Введение к работе
Актуальность проблемы.
Урогенитальная хламидийная инфекция (УГХИ), вызываемая Chlamydia trachomatis, в настоящее время является наиболее распространенной среди всех инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) в мире и, по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ, 2011), составляет до 70% в структуре ИППП. В Российской Федерации показатели заболеваемости урогенитальным хламидиозом в последние годы находились на втором месте после заболеваемости урогенитальным трихомониазом, составляя 61,4 на 100 тыс. населения в 2012 году.
Социально-экономическое значение УГХИ обусловлено не только высокими показателями заболеваемости, но и значительным риском развития серьезных осложнений, таких как воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), отрицательно влияющих на репродуктивную функцию, вплоть до развития бесплодия. Исследования показали, что с данной проблемой сталкиваются от 8% до 15% супружеских пар репродуктивного возраста, таким образом, при расчете на общую популяцию в мире насчитывается более 100 млн. бесплодных супружеских пар. При этом, именно ИППП, в том числе УГХИ, признаны основной предотвратимой причиной бесплодия, особенно у женщин (ВОЗ, 2011).
Исследования экономической эффективности мероприятий по обследованию и лечению больных УГХИ в развитых странах демонстрируют, что наилучшей стратегией профилактики развития осложненных форм является ранняя диагностика и лечение неосложненной инфекции, в связи с чем становится очевидной необходимость создания диагностических методов и тест-систем для выявления и прогнозирования развития осложнений заболевания с целью предотвращения их развития.
Развитию осложнений УГХИ способствует частое бессимптомное или малосимптомное течение заболевания, что приводит к несвоевременному обращению за медицинской помощью. При этом, различные особенности течения и клинических проявлений УГХИ может быть связано с генетически детерминированными факторами, зависящими от организма человека или патогена.
В настоящее время активно разрабатываются основы профилактической (предиктивной) медицины, фундамент которой составляет тестирование генов предрасположенности к заболеваниям (Баранов В.С. с соавт., 2001; Caput J. et al. 2006). Изучение полиморфизма генов человека, в том числе однонуклеотидных замен (SNP-single nucleotide polymorphism), которые приводят к изменению экспрессии белков, является перспективным направлением современных исследований по определению механизмов развития мультифакториальных заболеваний. Одно из направлений исследований посвящено изучению ассоциаций между полиморфизмом в регуляторных областях генов, кодирующих про- и противовоспалительные цитокины человека, и предрасположенностью к развитию осложнений различных заболеваний. В процессе изучения генов, кодирующих цитокины, у женщин при ВЗОМТ и трубном бесплодии, ассоциированных с урогенитальной хламидийной инфекцией, больше всего информации получено о полиморфизме гена IL10. Именно индивидуальные различия цитокинового профиля и полиморфизм в регуляторных областях гена, кодирующего противовоспалительный цитокин IL10, как считают исследователи, приводят к различному течению воспалительного процесса (острому или латентному) (Hvid M. et аl 2007, Couper KN et. al., 2008; hman H. et al. 2009). Кроме того известно, что однонуклеотидные замены IFN+874(АА) и IL6 -174(CC), приводящие к низкой выработке INF и IL6 соответственно потенциируют переход заболевания в хроническую форму и повышают риск развития фиброза в маточных трубах, что может привести к трубному бесплодию (Rasouli M., Kiany S., 2007; hman H. et al. 2009). Повышенная продукция TGF, которая детерминирована полиморфизмом гена, его кодирующего, также может приводить к развитию фиброза в воспаленных тканях. Полиморфизм в гене MBL, кодирующем важный фактор врожденного иммунитета - белок MBL (mannose binding lectin; лектин, связывающий маннозу) может способствовать развитию повреждений маточных труб при инфекционном процессе, причиной которого является C. trachomatis (Sziller et аl., 2007).
Исследования полиморфизма генов, кодирующих цитокины, а также уровня экспрессии цитокинов у женщин, больных хламидийной инфекцией, в Российской Федерации до настоящего времени не проводились.
Изучение механизмов развития заболеваний, вызванных микроорганизмами, требует учитывать и свойства патогена, в том числе генетические, при этом наибольшее внимание уделяется изучению белков бактерий, механизмов регуляции работы генов, микробных ассоциаций (симбиоза) и взаимодействия с организмом человека (www. Genomestolife.org).
Имеющиеся сообщения о взаимосвязи клинических особенностей и течения УГХИ и сероваров C. trachomatis (вариабельность гена ompA) носят противоречивый характер. Типирование хламидий на основании изучения вариабельности гена ompA применяется в основном для эпидемиологических исследований, позволяя получать данные о распределении сероваров C. trachomatis среди разных популяций и/или выборок населения из различных стран (Brunelle G.W. et al., 2006; Geisler W. M. et al. 2008; Binet R. et al., 2009). В то же время ведется активный поиск других значимых участков генома C. trachomatis, вариабельность которых могла бы предопределять особенности клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции. В качестве факторов, влияющих на характер клинического течения инфекционного процесса, могут выступать генетически детерминированные факторы вирулентности хламидий. Одними из таких факторов являются tarp и сt 135. Ген СТ135 является регуляторным геном, который стимулирует экспрессию каскада генов в ответ на внешнее воздействие, влияя на вирулентность хламидий ( et.al., 2010). Ген tarP кодирует один из трех хламидийных белков, секретируемых в цитоплазму клетки-хозяина в процессе развития инфекционного процесса (Erica I.L., 2010).
Распределение сероваров и генетической вариабельности C. trachomatis в различных выборках населения России до настоящего времени практически не изучено.
Таким образом, в настоящее время поиск факторов, влияющих на течение инфекционных заболеваний, ведется одновременно в двух направлениях: изучение генетических особенностей человека (полиморфизмы различных генов) и патогена (генетические факторы вирулентности). Факторы вирулентности C. trachomtis и иммунного ответа могут рассматриваться в качестве детерминант риска развития ВЗОМТ и трубного бесплодия, а также являются основой персонализированной тактики ведения больных. При этом вопросы прогнозирования клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции на основании изучения полиморфизмов генов на данный момент изучены недостаточно.
Цель исследования. Разработка научно-обоснованной тактики ведения женщин, больных урогенитальной хламидийной инфекцией, на основании определения индивидуальных молекулярных предикторов развития осложнений заболевания у человека и изучения генетической вариабельности C. trachomatis.
Задачи исследования:
-
Изучить современные клинические особенности урогенитальной хламидийной инфекции у женщин и факторы риска развития осложненных форм заболевания.
-
Установить молекулярно-генетические предикторы развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции у женщин и разработать способ молекулярной диагностики индивидуального риска развития осложнений заболевания на основании изучения частоты выявления однонуклеотидных полиморфизмов генов цитокинов IL10, TGF1, IFN, IL6, TNFA, а также MBL2.
-
Определить иммунологические факторы риска развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции у женщин на основании изучения уровня экспрессии цитокинов (IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, TNF, INF, GM-CSF), а также MBL в крови и цервикальном секрете женщин.
-
Провести анализ взаимосвязи между генетическими вариантами C. trachomatis и особенностями клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции на основании изучения генотипов C. trachomatis (гены ompА, ct135, tarp).
-
Разработать персонифицированную тактику ведения женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией на основании оценки индивидуального риска развития осложнений и определения генетических вариантов С. trachomatis.
Положения, выносимые на защиту.
Положение I: Заболевания слизистой оболочки шейки матки и воспалительные заболевания органов малого таза в анамнезе повышают риск развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции. Осложненные формы УГХИ у женщин чаще, чем неосложненные, сопровождаются отсутствием клинических и лабораторных признаков воспалительной реакции.
Положение II: Индивидуальными генетическими предикторами воспалительных заболеваний органов малого таза как осложнений урогенитальной хламидийной инфекции у женщин являются генотип IL6 *-174 С/С и генотип TGF1 *-915 G/С. Предикторами развития вторичного (трубного) бесплодия как осложнения урогенитальной хламидийной инфекции, являются генотипы IL6 *-174 С/С; IL10*-592C/C; IFN*+874 Т/Т.
Положение III: Индивидуальными иммунологическими факторами риска развития воспалительных заболеваний органов малого таза и/или вторичного (трубного) бесплодия, как осложнений урогенитальной хламидийной инфекции, являются изменения концентраций про- и противовоспалительных цитокинов в крови (IL2, IFN, IL10) и цервикальном секрете (IL2 и IFN).
Положение IV: Инфицирование сероварами D, G, J C. trachomatis ассоциировано с риском развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции.
Положение V: Рекомендации по ведению пациенток, больных урогенитальной хламидийной инфекцией, определяют тактику диагностики и терапии заболевания в зависимости от наличия или отсутствия клинико-лабораторных и инструментальных признаков воспалительных заболеваний органов малого таза, индивидуальных иммунологических и молекулярно-генетических предикторов развития осложнений заболевания.
Научная новизна.
Проведение сравнительного анализа клинико-лабораторных признаков хламидийной инфекции нижних отделов мочеполового тракта и хламидийной инфекции органов малого таза у женщин позволило установить, что осложненные формы достоверно чаще, чем неосложненные сопровождались субъективными проявлениями заболевания (у 91,3% и 33,3% обследованных соответственно, р<0,05) при отсутствии объективных клинических (у 39,1% и 19,4% обследованных соответственно, р<0,05) и лабораторных (у 56,5% и 27,8% обследованных соответственно, р<0,05) признаков воспалительной реакции.
Впервые на основании анализа распределения однонуклеотидных полиморфизмов генов, кодирующих про- и противовоспалительные цитокины, у женщин с различным клиническим течением урогенитальной хламидийной инфекции, а также с вторичным (трубным) бесплодием и хламидийной инфекцией в анамнезе установлено, что индивидуальными генетическими факторами риска развития осложнений хламидийной инфекции являются полиморфизмы: TGF1 *-915 G/С, IL6 *-174 С/С; IL10*-592 C/C; IFN*+874 Т/Т. Разработан способ молекулярной диагностики риска развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции у женщин, основанный на определении полиморфизма фрагментов генов цитокинов человека (генотипа IL6 *-174 С/С и генотипа TGF1 *-915 G/С), позволяющий персонализировать тактику ведения больных урогенитальной хламидийной инфекцией с целью предотвращения развития осложнений заболевания.
Впервые на основании иммунологических исследований, проведенных с использованием технологии хМАР, установлено, что изменения показателей концентрации цитокинов IL2, IFN, IL10 в крови (выше 2,83 пг/мл; 9,4 пг/мл; 4,07 пг/мл соответственно) и цервикальном секрете (IL2 - выше 4,07 пг/мл и IFN – ниже 18,23 пг/мл) являются индивидуальными иммунологическими факторами риска развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции.
Впервые на основании результатов молекулярно-генетического изучения C.trachomatis по генам ompА, ct135 и tarр установлена взаимосвязь между частотой идентификации сероваров C. trachomatis и развитием осложнений урогенитальной хламидийной инфекции: серовары G, D, J достоверно чаще выявлялись у больных хламидийной инфекцией органов малого таза (70,0%), чем у больных хламидийной инфекцией нижних отделов мочеполового тракта (25,0%, р<0,05).
Впервые с учетом индивидуальных иммунологических и молекулярно-генетических факторов риска развития осложнений, а также генетических особенностей C. trachomatis, разработаны рекомендации по ведению женщин, больных урогенитальной хламидийной инфекцией, позволяющие предотвратить развитие осложнений.
Разработано новое направление в дерматовенерологии, заключающееся в персонализированном подходе к ведению женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией с учетом генетической и иммунологической предрасположенности к развитию осложненных форм заболевания, а также определения сероваров C. trachomatis.
Практическая значимость.
Изучение особенностей течения и клинических проявлений урогенитальной хламидийной инфекции у женщин позволило установить, что осложненные формы урогенитальной хламидийной инфекции могут сопровождаться отсутствием клинических и лабораторных признаков воспалительной реакции.
Разработаны рекомендации по ведению женщин, больных урогенитальной хламидийной инфекцией, основанные на определении молекулярно-генетических и иммунологических факторов риска развития осложнений, позволяющие персонализировать терапию больных.
Результаты проведенных исследований являются основой для разработки и внедрения в практическую деятельность клинических лабораторий медицинских организаций дерматовенерологического профиля диагностическая тест-система в формате Real-time-PCR для идентификации полиморфизмов генов цитокинов (генотипа IL6 *-174 С/С и генотипа TGF1 *-915 G/С), что позволит осуществлять своевременное выявление предикторов осложнений урогенитальной хламидийной инфекции у женщин.
Внедрение результатов диссертации в практику. Основанные на результатах диссертации рекомендации используются в работе отдела инфекций, передаваемых половым путем, и отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и дерматозов ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России.
Результаты проведенного исследования внедрены в учебный процесс кафедры дерматовенерологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова», кафедры кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО Саратовского государственного медицинского университета имени В.И.Разумовского, подготовки клинических ординаторов ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России по специальности «Дерматовенерология», кафедры дерматовенерологии, микологии и косметологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», кафедры дерматовенерологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ГБОУ ВПО «Иркутский медицинский университет».
На основе полученных результатов исследования полиморфизма генов, кодирующих цитокины, разработаны критерии диагностики риска развития осложнений УГХИ у женщин; заявка на изобретение «Способ молекулярной диагностики генетического риска развития нарушений репродуктивной функции, ассоциированных с урогенитальной хламидийной инфекцией у человека» (№2012141489; приоритет от 28.09.2012 г).
Апробация работы.
Результаты проведенного исследования доложены на:
-
XI Всероссийском Съезде дерматовенерологов и косметологов, 9-12 ноября 2010, г. Екатеринбург.
-
4-ом Всероссийском Конгрессе дерматовенерологов, июль 2011, г. Санкт-Петербург.
-
26th IUSTI-EUROPE Congress, September 2011. Riga, Latvia.
-
XII Всероссийском Съезде дерматовенерологов и косметологов, 26-29 июня 2012, г. Москва
-
27th IUSTI Europe Congress, 6-8 September 2012, Antalya, Turkey.
-
На заседании Московского общества дерматовенерологов, декабрь 2012 г.
-
V Всероссийском Конгрессе дерматовенологов и косметологов, 17-20 сентября 2013, г.Казань.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них в рецензируемых научных изданиях - 16.
Личный вклад автора в проведенное исследование.
Автором проведен анализ российских и зарубежных источников литературы по теме исследования, по результатам которого подготовлен аналитический обзор. Определены критерии включения и исключения пациентов в исследование, дизайн исследования. Автором осуществлен отбор больных урогенитальной хламидийной инфекцией, проведено их обследование и лечение; взятие биологических образцов для проведения исследования. Полученные результаты лабораторных исследований автором систематизированы, приведены в форматы для проведения анализа (таблицы, диаграммы), проанализированы и статистически обработаны. Разработан способ прогнозирования риска развития осложнений урогенитальной хламидийной инфекции и рекомендации по ведению женщин,больных урогенитальной хламидийной инфекцией. Сформулированы выводы, установлены научная новизна и практическая значимость проведенных исследований.
Структура и объем диссертации: Работа выполнена на 257 страницах машинописного текста и состоит из введения и 7 глав, содержащих обзор литературы, описание методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, приложение и список литературы, который включает 209 зарубежных и российских авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 19 рисунками.
