Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
Глава II. Материалы и методы исследования 29
Глава III. Клиническая характеристика больных 36
Глава IV. Лечение больных очаговой склеродермией 56
Глава V. Гистоны лимфоидных клеток у больных очаговой склеродермией 74
Заключение 84
Выводы 95
Указатель литературы 98
- Материалы и методы исследования
- Клиническая характеристика больных
- Лечение больных очаговой склеродермией
- Гистоны лимфоидных клеток у больных очаговой склеродермией
Материалы и методы исследования
В нашей работе проводилось исследование иммунокомпетентных клеток на молекулярном уровне, анализ количественных и качественных характеристик компонентов ядер лимфоцитов периферической крови и в том числе соотношения между белковыми фракциями, входящими в состав хроматина - гистонами и ДНК. По современным представлениям, гистоны играют роль неспецифических регуляторов матричной активности ДНК и количественные изменения отдельных фракций этих белков могут оказывать влияние на скорость протекания ДНК- и РНК-полимеразных реакций в клетке, а соотношение гистон/ДНК регулирует активность генома (Thomas J.O., 1999 [192]). Материалом для анализа гистонов лимфоидных клеток являлась чистая суспензия лимфоцитов, выделенная на основе принципа седиментации в одноступенчатом градиенте фиколл-гипак из суспензии мононуклеарных клеток (см. рис.1. Лимфоидное кольцо).
Для получения гистоновых белков использовали суспензию выделенных лимфоидных клеток с заведомо известной их концентрацией (2-5-10/л). Гистоны получали методом ступенчатого химического фракционирования с предварительным удалением для чистоты выделения гистонов глобулиновых белков. С этой целью к 0,5 мл суспензии клеток добавляли 3 мл и 0,14 М NaCl, перемешивали и после отстаивания в течение 10 минут при 0-4С центрифугировали (1 500 q в течение 10 минут). Полученный супернатант, содержащий фракцию глобулиновых белков, отбрасывали (Кирзон С.С., 1992 [33]). Для получения отдельных фракций гистонов использовали метод, основанный на разной степени растворимости основных фракций этих белков в кислых растворах, отличающихся ионной силой. Выделенные фракции идентифицировали с помощью электрофореза в 15% полиакриламидном геле (Paniym S., Chakley R., 1969 [165]). Для экстракции НІ-гистона фракции, очень богатой лизином, к осадку, оставшемуся после удаления глобулиновой фракции, добавляли при перемешивании 2 мл 5% НСЮ4 и оставляли в течение 15-20 минут при температуре 0-4С. Затем центрифугировали в течение 10 минут при 1 100 q. Надосадок содержал фракцию HI. Из объединенных супернатантов отбирали 0,5 мл для количественного определения белка (Бейли Д., 1965 [5]). Эту процедуру повторяли дважды для полноты извлечения и супернатанты объединяли. Для осаждения фракции HI к объединенному супернатанту приливали трихлоруксусную кислоту (ТХУ) до конечной концентрации 18%. При соблюдении этих условий фракция HI гистонов выпадала в осадок в течение 1 часа с оптимальным выходом около 80%; ее отделяли центрифугированием и использовали для повторного количественного определения и проведения электрофореза. Экстракция Н2А-НЗ-Н4 фракции, представляющей смесь нескольких фракций гистонов группы белков, в составе которых фракции НЗ и Н4 - с болыпим содержанием аргинина и Н2А - со средним содержанием аргинина, составляющие белковую основу нуклеосомы и структурно связанные между собой, возможна после удаления HI.
С этой целью к осадку, полученному после извлечения HI гистонов добавляли 3 мл 96 этанола, подкисленного НС1, перемешивали и оставляли на 18 часов при 0-4С, после чего центрифугировали в течение 10 минут при 1 100q. Супернатант содержал смесь Н2А-НЗ-Н4 фракций гистонов. Эту процедуру проводили дважды. Из этой фракции также отбирали пробу для количественного определения белка. Для осаждения данного комплекса гистонов к супернатанту добавляли ацетон в соотношении 1:8, оставляли на 2 часа, а затем центрифугировали в течение 30 минут при 1 100q и обрабатывали аналогично фракции HI. Количество белка в каждой фракции определяли модифицированным микробиуретовым методом, при котором ионы меди в щелочной среде образуют с белками окрашенный в сине-фиолетовый цвет комплекс. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству белка в пробе. Замер проводили на спектрофотометре при 330 нм, расчет - с использованием предварительно построенной калибровочной кривой; стандартом служил раствор плацентарного альбумина известной концентрации. В каждой серии опытных образцов присутствовала проба с контрольным содержанием белка (Бейли Д., 1965 [5]). Уровень фракций гистонов HI, Н2А-НЗ-Н4 и их соотношение определяли с учетом их процентного содержания по отношению к суммарному гистону (Johns E.W., 1964 [137]). Для анализа гетерогеннности белков, выделяемых путем химического фракционирования наиболее информативным является метод электрофореза. Белки, находящиеся в растворе имеют определенный электрический заряд, величина которого зависит от структуры молекул белка и определяется наличием свободных амино- и карбоксильных групп на его поверхности.
В электрическом поле под действием электрического тока молекулы движутся к полюсам. Распределенные по величине заряда и молекулярной массе белки могут быть зафиксированы и количественно и качественно оценены. Электрофорез гистонов в 15% полиакриламидном геле в присутствии мочевины по методу (Paniym S., Chakley R., 1969 [165]), прибор фирмы Реанал, проводили для идентификации и анализа гетерогенности получаемых фракций гистонов. Полимеризацию геля вели при температуре 20С в течение 1-1,5 час. Префорез - в течение 5-7 часов в холодной комнате при силе тока 2 тА на пробу, буфером служила 0,9 N уксусная кислота. Полученные в виде осадка фракции отдельных гистонов для разделения указанным методом предварительно растворяли в 0,9 N уксусной кислоте. Пробу готовили из расчета 30 мкг/мл белка на пробу с добавлением 15% сахарозы и индикаторной краски, после чего наслаивали на гель. Первые 30 минут электрофорез проводили при силе тока 1 тА на пробу, затем при 2 тА, разделение проводили в холодной комнате в течение 3-4 часов. После прекращения фореза пробы окрашивали в 1% растворе амидо-черного ЮВ, приготовленного на 7% уксусной кислоте. Отмывание производили в 7 % уксусной кислоте до отбеливания фона. Осадки гистонов, полученные кислотно-спиртовым методом по E.W. Johns (1964 [137]), растворяли в 0,25 N НС1 и спектрофотометрировали против раствора 0,25 N НС1 в диапазоне 200-300 ммк на спектрофотометре 124-Хитачи. Полученные величины длин волн, при которых зарегистрировано минимальное и максимальное поглощение, характерное для каждой фракции гистонов, сравнивали с данными M.J. Pieri (1968 [170]). Эти данные представлены в таблице 1.
Клиническая характеристика больных
С 1999 по 2002 год под нашим наблюдением на клинических базах кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета РГМУ находилось 108 больных очаговой склеродермией, из них 71 женщина и 37 мужчин, в возрасте от 16 до 76 лет. Возникновение первых признаков склеродермии было отмечено в различных возрастных группах, что представлено в таблице 2. Как видно из таблицы 2, наиболее часто заболевание начиналось в возрасте 21-30 лет, у 83 из 108 пациентов дебют отмечен до 40 лет, что не противоречит многочисленным наблюдениям о преобладании лиц молодого возраста среди впервые заболевших склеродермией (Вербенко Е.В., 1966 [12], Высоцкий Г.Я., 1971 [19], Довжанский СИ., 1979 [25], Насонова В.А., Астапенко М.Г., 1989 [54], Гусева Н.Г., 1994 [22], Скрипкин Ю.К., Главинская Т.А., 1996 [75], Насонова В.А., Денисов Л.Н., 2001 [55]). К моменту поступления больных на обследование и лечение давность заболевания у них составила от 2 недель до 28 лет: до 3 месяцев были больны 10 пациентов, от 4 месяцев до 1 года - 29, от 1 года до 2 лет - 45, более 3 лет - 24 (таблица 3). степени выраженности функциональных и клинико-морфологических нарушений (Гусева Н.Г., 1994 [22]). Разнообразие клинических проявлений локализованной формы заболевания требует раздельного рассмотрения его разновидностей (Довжанский СИ., 1979 [25], Каламкарян А.А., Фёдорова Е.Г., 1982 [31], Гребенюк В.Н., 1998 [20]). Распределение больных различными клиническими формами склеродермии по возрасту и полу представлено в таблице 4. Диагностика склеродермии в начальной стадии представляет определенные трудности. Заболевание обычно начинается без нарушения общего состояния. Отсутствие жалоб и часто неопределенные кожные изменения обуславливают то, что начало болезни нередко пропускается или выставляются ошибочные диагнозы. Изучение анамнеза больных выявило, что из 108 пациентов - у 42 диагноз был установлен в первые недели и месяцы заболевания, у 53 - через 4-12 месяцев, а 13 больным первоначально были выставлены ошибочные диагнозы: витилиго, фиброма, кольцевидная гранулема, липоидный некробиоз, атрофия, келлоид и Другие.
Первичные кожные изменения в очагах поражения у больных были различные: в виде легкой отечности кожи, изменений сосудистого рисунка, нарушения пигментации. Как известно, для склеродермии характерно последующее развитие трех стадий: отека, склероза и атрофии. Однако наблюдения показали, что не у всех больных и не все очаги проходят три стадии, и любая из них может отсутствовать. Выраженность и длительность каждой из стадий также очень разнообразны. Их смена у одних пациентов происходила относительно быстро - в течение 1-3 месяцев, у других - медленно - ил протяжении нескольких лет. Проявления склероза у больных также широк варьировали - от слегка выраженного до глубокого уплотнения. Бляшечная склеродермия была диагностирована у 81 пациента, у 45 выявлено 1-3 очага, у 36 - многоочаговая форма заболевания. Соотношение мужчины : женщины у пациентов с 1-3 очагами составило 1 : 2. У больных с множественной формой заболевания соотношение мужчины : женщины составило 1 : 1,4. Более 2/3 обследованных были моложе 41 года. 10 больных были старше 61 года. Ранее склеродермия в пожилом и старческом возрасте описана И.В. Хамагановой (1987 [92]).
Были выявлены единичные или множественные (до 22) очаги поражения в виде уплотненных участков от 0,3 до 14 см в диаметре, различавшихся по форме, цвету, выраженности лилового ободка, глубине поражения, явлений атрофии. В начальной стадии на коже появлялись слегка отечные пятна розового цвета с сиреневым оттенком. С течением времени наблюдалось постепенное увеличение пятен в размерах и появление новых. Как правило, окраска в центре очага бледнела и появлялось уплотнение, а по периферии - кайма ливидного, розовато-синюшного цвета с фиолетовым оттенком, шириной от 0,3 до 1,5 см, постепенно переходящая в неизмененную кожу, что является показателем активности процесса (рис. 2, 3. Бляшечная склеродермия).
Сформировавшиеся очаги поражения имели диаметр от 0,4 до 15 см, округлую форму, реже неправильные очертания, с гладкой блестящей поверхностью восковидно-сероватой окраски или цвета слоновой кости (рис. 4, 5. Бляшечная склеродермия). В некоторых случаях имелись участки западения. В центре очагов - дерматосклероз в виде уплотнения кожи, от едва заметного до деревянисто плотного, напоминающего рубцовую или келлоидную ткань и распространяющегося глубоко в дерму или гиподерму. В ряде случаев отмечена склонность к образованию трещин, язв, эрозий, буллёзных высыпаний (рис. 6. Буллезный очаг поражения). Ранее образование пузырей при склеродермии описано в работах А.А. Каламкаряна, Е.Г. Фёдоровой (1982 [31]). Участки поражения при многоочаговой бляшечной склеродермии представлены на рисунках 7-9. При разрешении патологического процесса у больных наблюдалось уменьшение или полное исчезновение плотности очагов, восстановление эластичности, окраски кожи, или, в некоторых случаях, появление гиперпигментации.
Лечение больных очаговой склеродермией
Лечение больных очаговой склеродермией должно быть комплексным, патогенетически обоснованным и в то же время дифференцированным - в зависимости от течения, клинической формы заболевания, индивидуальных особенностей каждого пациента. С учетом прогрессирующего характера заболевания преследуется цель замедлить прогрессирование, добиться стабилизации, а затем регресса клинической симптоматики. В связи с тем, что существующие в настоящее время методы терапии очаговой склеродермии недостаточно эффективны, часто сопровождаются побочными реакциями, представляется перспективным изучение и разработка новых способов лечения этого заболевания. Неспецифическое воздействие на иммунологическую реактивность организма в сочетании с противовоспалительным, противоотечным действием, корригирующее воздействие на центральную и периферическую гемодинамику, положительный микроциркуляторный эффект, послужили основанием для включения импульсной магнитотерапии в комплексное лечение очаговой склеродермии. В нашей работе мы использовали портативный аппарат для низкочастотной импульсной магнитотерапии МАГ-30 (рис. 12. Аппарат МАГ-30). Аппарат рекомендован комитетом по новой медицинской технике Минздравмедпрома Российской Федерации (протокол МЗ РФ № 7 от 08.09.1997), сертификат соответствия № РОССчи.ИМ02. ВО5022 (выдан госстандартом Российской Федерации 21.10.1997). МАГ-30 рекомендован Комиссией по приборам и аппаратам, применяемым в физиотерапии, Комитета по новой медицинской технике Управления по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники Минздрава РФ (протокол МЗ РФ № 7 от 08.09.1997). Аппарат предназначен для оказания физиотерапевтического воздействия на организм человека и разрешен к применению как в физиотерапевтических отделениях стационара или амбулатории, так и в домашних условиях. МАГ-30 рекомендован для эксплуатации в нормальных климатических условиях для изделий исполнения УХЛ категории 4,2 в соответствии с ГОСТ 151-50-69, при температуре воздуха от + 10 С до + 35 С.
По электробезопасности аппарат выполнен по классу II тип В согласно ГОСТ Р 50267.0-92. По воспринимаемым механическим воздействиям соответствует группе 2 по ГОСТ Р 50444-92. По последствиям отказа относится к классу В по ГОСТ Р 50444-92. Технические характеристики: амплитуда значений магнитной индукции на рабочей поверхности аппарата (30 ± 9) мТл, электропитание осуществляется от сети переменного тока частотой 50 Гц, напряжением (220 ± 22) В, мощность не более 45 Вт, масса не превышает 0,6 кг, габаритные размеры 88 х 140 х 53 мм. Наружные поверхности аппарата устойчивы к дезинфекции химическим методом: 3% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства типа «Лотос» или 1% раствором хлорамина. Процедуры проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Импульсная магнитотерапия в лечении болезней соединительной ткани», составленными И.В. Хамагановой и соавт., утвержденными МЗ РФ, № 96/129. Процедура осуществляется скользящими движениями над поверхностью пораженного участка (рис.13. Магнитотерапия с помощью аппарата МАГ-30); продолжительность ее составляет 10-20 минут при одном воздействии или по 10 минут (всего 20 минут) при двух последовательных воздействиях, на курс № 10-20 . Учитывая необходимость индивидуального подхода к ведению каждого больного, а также возможность развития толерантности к препаратам, необходимо расширять арсенал лекарственных средств. В связи с этим мы сочли целесообразным включение в комплексную терапию очаговой склеродермии спрея «Артрозилен» и крема «Фитостимулин» (производитель Фарма Риаче). Спрей «Артрозилен» (кетопрофен соль лизина) - относится к нестероидным противовоспалительным средствам. Данный препарат применяли у больных очаговой склеродермией при необходимости сочетания противовоспалительного действия с анальгезирующим. Спрей «Артрозилен» - баллончик под давлением (рис. 14. Спрей «Артрозилен»), объемом 25 мл, содержащий 15 г действующего вещества - кетопрофена соли лизина. Вспомогательные компоненты: полисорбат 80, пропиленгликоль, поливинилпирролидон, лаванда неролен, дистиллированная вода. Спрей наносится 2-3 раза в день, в течение 3-4 недель. С целью достижения эпителизирующего и нормализующего трофику эффекта использовали крем «Фитостимулин» (рис. 15. Крем «Фитостимулин»). 100 г крема содержит: водный экстракт пшеницы обыкновенной (сухой остаток 200 мг/100 мг) 15 г, 2-феноксиэтанол 1 г, пропиленгликоль 400 - 35 г, пропиленгликоль 1500 - 16,5 г, пропиленгликоль 4000 - 16,5 г, жидкий парафин 2,2 г, цетиловый спирт 0,5 г, стеариловый спирт 0,5 г, глицерин 4,5 г, сорбитол 8,25 г, эссенция лаванды 7 мг, эссенция кориандра 50 мг. Применяется 1-2 раза в день, в течение 20-40 дней.
Было проведено лечение 108 больным очаговой склеродермией. Терапия назначалась с учетом формы, стадии, клинической активности заболевания. У 62 пациентов имелись различные признаки прогрессирования заболевания: сиреневатый венчик по периферии очагов, увеличение размеров и количества пораженных участков, в разной степени выраженности индурация, жжение, покалывание, неприятные ощущения в очагах поражения. Всем больным с признаками прогрессирования процесса назначалась традиционная терапия: внутримышечные инъекции лидазы 64 ЕД через день № 12-15, ксантинола никотинат внутрь по 0,15 3 раза в день 1 месяц, аевит по 1 капсуле 2 раза в день 1 месяц. 16 пациентов получали только традиционное лечение, 15 в сочетании с импульсной магнитотерапией, 17 в сочетании со спреем «Артрозилен», 14 в сочетании с кремом «Фитостимулин». Из 16 больных, получавших только традиционную терапию, 5 пациентов были с 1-3 очагами бляшечной склеродермии, 10 - с многоочаговой формой заболевания, 1 - с линейной склеродермией. У пациентов были выражены признаки прогрессирования процесса: наличие венчика роста по периферии очагов поражения, увеличение плотности пораженных участков, появление субъективных ощущений. Ранее 3 пациента с некоторым эффектом получали внутримышечные курсы пенициллина, сосудорасширяющие препараты, поливитаминотерапию. 13 больных ранее не лечились. 15 пациентам с выраженными признаками прогрессирования процесса (сиреневым ободком по периферии очагов поражения, появлением новых очагов, увеличением плотности, наличием субъективных ощущений по типу жжения, покалывания, «бегания мурашек» по коже) назначали традиционную терапию в сочетании с импульсной магнитотерапией. 12 больных ранее без эффекта получали
Гистоны лимфоидных клеток у больных очаговой склеродермией
В настоящее время известно, что гистоны играют определяющую роль в структурной организации ядра, формируя различающиеся между собой по матричной активности участки плотного и диффузного хроматина и определяя процессы синтеза, пролиферации и дифференцировки. Гистоны являются неспецифическими регуляторами матричной активности ДНК, и количественные изменения отдельных фракций этих белков, а также соотношение гистоны/ДНК отражают особенности функциональной активности ядерных структур, как в норме, так и при развитии патологического процесса, при этом HI гистоны обладают выраженной биологической активностью (Doencke D. et al., 1997 [115], Flickinger R. A., 2000 [124], Thomas J. O., 1999 [192]). Нами проводились исследования количественных и качественных характеристик ядер лимфоцитов периферической крови у больных очаговой склеродермией и здоровых доноров и определялось содержание ДНК, процентное соотношение фракций гистонов HI (фракции, богатой лизином), Н2А-НЗ-Н4 (фракции богатой аргинином), соотношение лизин/аргинин и гистоны/ДНК. Были обследованы 76 больных очаговой склеродермией, из них 57 женщин и 19 мужчин в возрасте от 16 до 76 лет. У 59 из них диагностирована бляшечная форма, в том числе у одной больной с буллезными проявлениями, у 7 - линейная форма, у 5 -склероатрофический лихен, у 3 - идиопатическая атрофодермия Пазини-Пьерини, у 1 - сочетание склероатрофического лихена с бляшечной формой, и у 1 - сочетание линейной и бляшечной склеродермии.
У пациентов имелась различная степень активности патологического процесса. Контролем служила группа здоровых доноров из 22 человек, при обследовании которых в лимфоцитах периферической крови были установлены показатели распределения внутриядерных характеристик: содержание НІ от 33,3 до 46,2%, Н2А-НЗ-Н4 от 40,5 до 59,3%, соотношение лизин/аргинин от 0,57 до 1,26, соотношение гистоны/ДНК от 0,4 до 0,89. Содержание фракций гистонов в лимфоцитах периферической крови у больных очаговой склеродермией отличалось от показателей зарегистрированных в контрольной группе и варьировало в широких пределах. У 76 обследованных пациентов содержание фракции гистонов, богатой лизином - HI - составляло от 14,3 до 58,9%, фракции гистонов, богатой аргинином Н2А-НЗ-Н4, составляло от 31,5 до 83,3%, соотношение лизин/аргинин от 0,17 до 1,8, соотношение гистоны/ДНК от 0,14 до 1,31. На основании показателя HI-фракции больные очаговой склеродермией были условно разделены на 3 группы. Первую группу составили 18 пациентов, у которых содержание Н1-гистонов составило от 14,3 до 20,4%. На момент исследования 15 больным был поставлен диагноз бляшечная склеродермия, у 1 - линейная форма, у 2 - склероатрофический лихен. Давность заболевания составила от 3 недель до 6 месяцев. У 16 пациентов имелись умеренно выраженные признаки прогрессирования процесса. Во вторую группу вошли больные, у которых содержание Н1-гистонов составляло от 27,8 до 42,6%.
Среди 31 пациента у 22 диагностирована бляшечная форма, у - 2 линейная, у 3 -склероатрофический лихен, у 3 - идиопатическая атрофодермия Пазини-Пьерини, у 1 - сочетание склероатрофического лихена и бляшечной склеродермии. У 26 больных был достигнут терапевтический эффект в результате ранее проведенного лечения, 5 пациентов ранее не лечились. К моменту обследования у всех больных самочувствие было хорошее, отсутствовали признаки активности процесса. Третью группу составили пациенты, у которых содержание Н1-гистонов составляло от 45,0 до 58,9%. Из 27 больных - бляшечная форма диагностирована у 22, в том числе одна больная с буллезными проявлениями, линейная у 4, сочетание линейной и бляшечной склеродермии - у 1. Несмотря на проведенную ранее терапию у пациентов сохранялись клинические признаки активности заболевания. В эту группу вошли больные с наиболее распространенными (от 4 очагов и более) и тяжелыми формами (буллезный вариант бляшечной склеродермии, инвалидизирующая линейная форма с атрофией мышц голени). Исследуемые показатели представлены в таблице 8. Как видно из таблицы, у больных первой группы содержание НІ в среднем составило 16,23±0,35%, что достоверно ниже Р 0,001 показателя у здоровых людей, у которых содержание HI было выявлено в количестве 38,5±0,94%. Содержание Н2А-НЗ-Н4 составило 78,0±0,95%, что достоверно выше Р 0,001 нормы 46,8±1,09%. Соотношение лизин/аргинин было 0,2±0,006, что достоверно ниже Р 0,001 показателя в контрольной группе, составившего 0,83±0,03. Соотношение гистоны/ДНК составило 1,03±0,04, что достоверно выше Р 0,001 нормы 0,64±0,03. У больных второй группы содержание НІ в среднем определено в количестве 35,2±0,69%, что достоверно ниже Р 0,02 по сравнению с нормой 38,5±0,94%. Содержание Н2А-НЗ-Н4 составило 48,6±0,68%, что достоверно не отличается от показателей у здоровых лиц Р 0,1. Соотношение лизин/аргинин было 0,72±0,02, что достоверно ниже Р 0,001, чем в норме. Соотношение гистоны/ДНК составило 0,49±0,02, что достоверно ниже Р 0,001, чем у здоровых лиц.
![Состояние антиоксидантной системы и микроциркуляции у больных ограниченной склеродермией и их коррекция кислородно-озоновой терапией [Электронный ресурс]](/i/i/4505/176860.png "Состояние антиоксидантной системы и микроциркуляции у больных ограниченной склеродермией и их коррекция кислородно-озоновой терапией [Электронный ресурс] Котов Алексей Александрович")
