Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 9
1.1. Краткая характеристика основных воібудителей гнойничковых заболеваний кожи.. 9
1 1.1 Стафилококки 9
1.1.2. Общие сведения о стрептококках
1.1.3. Факторы патогенности стафилококков и стрептококков 15
1.1.4. Стафилококковые и стрептококковые поражения кожи
и их диагностика 20
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 31
2.1. Обьект исследования 31
2.2. Идентификация микроорганизмов 31
2.3. Определение спектра чувствительности микроорганизмов к антибиотикам 31
2.4. Фаготииирование 32
2.5. Стрептококки „ 32
2.6. Выделение хромосомной ДНК 32
2.7. Выделение нлаїмидной ДНК 33
2.8. Электрофоре-) ДНК в агарозном геле 33
2.9. Расщепление ДНК рестриктазами
2.10. Постановка ішлимерашой цепной реакции 34
2.11. Статистическая обработка 35
ГЛАВА 3 Распространенность пиодермитов в Республике таджИкистан 37
ГЛАВА 4 Микробиологическое изучение основных возбудителей гнойных заболеваний кожи - 48
4.1. Этиологическая структура стафилодермии. стрентодермии и микробной экземы 48
4.2. Фагочувствительность изолированных штаммов золотистых стафилококков 54
4.3. Антибиотикограмма изолированных штаммов стафилококков 57
ГЛАВА 5 Генетический анализ хромосомной днк штаммов стафилококков и стрептококков, изолированных от больных с гнойничковой патологией кожи 64
Заключение 72
Выводы 83
Рекомендации для внедрения в науку и
Практику 85
Список литературы
- Факторы патогенности стафилококков и стрептококков
- Идентификация микроорганизмов
- Постановка ішлимерашой цепной реакции
- Фагочувствительность изолированных штаммов золотистых стафилококков
Введение к работе
Актуальность исследования. Гнойничковые заболевания кожи или пиодермиты являются актуальной проблемой для здравоохранения всех стран. Пиодермиты в структуре дерматозов занимают 1-ое место и 3-4-ое место в общей структуре заболеваемости человека после гриппа, респираторных и сердечно-сосудистых заболеваний (Stevens DL et al., 1989; Zeng X et al., 2006). Это обусловлено тем, что пиодермиты нередко принимают хроническое, рецидивирующее течение, требуют упорной, продолжительной терапии, которая не всегда приводит к желаемому результату (Pennington TL. et al., 1987; Manchester L. et al., 1990). Данная проблема является актуальной и для органов здравоохранения нашей страны. Достаточно отметить, что только за последние 15 лет срок пребывания больных на больничной койке увеличился в среднем с 6,8 до 9,4 дня (Зоиров П.Т., 2006).
В последние годы в результате широкого и бесконтрольного применения различных антибактериальных препаратов, под влиянием неспецифических и специфических факторов защиты организма произошло изменение ряда биологических свойств возбудителей пиодермитов. Всё чаще появляются сообщения об увеличении числа полирезистентных штаммов основных возбудителей данной патологии - стафилококков и стрептококков, расширении спектра их устойчивости к противомикробным препаратам, возникновении трансформированных и Ь-лактамазопродуцирующих мутантов (Martinez М.А. et al., 2004; Campo-Esquisabel А.В., 2005). Поэтому вопросы микробиологии и генетики возбудителя, эпидемиологии, диагностики и профилактики гнойничковых заболеваний кожи остаются в центре внимания дерматовенерологов, микробиологов и эпидемиологов.
В структуре гнойничковых заболеваний кожи ведущее место занимают стафилодермия, стрептодермия и микробная экзема. Роль стафилококков и стрептококков человеческого происхождения в этиологии этих инфекций не вызывает сомнения. В тоже время в литературе данные об этиологической значимости микроорганизмов, принадлежащих к животным экологическим вариантам, отсутствуют. Исследователи ограничивались в основном изучением стафилококков и стрептококков без их внутриви-
допой и серотиповой дифференцировки. Нет данных о широте распространения и частоте встречаемости генов, кодирующих основные факторы патогенності! у стафилококков и стрептококков, возбудителей гнойничковых заболеваний кожи.
Цель исследования - изучить распространение гнойничковых заболеваний кожи и установить клиническую значимость стафилококков и стрептококков различного происхождения при данной патологии кожи в Таджикистане.
Задачи исследования:
-
Изучить распространенность гнойничковых заболеваний кожи по обращаемости больных к врачам дерматовенерологам.
-
Изучить этиологическую структуру и определить удельный вес стафилококков и стрептококков животного происхождения в возникновении гнойничковых заболеваний кожи в Таджикистане.
-
Изучить биологические особенности стафилококков и стрептококков, выделенных у больных с пиодермией и микробной экземой.
-
Провести сравнительный анализ хромосомной ДНК стафилококков и стрептококков при стрепто-стафилодермии и микробной экземе.
Научная новизна:
-
Впервые в Республике Таджикистан проведено комплексное исследование этиологической структуры гнойничковой патологии кожи.
-
Впервые установлена возможность возникновения гнойничковых заболеваний кожи, обусловленных золотистыми стафилококками животных эковаров (bovis и ovis) и стрептококками rp.D.
-
Представлена антибиотикограмма и фагопейзаж стафилококков и стрептококков различных эковаров и серотипов, возбудителей стафилодермии, стрептодермии и микробной экземы в Таджикистане.
-
Изучено наличие генов, кодирующих факторы патогенносте и IS-элементы в хромосомной ДНК стафилококков и стрептококков, этиологических агентов гнойничковых заболеваний кожи в Таджикистане.
Практическая значимость.
Данные о заболеваемости пиодермитами позволяют разрабатывать эффективные способы профилактики гнойничковой
патологии кожи в каждом конкретном регионе Республики Таджикистан.
Установление этиологической роли штаммов, принадлежащих к животным эковарам золотистого стафилококка и серо-группам стрептококка, констатирует необходимость проведения внутривидового и серотипового типирования этих микроорганизмов в условиях диагностических лабораторий.
Для эффективного лечения кожных заболеваний стафилококковой и стрептококковой природы необходимо учитывать особенности антибиотикограмм этих микроорганизмов в зависимости от их экологической принадлежности.
Проведен ПЦР-анализ хромосомной ДНК и показано идентифицирующее значение генов, кодирующих факторы патоген-ности и IS-элементы для внутривидовой и серотиповой диффе-ренцировки стафилококков и стрептококков.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Показатели заболеваемости пиодермитами в Таджикистане коррелируют с факторами окружающей среды и особенностями макроорганизма, в частности, пола и возраста больных.
-
Стафилодермия и стрептодермия вызываются соответствующими возбудителями, в основном, в виде монокультуры. Ведущими возбудителями микробной экземы являются штаммы золотистого стафилококка.
-
Стафилококки и стрептококки животного происхождения способны вызывать у человека гнойничковую патологию кожи.
-
Фагопейзаж золотистых стафилококков характеризуется высокой вариабельностью.
-
Золотистые стафилококки эковара hominis, изолированные из патологического материала при гнойничковых заболеваниях кожи, по спектру резистентности отличаются от штаммов эковара bovis.
-
Штаммы стафилококков и стрептококков различаются по наличию генов, кодирующих факторы патогенносте микроорганизма и встречаемости IS-элементов.
Внедрение результатов исследования в практику.
1. По материалам диссертации составлены методические рекомендации для преподавателей, студентов и практических врачей "Микробиологическая диагностика и лечение заболеваний стафилококковой и стрептококковой природы".
-
Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы Городской клинической больницы №1, Городского кожно-венерологичсского диспансера, Республиканского Клинического центра кожных и венерических болезней (Душанбе).
-
Идентификация, внутривидовая дифференцировка стафилококков и стрептококков, а также диагностика пиодермитов внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, кожных и венерических болезней Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: 51-й годичной научно-практической конференции с международным участием "Вода и здоровье человека" (Душанбе, 2003); 52-й годичной научно-практической конференции с международным участием "Актуальные вопросы стоматологии" (Душанбе, 2004); 53-й годичной научно-практической конференции с международным участием "Лекарства и здоровье" (Душанбе, 2005); на 1-ом Съезде (конгрессе) стоматологов Таджикистана (2006); на заседании экспертной проблемной комиссий по теоретическим медицинским дисциплинам Таджикского государственного медицинского университета имени Абуали ибни Сино (Душанбе, 2004). '" Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 106 страницах компьютерного текста, включает 7 таблиц и 21 рисунок и состоит из 5 глав: одной главы обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (71 источник стран СНГ и 123 дальнего зарубежья).
Факторы патогенности стафилококков и стрептококков
Существуют и другие подходы к классификации стрептококков: по наличию специфических бактериошнов (15), по устойчивости к бактериофагам (і 22), а также по характеру белкового или ДНК полиморфизма (121). Последний считается наиболее перспективным методом. Анализ полиморфизма ДНК-фрагментов, образующихся в результате рестрикции хромосомной ДНК эндонуклеазами, либо путем обычного электрофореза, либо путем электрофореза в пульсирующем электрическом поле (134), позволяет провести качественную микробиологическую и эпидемиологическую диагностику стрептококковой инфекции. Из других методов классификации стрептококков следует отметить анализ полиморфизма рибосомальных оперонов (риботипирование) (115) или амплификации ДНК фрагментов с рассеянной затравкой (168. 181). Анализируя данные литературы, посвященные классификации стрептококков следует отметить, что на сегодня наиболее принятой в мире является классификация, основанная на антигенных свойствах этих микроорганизмов. В тоже время, данная классификация имеет некоторые недостатки. Во-первых, высокие материальные затраты. Другим недостатком является сложность получения полного набора сывороток для типирования почти по всему набору М-антигенов (их около 100). В этом контексте превосходство использования молекулярных методов дифференцировки стрептококков и диагностики стрептококковой инфекции, в первую очередь, методов с использованием полимеразной цепной реакции, очевидно. Что касается микробиологической и эпидемиологической диагностики стрептококковой инфекции, в Таджикистане такие данные отсутствуют. Поэтому одной из задач нашего исследования является налаживание современных. в том числе молекул ярно-генетических. методов дифференцировки стрептококков в Таджикистане и сравнительная оценка эффективности этих методов. Стрептококки хорошо переносят низкие температуры, довольно устойчивы к высыханию, особенно в белковой среде (кровь, гной, слизь), сохраняют жизнеспособность в течение нескольких месяцев на предметах и пыли. Однако легко уничтожаются под воздействием высокой температуры, ультрафиолетового облучения или антисептиков (189). На коже человека характерно образование гиалуроновой капсулы, которая теряется при культивировании на питательных синтетических средах (183). Клеточная стенка имеет слоистое строение (56) и представлена слоем пептидогликана и слоем поверхностно расположенных белков. Однако в последнее время, все больше данных свидетельствует о мозаичной структуре стенки, когда белки перемещаются с полимерной структурой пептидогликана и липотейховых кислот. Липотейховые кислоты, представленные молекулами гликолипида (полимер d-аланина и полигиперфосфата) ковалентно связаны с клеточной мембраной и пронизывают всю клеточную стенку и капсулу. Точно также в мембране "закроены" многие стрептококковые поверхностные белки. Так. наиболее изученный белок клеточной стенки стрептококков группы А - белок М связан с клеточной мембраной С терминальным концом и также пронизывает структуры пептидогликана, а N терминальный конец белка при этом находится на поверхности (53). По такому же принципу пространственно организовано большинство фибриллярных белков клеточной стенки стрептококков. По своей структуре пептидогликан клеточной стенки является разветвленным полимером L-раннозы или глицерол тейховой кислоты, связанных с гексозамином (57). Для стрептококков группы А этот полисахарид состоит из молекул полимера размером порядка 10 KD, в которые включены 17 Молей N-ацетил глюкозамина и 38 Молей L-амнозы. а пептидогликан стрептококков группы В состоит из остатков раннозы, N-ацетил глюкозам и на и галактозы (108).
Стрептококки характеризуются сложной антигенной структурой. Они содержат обший для всего рода антиген и различные другие антигены, i.e. группоспецифические и типоспецифические. Как уже было отмечено, группоспецифические полисахаридные антигены положены в основу серологической классификации этих микроорганизмов. К типоспецифическим антигенам относятся белки М, Т и R. По М-антигену гемолитические стрептококки серогруппы А подразделяются на большое количество серовариантов (около 100) (39, 60). Следует отметить наличие у стрептококков перекрестно реагирующих антигенов, общие для антигенов клеток базального слоя эпителия кожи и эпителиальных клеток корковой и медуллярной зон тимуса, что, возможно, является причиной аутоиммунных нарушений, вызываемых этими микроорганизмами (17, 164). Кроме того, в клеточной стенке этих кокков обнаружен антиген (рецептор II), с которым связана их способность взаимодействовать с Fc-фрагментом молекулы Ig G (16).
Патогенность (pathos - страдание, болезнь и genos - рождающий) -способность вызывать заболевание - видовое свойство бактерий, присущее виду в целом, ко она может проявляться в разной степени у разных представителей данного вида. Для оценки степени патогенности используют термин вирулентность (virulentus - ядовитый). Эти два термина означают почти одно и тоже - способность вызывать заболевание. В тоже время под вирулентностью понимают меру или степень патогенности (14).
В генезе развития стафилококкового заболевания играют роль два фактора — состояние иммунной системы макроорганизма и вирулентность возбудителя. Резистентность макроорганизмов к инфекции связана с целостностью кожных покровов и слизистых оболочек, а также с нормальным функционированием иммунной системы (15, 21). Исходя из цели и задач проводимой нами научной работы, мы остановимся на факторах, которые принимают участие в патогенезе стафилококковых инфекций. К факторам патогенности стафилококков относятся микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты и токсические субстанции (5, 19).
Микрокапсула, самый поверхностный компонент бактериальной клетки, которая защищает стафилококки от ком племент-оппосредован ного поглощения полиморфно-ядерными фагоцитами, способствует адгезии микроорганизмов и их распространению по тканям (149). Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций -усиливают синтез ИЛ-1 макрофагами, активируют систему комплемента и являются мощными хемоаттрактантами для нейтрофилов (23) . Тейховые кислоты запускают комплементарный каскад по альтернативному пути, активируют свертывающую и калликреин-кининовую системы, а также облегчают адгезию к эпителиальным поверхностям. Белок А (агглютиноген А) неспецифически связывает Fc-фрагменты молекул IgG (что активирует компоненты комплемента по классическому и альтернативному пути) и усиливает активность естественных киллеров. Активация комплемента приводит к проявлению различных местных и системных реакций, например анафилаксии, феномена Артюса, угнетению активности фагоцитов и т.д. (10, 22, 141).
Идентификация микроорганизмов
Объект исследования. Было проведено обследование 136 больных с пиодермитами, из них: 53 - со стафилодермией, 45-со стрептодермией, 38 больных с диагнозом микробная экзема и 70 здоровых лиц (без патологии кожного покрова). Анализ заболеваемости пиодермитами проводился на основании обращаемости больных к врачам кожно-венерологических учреждений. Статистическому ретроспективному анализу были подвергнуты 56204 статистических талонов (форма 25-в). Диагнозы были установлены лечащими врачами на основании данных клинико-лабораторных и объективных исследований. Материалом для исследования служили содержимое ран (гной, экссудат), слизь из носа и зева, смывы с кожи. Забор материала производили стерильным тампоном. Исследуемый материал засевали сразу после взятия на чашки с кровяным и с желточно-солевым агаром, а также на среду Эндо.
Идентификация микроорганизмов. Идентификация выделенных стафилококков проводилась по классификации Bard - Parkera и Акатова А.К. с соавт.. 1980 (4. 11).
Окончательная идентификация стафилококков и серотиповая дифференцировка стрептококков проводилась в реакции ориентировочной агглютинации с использованием диагностику мов для серологической идентификации этих микроорганизмов(72).
Определение спектра чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Чувствительность изолированных культур стафилококков к антибиотикам - тетрациклину, левомицетину, ампициллину, оксациллину, стрептомицину, пенициллину, рифампицину. мономицину, гентамицину, эритромицину, доксициллину, клиндамицину, неомицину, канамицину, азитромицину, ванкомицину, ципрофлоксацину и -зз цефотаксиму определялась с помощью стандартных дисков(70, 112). Была проверена чувствительность штаммов стрептококков гр.А к наиболее широко применяемым при стрептококковых инфекциях препаратам: бензил пенициллину. ампициллину, оксациллину, эритромицину, цефотаксиму, ванкомицину и ципрофлоксацину.
Фаготнпирование коагулазоположительных стафилококков проводили двумя наборами фагов: Международным набором бактериофагов для типирования стафилококков, выделенных от людей (набор «Ч») и набором фагов для типирования стафилококков, выделенных от крупного рогатого скота (набор «КРС»), по методике, рекомендуемой инструкцией, прилагаемой к набору фагов(82. 85, 104).
Стрептококки культивировали на среде ТНВ (Todd-Hewitt-Broth, Difco, USA). В зависимости от штамма и задач исследования в среду добавляли лошадиную сыворотку (10%), эритромицин (5мкг/мл), 10% крови барана при изготовлении плотных агаризованных сред.
Для идентификации стрептококков, определяли серотиповую принадлежность выделенных штаммов.
Бактериальные клетки осаждали центрифугированием, отмывали от питательной среды, осадок растворяли в Трис-глюкозном буфере (ТГ) (50тМ Трис- Неї рН 7,5 + 8% глюкозы). Клетки лизировали добавлением лизоцима 1 мг/мл, ЭДТА до концентрации 10 mM, SDS до 1%. Депротеинизацию ДНК осуществляли с помощью протеиназы К (0,5 мг/мл). Затем ДНК обрабатывали фенолом и дважды хлороформом. К раствору, содержащему ДНК, добавляли 2 объема 96% этанола и осаждали центрифугированием при 40 000 об/мин. в течение 5 минут. Осадок ДНК промывали 70% этанолом, высушивали под вакуумом и растворяли в дистиллированной воде.
Выделение плазмндной ДНК (27). Бактериальные клетки осаждали центрифугированием, отмывали от питательной среды. Осадок тщательно ресуспендировали в ТГ буфере. Лизис осуществляли добавлением лизоцима I мг/мл, 0,2 N NaOH, 1% SDS в течение 5 минут, затем к раствору, содержащему ДНК, добавляли ацетат калия (КАС) 5 М и выдерживали 60 минут при температуре +40 С. Плазмидную ДНК осаждали 0,6 объемами изопропанола и центрифугировали. Осадок растворяли в ТЕ буфере. Очистку плазмидной ДНК осуществляли в градиенте CsCI. Выделенную ДНК растворяли в 2,25 мл ТЕ и добавляли CsCI до концентрации 1,56 мг/мл и бромистый этидий (600 мкг/мл). В центрифужные пробирки от ротора Ті 50 (Beckman, USA) вносили раствор CsCI 1 мг/мл в ТЕ буфере, а сверху наслаивали препарат ДНК. Пробирку заполняли вазелиновым маслом и центрифугировали при 40 000 об/мин. в течение 18 часов. При обычном освещении в ней наблюдали 2 полосы. Нижняя содержала кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК, которую отбирали иглой; от бромистого этидия препарат очищали бутанолом, насыщенным NaCl, а от CsCI -диализом против ТЕ буфера.
Постановка ішлимерашой цепной реакции
На сегодня генетическая характеристика живых организмов, в частности микроорганизмов, является объектом пристального внимания исследователей в области биологии и медицины. Прогресс в этих областях науки позволил ученым раскрывать сложные механизмы у живых организмов: физиологические, биохимические, патофизиологические и др. В частности, использование молекулярно-генетических методов и генно-инженерные подходы позволили специалистам раскрыть сложные механизмы этиопатогенеза заболеваний вирусной и бактериальной природы. Однако, многие аспекты этого вопроса изучены недостаточно. Нет неоспоримых данных о частоте встречаемости различных генов у штаммов одного вида, но выделенных при различных нозологических формах патологии человека. Недостаточно изучен генетический контроль факторов патогенности и вирулентности у стафилококков и стрептококков, в частности бактерии животного происхождения. По-прежнему, остается открытым вопрос, связанный с наличием и особенностями IS-элементов хромосомной ДНК стрептококков и стафилококков.
Поэтому, одной из задач нашей диссертационной работы являлся генетический анализ и изучение частоты распространенности IS-злементов в хромосомной ДНК стафилококков и стрептококков, полученных от больных с гнойничковой патологией кожи.
Хромосомная ДНК исследуемых штаммов, была выделена как описано в главе «Материалы и методы», и проанализирована методом ПЦР с праймерами, приведенными в таблице 5.
Праймеры были сконструированы с использованием программ OLIGO и BLAST на основании нуклеотидных последовательностей генов, доступных в базе данных GenBank. Как уже было отмечено, до начала настоящей работы в отечественной и зарубежной литературе данные о генетической характеристике хромосомной ДНК стафилококков и стрептококков, выделенных от больных с кожной патологией в Таджикистане, отсутствовали.
Для того, чтобы иметь представления о генетике этих микроорганизмов, их хромосомная ДНК была проанализирована на наличие генов - scpB, cfb, cyl, scaB, Imb, hylB, bac, bca и IS элементов (IS861. IS 1548, ISSa4, IS 1381). Для сопоставления полученных результатов, дополнительно ПЦР-анализу были подвергнуты по 2 штамма стрептококков групп В и G. Табл.
При ПЦР-анализе хромосомной ДНК в зависимости от видовой принадлежности микроорганизма обнаружено, что штаммы стафилококков и стрептококков выраженно отличаются между собой по наличию в хромосоме проанализированных генов (табл. 6). Так, в хромосомной ДНК штаммов стафилококков был обнаружен только один ген (ген ріс). В то же время, хромосомная ДНК штаммов стрептококков характеризовалась значительно большим количеством проанализированных генов- до 8 генов.
Интересные данные получены при анализе хромосомной ДНК стафилококков и стрептококков в зависимости от их экологической принадлежности. В хромосомной ДНК стрептококков гр. А были обнаружены 3 гена (scpB, cfb, Imb). У штаммов стрептококков гр. D встречался 1 (hylB) из 9 проанализированных хромосомных генов. Наибольшое количество генов (8 генов) были обнаружены в хромосомной ДНК стрептококков гр.В.
Обращает на себя внимание широта распространенности этих генов в хромосомной ДНК стафилококков различной экологической принадлежности. Так, штаммы всех эковаров этого вида бактерий в хромосомах содержали только один ген, причем у всех был обнаружен один и тот же ген — ріс.
К современным эффективным чувствительным методам типирования микроорганизмов относятся генотипические методы, базированные на исследовании структуры ДНК (45, 197). Сущность этих методов состоит в том, что клонально родственные изоляты имеют определенную характеристику или признаки, посредством которых они могут быть дифференцированы от неродственных изолятов. Данные литературы, посвященные сравнительному анализу результатов исследования микроорганизмов, основанных на фенотипических и генотипических методах, позволяют заключить, что по большинству показателей фенотипические методы значительно уступают генотипическим (41, 56, 61). Это связано с тем, что возможности фенотипических методов ограничены вследствие способности микроорганизмов изменять экспрессию соответствующих генов. Молекулярно-генетический анализ хромосомной ДНК и генотипирование стафилококков и стрептококков имеют как теоретическое, так практическое значение. Важность представлений о распределении генотипов стафилококков и стрептококков при различных заболеваниях обусловлена тем, что установление генотиповой принадлежности штамма позволяет провести качественную диагностику и эффективный мониторинг и лечение заболеваний, вызванных этими бактериями.
Фагочувствительность изолированных штаммов золотистых стафилококков
Поэтому, следующим этапом нашего исследования являлось изучения антибиотикочувствительности штаммов стафилококков и стрептококков, полученных у больных с гнойными кожными патологиями. Показано, что штаммы золотистого стафилококка человеческого экологического варианта, в основном проявляют устойчивость к тетрациклину и стрептомицину. Примерно в 2 раза реже встречались ампициллин- и левомицетин -устойчивые культуры этого экологического варианта стафилококка. Одинаковыми были количество оксациллин и рифампицин резистентных штаммов. Близкими были показатели устойчивости к неомицину и мономицину- Обращает также на себя внимания незначительное количество штаммов устойчивых к доксациклипу, гентамицину, канамицину, клиндомицину. Еже реже встречались штаммы резистентные к цефотоксиму, эритромицину и ванкомицину. В наименьшем проценте случаев высевались штаммы устойчивые к циирофлоксацину, азитромицину - всего по 2 штамма.
Из патологического материала больных с диагнозом стафилодермией было выделено 6 штаммов золотистого стафилококка эковара bovis. и штаммы не проявляли устойчивость к таким антибиотикам как клиндомицин, цефотоксим, ванкомицин, цепрофлоксацин, азитромицин. При данной патологии из патологического материала нам удалось выделить только 2 штамма золотистого стафилококка характеризующихся как эковар ovis, что не позволило нам проводить детальный их антибиотикограмм.
При сравнительном анализе антибиотикограмм штаммов стафилококков, полученных от больных с микробной экземой с результатами изучения антибиотикочувствительности штаммов полученных от больных с стафилодермией выраженное различие не обнаружено.
При рассмотрении лекарственной устойчивости культур стрептококков привлекают внимание штаммы, изолированные от больных с микробной экземой. Среди изученных культур 24% были чувствительны ко всем использованном в работе антибиотикам. Здесь, показатель устойчивости по отношению ко всем антибиотикам был ниже средних показателей для штаммов, полученных у больных со стрептодермией. Наиболее часто выявлялась устойчивость к тетрациклину. Удельный вес стрептококков животного происхождения в этиологической структуре данных патологии были незначительными. Поэтому, для них статистическая обработка показателей антибиотикоустойчивости не проводились.
Учитывая факт, что стафилококки и стрептококки циркулирующих в Таджикистане до начало настоящей работы в генетическом плане оставались не изученными и недостаточной информации о генетическом контроле факторов патогенности и вирулентности у стафилококков и стрептококков другой задачей нашего исследования являлось генетический анализ и изучения частоты распространенности IS-элементов в хромосомной ДНК стафилококков и стрептококков, полученных от больных с гнойничковой патологии кожи.
Праймеры были сконструированы с использованием программ OLIGO и BLAST на основании нуклеотидных последовательностей генов, доступных в базе данных GenBank.
Для того чтобы иметь представления о генетике этих микроорганизмов, их хромосомная ДНК была проанализирована на наличие генов - scpB. cfb. cyl, scaB. hnb, hylB, bac, bca и IS элементов (IS861, ISI548. ISSa4, ISI381).
При ПЦР-анализе хромосомной ДНК в зависимости от видовой принадлежности микроорганизма обнаружено, что штаммы стафилококков и стрептококков выражено, отличаются между собой по наличию в хромосоме проанализированных генов. Так, в хромосомной ДНК штаммов стафилококков был обнаружен только один ген (ген ріс). В то же время, хромосомная ДНК штаммов стрептококков характеризовались значительно большим количеством проанализированных генов - от 6 до 8 генов.
Интересные данные получены при анализе хромосомной ДНК стафилококков и стрептококков в зависимости от их экологической принадлежности. Только хромосомная ДНК стрептококков гр.В. содержала все проанализированные (- scpB, cfb, cyl, scaB, Imb, hylB, bac, bca) гены. В хромосомной ДНК стрептококков гр.А были обнаружены 7 (bca, scpB, scab, hylB, cfb, cyl, Imb), а у штаммов стрептококков rp.D встречались 6 (scpB, scab, hylB, cfb, cyl, Imb) из 8 проанализированных хромосомных генов.
Обращает на себя внимание широта распространенности этих генов в хромосомной ДНК стафилококков различной экологической принадлежности. Так, штаммы всех эковаров этого вида бактерий в хромосомах содержали только один ген, При чем у всех был обнаружен один и тот же ген - ріс.
Молекулярно-генетический анализ хромосомной ДНК и генотипирование стафилококков и стрептококков имеют как теоретическое, так и практическое значение. Важность представлений о распределении генотипов стафилококков и стрептококков при различных заболеваниях обусловлена тем, что установление генотиповои принадлежности штамма позволяет провести качественную диагностику и эффективный мониторинг и лечение заболеваний вызванный этими бактериями.
Исходя из выше изложенного, нами был проведен сравнительный анализ хромосомной ДНК исследуемых штаммов стафилококков и стрептококков посредством ПЦР. Результаты ПЦР-анализа были сопоставлены изучением характера электрофореграмм на геле. Показано, что штаммы различных видов стафилококков и стрептококков отличаются между собой по характеру электрофоретической подвижности паттернов. В тоже время наблюдается разница в электрофоретической подвижности паттернов у штаммов стрептококков принадлежащих различным серотипам.
Исследованием установлено, что штаммы стрептококков по наличию IS элементов в хромосоме являются более гетерогенными, чем по наличию генов вирулентности. Штаммы различного происхождения отличались по наличию IS элементов в хромосомной ДНК. Хромосомная ДНК стрептококков полученных от больных с кожной патологии содержали только один IS элемент - IS1381, который также оказался общим для стрептококков, изолированных от больных с патологиями других органов.
По своей электрофоретической подвижности отличались между собой штаммы стрептококков, полученных от больных с различными нозологическими формами. Так, хромосомная ДНК штаммов стрептококков полученных от травматологических и гинекологических больных были обнаружены по 3 разных IS элементов. У штаммов травматологических больных - IS86I, !SSa4 и IS1381, а у гинекологических - IS861, S1548 и IS1381.
Таким образом, резюмируя результаты проведенных исследований необходимо отметить, что в Таджикистане в структуре пиодермии ведущее место занимает стрептодермия, несколько реже стафилодермия и последнее место занимает смешанная форма данной кожной патологии - стафило-стрептодермия. Однако, в некоторых регионах эти показатели резко отличаются. В частности, низкий уровень обращаемости по поводу стафилодермии и несколько частая регистрация случаев больных с диагнозом стафило-стрептодермии по сравнению с другими регионами наблюдается в Кулябской зоне, а в условиях среднегорья одинаково, и пиодермии встречались в десятки раз реже в условиях высокогорья. По-видимому, такое состояние обусловлено климатическими факторами. уровнем медицинской и санитарной культуры населения, дефектами в организации рационального питания. характером производственной деятельности населения и др.
Следует отметить, что стафилококки, выделенные от больных с стафилодермией и микробной экземой, характеризуются частой резистентностью к тетрациклину и стрептомицину, проявляя чувствительность ко многим антибиотикам последнего поколения, которых можно рекомендовать как антибиотики выбора при лечении этих заболеваний. Стрептококки этиологические агенты стрептодермии и в некоторых случаях возбудители микробной экземы оказались наиболее чувствительными ко
