовым излучением УФА-1 диапазона, показали, что снижение продукции у-ИФН Т-xl связано с индуцированием экспрессии мРНК ИЛ-10 и его секрецией кератиноцитами [73].
По данным Grabbe J. и соавт. (1996 г.), Dumay О. с соавт. (2001 г.) УФА-1 терапия высокими дозами также способна снижать количество и активность клеток Лангерганса в коже больных АтД [62, 70].
Определение тяжести клинических проявлений атопического дерматита с использованием индекса SCORAD
У 15 больных АтД, получавших лечение ультрафиолетовым излучением длиной волны 350-400 им, проводилось исследование показателей клеточного иммунитета в периферической крови до начала лечения и после его завершения. Группу сравнения составили 16 здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту с обследуемой группой.
Кровь для исследования забирали в утренние часы (между 9 и 10 часами) из периферической вены в области локтевой ямки, в количестве 2 мл самотеком в пробирку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Полученные образцы крови хранили при комнатной температуре и подвергали дальнейшей обработке не позднее, чем через 3 часа от момента забора крови.
Обработка образцов проводили согласно протоколу, рекомендованному фирмой Beckman Coulter, США.
В каждую из 7 пробирок помешалось 100 мкл крови и по 10 мкл одного из следующих типов моноююнальных антител: CD45/14, IgGl-FlTC/IgG-PE, CD3/CD19, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/MLA-DR, CD3/CD(16+56) (Beckman Coulter, США), которые осторожно перемешивали на приборе Vortex (Beckman Coulter, США). В дальнейшем осуществляли инкубацию в течение 20 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте, затем проводили лизис эритроцитов в каждой пробирке реагентом Immunoprep (Beckman Coulter, США), состоящим из трех компонентов: муравьиной кислоты, углекислого натрия и полиоксиметилена (параформальдегида) по 350, 160 и 70 мкл, соответственно.
Цитофлуометричсский анализ. В ходе работы проводили оценку абсолютных (количество клеток в 1 мкл) и относительных значений (процентное содержание) показателей иммунного статуса: В-лимфоцитов (CD3-CD19+), Т-лимфоцитов (CD3+CD19-), Т-хелперов (CD3+CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+), Т-лимфоцитов с функцией естественных киллеров (CD3+CD16+/56+), натуральных киллеров (CD3-CD16+/56+), соотношения Т-хелперов к цитотоксическим Т-лимфоцитам. Связывание меченных антител с клетками крови измеряли методом проточной цитофлуометрии на цитофлуометре EPICS XL (Beckman Coulter, США) с использованием программного обеспечения System II. Перед началом исследований с целью верификации и регулировки струйной автоматики выполняли контрольную оценку работы методом автостандартизации прибора с использованием флуосфер Flow-Check (Beckman Coulter, США). Затем приступали к выполнению измерений.
Забор биоптатов кожи у 15 больных АтД до лечения проводили из эритематозно-сквамозных очагов поражения, а после завершения лечения — из участков кожи, располагавшихся рядом с местом предыдущей биопсии. В контрольную группу были включены 7 здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту с исследуемой группой. Полученные биоптаты кожи фиксировали в 10% растворе формалина.
Далее их заливали в парафиновые блоки, из которых на микротоме Leica RM2125RT изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Срезы растягивали на предметных стеклах с полилизиновым покрытием, помещая их на нагревательный столик. Подготовленные препараты сушили в термостате.
Для иммуногистохимического исследования биоптатов кожи после процедуры дспарафинизации в 3-х сменах ксилола и 3-х сменах этилового спирта срезы подвергали регидратации, затем промывали в проточной воде. Антигенную демаскировку проводили, помещая препараты в цитратный буфер. С целью предотвращения неспецифического окрашивания на срезы наносили иероксидазный и протеиновый блоки Peroxydase Detection System (Novocastra Lab. LTD, Великобритания). Для проведения иммуногистохимической реакции срезы кожи инкубировали с моноклональными антителами CD4, CD8 (Novocastra Lab. LTD, Великобритания) в рабочем разведении 1:150 при комнатной температуре и антителами у-ИФИ (Abbiotec LLC, США) в рабочем разведении 1:200 при комнатной температуре. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали стрептавидин-биотиновую систему («Novocastra» RTU, Novocastra Lab. LTD, Великобритания). Затем препараты докрашивали гематоксилином, подвергали процедуре дегидратации в этиловом спирте, дифференцировке в ксилоле и заключали под покровное стекло посредством монтирующей среды для гистологических препаратов. В дальнейшем проводилось изучение полученных препаратов в световом микроскопе «Leica DM 4000В», для документирования результатов исследования использовали цифровую камеру «Leica DFC 320».
В эпидермисе количество CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов изучали из расчета на 100 клеток базального слоя, а оценку уровня экспрессии у-ИФН определяли по наличию или отсутствию положительно окрашенных клеток. В дерме подсчет количества CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, а также клеток, содержащих у-ИФН, в очагах поражения производили в 5 полях зрения, равных по площади 0.3 мм2. Затем считали средние значения абсолютного содержания CD4+, CD8+ лимфоцитов, клеток, содержащих у-ИФН, для каждого препарата. По всем показателям рассчитывали разность между значениями до и после окончания лечения, которую обозначали греческой буквой «дельта» (Д).
Обработка полученных данных проводилась на персональном IBM совместимом компьютере с процессором Intel Pentium М 740 с использованием пакета статистических программ «Sigma Stat» версия 3.1 и «Statistica» версия 6,0. Для параметрического анализа использовали парный и непарный t-критерий Стьюдента. Анализ динамики показателей в группах после лечения выявляли с помощью парного непараметрического метода Уилкоксона. Для оценки достоверности межгрупновых различий применяли непарный непараметрический метод анализа Манн-Уитни. Различия по частоте встречаемости признака между группами больных определяли при помощи метода х2 либо точного критерия Фишера. Корреляционный анализ проводили с применением критерия Спирмена [6]. Результаты анализа представлены в виде: медиана (25 процентиль - 75 процентиль) либо среднее по іруппе значение ± стандартное отклонение измеренных значений. Различия считали достоверными при р 0,05.
Эффективность применения ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 им у больных атопичсским дерматитом
В ходе выполненного нами исследования установлена эффективность УФА-1 терапии в лечении больных, страдающих среднетяжелым и тяжелым течением АтД. После курса проведенного ультрафиолетового лечения объективно наблюдали регресс эритемато-сквамозных очагов поражения, значительное уменьшение инфильтрации и лихенизации, уменьшение площади поражения кожи, субъективно пациенты отмечали снижение интенсивности зуда или его полное исчезновение, улучшение сна. Данные изменения, наблюдаемые при выполнении работы, были подтверждены статистически достоверным снижением индекса SCORAD в 4,3 раза (с 71,3±11,2 до начала исследования до 16,4±9,9 при его окончании).
В основной группе больных АтД после УФА-1 терапии отмечалось статически достоверное (р 0,001) снижение индекса SCORAD 16,4±9,9 по сравнению с индексом SCORAD 28,2±11,4 больных АтД, получавших медикаментозную терапию.
Также уставлено, что под влиянием УФА-1 терапии у больных со среднетяжелым течением АтД индекс SCORAD статистически достоверно (р 0,001) снижался в 4,8 раза (на 79,2%), а у больных с тяжелым течением АтД данный индекс снижался в 3,9 раза (на 74,5%) по сравнению с аналогичным показателем до начала лечения.
Установлено, что назначение терапии низкими и средними дозами ультрафиолетового излучения УФА-1 диапазона с длиной волны 350-400 нм больным АтД сред нетяжел ого и тяжелого течения позволило достигнуть клинического выздоровления (полной ремиссии заболевания) у 31 пациентов (50,0%). Улучшение после проведенного лечения наблюдали еще у 28 больных (45,2%).Эффект от проводимого лечения отсутствовал лишь в трех случаях (4,8%). Таким образом, положительный эффект от УФА-1 терапии был зарегистрирован у 59 больных, что составило 95,2% от всех пролеченных нами пациентов УФА-1 терапией.
В ходе проведения настоящего исследования ни у одного из пациентов не было зарегистрировано серьёзных побочных эффектов (в том числе, эритемы и пузырей), возникновение которых потребовало бы отмены УФА-1 терапии.
Из побочных эффектов данного вида физиотерапевтического лечения наблюдали только усиление сухости кожи у 23 больных (38,3%), которое корректировалось назначением увлажняющих смягчающих средств. Фотоиндуцированную пигментацию кожи (загар) после курса терапии ультрафиолетовым излучением длиной волны 350-400 нм наблюдали у большинства пролеченных больных. Вторичная гиперпигментация реірессировала через 2-3 месяца после окончания лечения.
Для лечения больных АтД в ранее опубликованных работах использовались следующие разовые дозы УФА-1 излучения: высокие - 130 Дж/см2, средние - 30-65 Дж/см и низкие 20 Дж/см2 [61, 95, 149]. При этом было продемонстрировано, что низкие дозы УФА-1 терапии были менее эффективны по сравнению с высокими и средними [61].
Разовые дозы ультрафиолетового излучения с длиной волны 350-400 нм, использованные в нашем исследовании, находились в пределах от 20 до 40 Дж/см2, и в среднем составили 24,7±5,9 Дж/см2. Таким образом, разовые дозы, применявшиеся нами, занимали промежуточное положение между методами УФА-1 терапии, использующими средние и низкие разовые дозы. Как следствие этого, средняя кумулятивная доза, использованная нами для лечения больных АтД (395,7±125,3 Дж/см2), также занимала промежуточное положение между методами УФА-1 терапии с низкой и средней кумулятивными дозами [61].
Полученные нами данные свидетельствуют о высокой эффективности применения у больных среднетяжелого и тяжелого течения АтД разовых доз УФА-1 излучения от 20 до 40 Дж/см2. Го есть, при снижении разовых доз до 20-40 Дж/см2 положительный эффект при облучении УФА-1 светом сохраняется.
Во всех приведенных выше работах количество процедур для каждого включенного пациента было одинаковым и составляло 15 процедур на один курс УФА-1 терапии. Нами был использован индивидуальный подход с учетом возраста пациента и оценки динамики кожного процесса.
Известно, что в патогенезе АтД важная роль отводиться нарушениям иммунной системы. Для оценки системного влияния ультрафиолетового излучения длиной волны 350-400 нм на показатели клеточного иммунитета у больных со среднетяжелыми и тяжелыми формами АтД нами было проведено исследование субпопуляций Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-лимфоцитов с функцией натуральных киллеров, натуральных киллеров, Т-активированных лимфоцитов крови перед назначением курса УФА-1 терапии и непосредственно после нее.
До лечения у пациентов, страдающих АтД, наблюдали статически достоверное увеличение процентного содержания Т-хелперов и В-лимфоцитов и достоверное уменьшение абсолютного количества и процентного содержания натуральных киллеров и Т-лимфоцитов с функцией натуральных киллеров.
Полученные нами результаты не противоречат опубликованным ранее работам отечественных и зарубежных авторов. По данным Сергеева Ю.В. (1990г.) в периферической крови у больных АтД наблюдалось увеличение субпопуляции Т-х2, понижением уровня CD8+ лимфоцитов и Т-х1 [31]. Farrell A.M. с соавт. (2001г.) в периферической крови больных АтД наблюдали статически достоверное увеличение концентрации CD4+/IL-4+ и CD4+/IL-13+ и уменьшение содержания CD4+/IFN-gamma+ и CD8+/TNF-alpha+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми добровольцами [64]. Результаты нашего исследования также согласуются с данными, полученными в работах Leung Donald Y.M., Ring J. etal. [101, 125].
