Введение к работе
Актуальность проблемы
В последнее десятилетие во всем мире наблюдается значительный рост заболеваний, передающихся половым путем. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в мире ежегодно регистрируется 333 млн. новых случаев заболеваний, передающихся половым путем, из них 12 млн. приходится на сифилис (Адлер М.В.,1997)
Этщешгческий характер приобретает заболеваемость сифилисом в странах СНГ. По данным VI съезда дерматовенерологов России, количество зарегистрированных случаев этого заболевания составило в 1995 году 177 человек на 100 000 населения (Романенко Г.Ф. с соавт.,1996). В Казахстане этот показатель составил в 1997г. 123 на 100 000 населения (Кешелева З.Б., Пшеничная Л.А., 1997), в Таджикистане, в г. Душанбе - 87,2 на 100 000 населения (Зоиров П.Т. с соавт.,1998). Вайсов А.Ш. с соавт. (1995), Маманов М.М. с соавт. (1999) приводят данные об ежегодном увеличении числа больных сифилисом в Узбекистане в 2 раза. На Украине уровень заболеваемости сифилисом по сравнению с 1985 г. за 10 лет повысился в 10 раз (Захаров В.К., Захаров СВ., 1998). Особую актуальность приобрели ассоциации болезней, передающихся половым путем, в частности, сифилиса и ВИЧ-инфекции, изменяющие традиционное течение заболеваний, что актуализирует проблему их своевременной диагностики.
Клинические методы диагностики сифилиса по-прежнему имеют большую ценность. Однако, в последние годы изменилось соотношение форм заболевания, в частности, увеличение числа больных скрытыми формами сифилитической инфекции (Бекмуратова Э.Э.и соавт., 1997), при которых клинические симптомы болезни практически отсутствуют, а поскольку выявление больных с указанной формой заболевания происходит, в основном, активным путем, больные длительное время представляют эпидемиологическую опасность для окружающих.
Несомненной остается ведущая роль серологических методов диагностики сифилиса с помощью микрореакций преципитации, реак-
ции связывания комплемента, иммунофлюоресценции и иммобилизации бледных трепонем. Однако, увеличение числа больных с лож-ноположительными и ложноотрицательными результатами указанных реакций снижает их диагностическую ценность. Остается высокой частота ложноположительных результатов при различных заболеваниях, микст-инфекциях и беременности, а также ложноотрицатель-ных результатов у лиц, находящихся в инкубационном периоде болезни и при первичном серонегативном сифилисе.
Проблема лабораторной диагностики осложняется также поздним наступлением серопозитивности и отсутствием возможности объективизировать и автоматизировать подсчет результатов основных тестов, применяемых в серодиагностике сифилиса. К сожалению, разработка новых методов определения антител при сифилисе с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблотинга не повышают диагностической ценности серореакций (Дмитриев Г.А., Бра-гина Е.Е.,1996).
Информативность микробиологических тестов, сводящихся к обнаружению бледной трепонемы в очагах поражения на коже, видимых слизистых оболочках и в пунктате лимфатических узлов, значительно ниже серологических (Овчинников Н.М. с соавт.,1987)
Следовательно, традиционно используемые методы клинической, серологической и микробиологической диагностики сифилиса в современных условиях недостаточно информативны, а проблема диагностики сифилиса остается актуальной.
Достижения клинической иммунологии позволяют с новых позиций подойти к проблеме иммунодиагностики инфекционных заболеваний. В частности, регистрация антигенсвязывающих лимфоцитов в крови больных служит чувствительным индикатором развития хели-кобактериоза, гнойновоспалительных заболеваний, кишечных и др. инфекций (Гариб Ф.Ю., Гариб В.Ф., 1999)
Цель исследования
Оценить информативность существующих клинических, серологических и микробиологических методов диагностики сифилиса и разработать новые иммунодиашостические тесты на основе регистрации циркулирующих антигенсвязывающих лимфоцитов.
Задачи исследования
1. Изучить особенности клинического течения сифилиса в современных условиях.
-
Оценить Т-клеточное звено иммунитета у больных сифилисом с помощью моноклональных антител против кластеров дифференцировки лимфоцитов.
-
У больных сифилисом обнаружить пул циркулирующих антигенсвязывающих лимфоцитов, реагирующих с антигенами бледной трепонемы в реакции непрямого розетко-образования, определить их специфичность и изучить их субнопуляционный состав.
-
Сопоставить сроки регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов и антител в крови у кроликов, зараженных сифилисом.
-
Оценить клиническую значимость метода определения антигенсвязывающих лимфоцитов в тесте непрямого ро-зеткообразования у больных различными формами сифилиса в сравнении с известными методами диагностики.
-
Разработать количественный полуавтоматизированный метод регистрации антигенсвязывающих лимфоцитов, реагирующих с антигенами бледной трепонемы, на основе им-муноферментного анализа и сопоставить его чувствительность с методом непрямого розеткообразования.
Научная новизна
В современных условиях отмечено преобладание вторичного рецидивного и скрытого раннего сифилиса.
При клиническом обследовании на сифилис кожно-слизистая симптоматика обнаруживается не более, чем у 3/4 больных, что связано с отсутствием клинических проявлений болезни и при скрытых формах.
Информативность серологических тестов по комплексу серологических реакций (КСР) составляет 89,9% (положительные и слабоположительные результаты). Ложноотрицательные результаты выявлены у больных с первичным серонегативным и скрытым ранним сифилисом в 10% случаев. Ложноположительные результаты зарегистрированы при беременности. Информативность микробиологических тестов составила 24,6% по отношению к общему числу больных сифилисом.
У больных сифилисом выявлен Т-клеточный иммунодефицит, в основном, за счет снижения Т-хелперов (CD4+), что привело к снижению иммунорегуляторного индекса (Тх /Тс) до 1,3 (при норме 2,0).
В крови больных сифилисом впервые выявлены антигенспязы-
вающие лимфоциты, специфически реагирующие с антигенами бледной трепонемы в реакции непрямого розеткообразования, в количестве от 4 до 20 %. Все антигенсвязывающие лимфоциты несут на своей поверхности специфические антигенсвязывающие рецепторы к антигенам бледной трепонемы , из них число лимфоцитов с маркерами Т-лимфоцитов (CD3+) составляют 76,2%, антигенспецифичес-ких Т-хелперов (CD4+) - 50%, антигенсиецифических Т-супрессоров (CD8+) - 26,2%, В-лимфоцитов (CD19+) - 23%.
В крови кроликов, экспериментально зараженных сифилисом, обнаружено появление антигенсвязьшающих лимфоцитов в ранние сроки - через одни сутки после введения бледных трепонем, т. е. в инкубационном периоде, в то время как диагностические титры антител регистрируются не ранее, чем через 14 суток.
Доказано, что диагностический уровень антигенсвязывающих лимфоцитов (АСЛ) регистрируется практически у всех больных сифилисом в первые дни поступления в стационар, причем у больных первичным серонегативным сифилисом при отрицательных результатах КСР, в 100% случаев обнаруживаются антигенсвязывающие лимфоциты, реагирующие с антигенами бледной трепонемы.
Установлено, что в крови лиц, находившихся в бытовом контакте с больными сифилисом, при отсутствии клинических и серологических признаков заболевания, антигенсвязывающие лимфоциты обнаружены в 43,8% случаев, ложноположительные результаты КСР у беременных дифференцируются, наряду с реакциями иммунофлюо-ресценции и иммобилизации бледных трепонем, на основе определения антигенсвязывающих лимфоцитов.
Регистрация АСЛ в крови больных сифилисом на основе разработанного метода иммуноферментного анализа коррелирует с методом непрямого розеткообразования и имеет преимущества перед ним в производительности, объективной оценке результатов, экспрессно-сти и возможности регистрации "антигенсвязывающего рецепторного поля" лимфоцитов.
Практическая ценность работы
1. Разработан простой, высокочувствительный и специфичный
метод иммунодиагностики сифилиса, основанный на обнар
ужении в крови больных сифилисом антигенсвязывающих
лимфоцитов, специфически реагирующих с антигенами блед
ной трепонемы в реакции непрямого розеткообразования.
2. Указанный метод позволяет диагностировать первичный
серонегативный сифилис, выявлять контактных лиц, зараженных сифилисом и исключать ложноположительные результаты КСР.
3. Разработан высокочувствительный, полуавтоматизированный метод оценки "антигенсвязьгоающего рецепторного поля", основаїшьій на использовании иммуноферментного анализа, обладающий высокой специфичностью к антигенам бледной трепонемы, экспрессностыо, возможностью объективной регистрации результатов и производительностью.
Положения, выносимые на защиту
1. В современных условиях отмечается преобладание таких форм
сифилиса, как вторичный рецидивный и скрытый ранний сифилис.
При оценке диагностической значимости клинических методов выявления сифилиса кожно-слизистая симптоматика обнаруживается не более, чем у 3/4 части больных, что связано с отсутствием клинических проявлений болезни в при скрытых формах болезни.
Информативность серологических тестов по комплексу серологических реакций (КСР) составляет 89,9% (положительные и слабоположительные результаты). Ложноотицательные результаты выявлены у больных с первичным серонегативным и скрытым ранним сифилисом в 10% случаев. Ложноположительные результаты зарегистрированы при беременности. Информативность микробиологических тестов составила 24,6% по отношению к общему числу больных сифилисом. Информативность клинических, серологических (по КСР) и микробиологических методов диагностики сифилиса составляет 71,6%, 87,3%, 24,6% соответственно, что связано, с одной стороны, с изменением соотношения форм болезни с преобладанием вторичного рецидивного и скрытого раннего сифилиса, с другой стороны - отсутствием клинических проявлений и неинформативностью серореакций в инкубационный период заболевания, невозможностью диагностировать первичный серонегативный сифилис с помощью общепринятых серологических тестов.
2. Разработан новый метод иммунодиагностики сифилиса, осно
ванный на регистрации атигенсвязывающих лимфоцитов в реакции
непрямого розеткообразования, специфически реагирующих с анти
генами возбудителя, количественное определение которых позволяет
провести диагностику сифилиса, включая первичный серонегативный
сифилис, выявить зараженных среди контактных лиц и дифференци
ровать ложноположительные результаты КСР.
3. Разработан новый подход к иммунодиагностике сифилиса на основе определения антигенсвязывающих лимфоцитов, специфически реагирующих с антигенами бледной трепонемы на основе иммунофер-ментного анализа, обладающего высокой чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, объективизацией результатов тестирования, экпрессностыо и производительностью.
Апробация работы
Основные материалы исследования докладывались на научно-практических семинарах для врачей медицинской службы железной дороги (Ташкент,1998,1999), на научно-практическом семинаре кафедры кожных и венерических болезней 1 ТашГосМИ (Ташкент, 1999), на заседании Общества дерматовенерологов Ташкента и Ташкентской области (Ташкент,1999), научно-практическом семинаре кафедр кожных и венерических болезней, микробиологии с иммунологией и вирусологией, ЦНИЛ 1 ТашГосМИ (Ташкент,1999), научном семинаре "Новые методы иммунодиагностики заболеваний человека" в ЦНИЛ ТашИУВ (Ташкент,1999), научном семинаре в УзНИИДиВ (Ташкент,1999).
Внедрение результатов в практику
Разработанный метод определения антигенсвязывающих лимфоцитов в реакции непрямого розеткообразования внедрен в работу клинических лабораторий Таш.обл.КВД и ДорКВД и УзНИИДиВ. Выпущены методические рекомендации "Лабораторная диагностика сифилиса" для врачей общей практики (Ташкент, 1999).
Публикация результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи в журналах, получен 1 патент на изобретение РУз.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследований", трех глав собственных исследований, заключения, практических рекомендаций и списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 9 рисунками. Библиографический указатель включает 210 источников.
