Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности метаболических процессов растений в условиях дефицита кислорода 12
1.1. Гипоксия как стрессовый фактор в жизни растений 12
1.2. Дыхательный обмен растений в условиях гипо- и аноксии 14
1.3. Влияние анаэробиоза на обмен белков и активность ферментов. 16
1.4. Обмен органических кислот и аминокислот у растений в условиях кислородной недостаточности 18
1.4.1. Влияние гипоксии и повышенных концентраций СОг на содержание органических кислот в клетках растений 18
1.4.2. Влияние гипоксии и С02-среды на обмен аминокислот в клетках растений 19
1.5. Особенности действия СОг-среды на растения 24
ГЛАВА 2. Компартментация обменных процессов растений 30
2.1. Вакуолярный компартмент и его роль в организации обменных процессов в клетках растений 30
2.2. Роль вакуолярного компартмента в организации обмена органических кислот и аминокислот в клетках растений 33
2.3. Влияние гипоксии и высоких концентраций СОг
на состав вакуолярного фонда растительных клеток 37
ГЛАВА 3. Пути образования ис-гликозида и влияние факторов среды на его метаболизацию 41
3.1. Образование и локализация ИС-гликозида в клетках растений 41
3.2. Влияние регуляторов роста и гипоксии на скорость образования и утилизацию ИС-гликозида 43
ГЛАВА 4. Р-глюкозидазы и их роль в растениях 45
4.1. р-Глюкозидаза и ее роль в метаболизме олиго- и арил-гликозидов растений 45
4.1.1. Распространение и локализация р-глюкозидаз в растительных клетках 45
4.1.2. Физико-химические свойства растительных Р-глюкозидаз 49
4.1.3. р-Глюкозидазы и их активность в онтогенезе растений 59
4.1.4. Влияние факторов среды на активность р-глюкозидаз 62
Экспериментальная часть 64
ГЛАВА 5. Объекты и методы исследований 64
5.1. Объекты исследования 64
5.2. Методы исследования 64
5.2.1. Условия постановки опытов 64
5.2.2. Хроматографическое определение содержания свободных аминокислот 65
5.2.3. Исследование внутриклеточного распределения соединений с использованием ДМСО 65
5.2.4. Определение активности фермента р-глюкозидазы 70
5.2.5. Препаративное выделение ИС-гликозида из растений и его агликона в растениях гороха 70
5.2.6. Выделение цитоплазматической и клеточносвязанных молекулярных форм р-глюкозидазы 71
5.2.6.1. Выделение цитоплазматической Р-глюкозидазы из растений гороха 71
5.2.6.2. Выделение клеточносвязанных молекулярных форм р-глюкозидазы 71
5.2.7. Получение высокоочищенных препаратов
клеточносвязанных молекулярных форм Р-глюкозидазы 72
5.2.7.1. Фракционирование с помощью сульфата аммония 72
5.2.7.2. Гель-фильтрация 72
5.2.7.3. Аналитический электрофорез 73
5.2.8. Исследование кинетических характеристик Р-глюкозидазы 73
5.2.9. Определение количества белка 74
5.2.10. Статистическая обработка результатов 74
ГЛАВА 6. Исследование компартментализации аминокислот у бобовых и злаковых растений в условиях различной аэрации и при действии фитогормонов 75
6.1. Распределение свободных аминокислот по фондам клетки в бобовых и злаковых растений 75
6.2. Влияние гипоксии и повышенного содержание СОг на образование и компартментализацию аминокислот у растений с разной степенью устойчивости 78
6.3. Влияние фитогормонов на внутриклеточное распределение свободных аминокислот в проростках бобовых и злаковых растений 88
6.4. Влияние фитогормонов на внутриклеточное распределение свободных аминокислот в проростках бобовых растений, помещенных в условия разных газовых сред 91
ГЛАВА 7. Исследование клеточносвязанных молекулярных форм р - глюкозидазы проростков гороха 98
7.1. Выделение клеточносвязанной Р-глюкозидазы растений гороха .98
7.2. Получение высокоочищенных молекулярных форм Р - глюкозидазы из растений гороха 103
7.3. Исследование некоторых физико-химических и кинетических свойств клеточносвязанных молекулярных форм р - глюкозидазы проростков гороха 112
7.4. Изменение активности различных молекулярных форм (3-глюкозидазы в онтогенезе растений гороха 131
ГЛАВА 8. Влияние гипоксии и с02-среды на активность и свойства молекулярных форм р - глюкозидазы растений гороха 136
8.1. Действие гипоксии и СОг-среды на активность клеточносвязанной р-глюкозидазы проростков гороха 136
8.2. Физико-химические и кинетические свойства клеточно-связанных форм р - глюкозидазы растений, подвергнутых действию гипоксического стресса и СОг-среды 139
Заключение 146
Выводы 151
Литература
- Дыхательный обмен растений в условиях гипо- и аноксии
- Роль вакуолярного компартмента в организации обмена органических кислот и аминокислот в клетках растений
- Распространение и локализация р-глюкозидаз в растительных клетках
- Исследование внутриклеточного распределения соединений с использованием ДМСО
Введение к работе
Актуальность темы. Условия гипо- или аноксии являются нормальным этапом в ходе онтогенеза практически всех растений. Делаются попытки не только выяснить механизмы повреждения и адаптации растений в условиях кислородной недостаточности, но и создать растительные организмы, обладающие толерантностью к анаэробному стрессу как на молекулярном и клеточном уровнях, так и на уровне целого организма (Чиркова, 1998). При этом научные аспекты действия на растения стрессовых условий тесно соприкасаются и с проблемами защиты окружающей среды.
В зависимости от газового состава среды и длительности гипоксического воздействия изменяются ответные реакции растительного организма (Crawford, 1978; Вартапетян, 2005). Эффективным адаптационным механизмом служит перестройка аминокислотного обмена, направленная в сторону образования так называемых «стрессовых» аминокислот (Андреева, 1989). ГАМК запасается тканями растений в неблагоприятных условиях в больших количествах без повреждения клеток и выступает как легко мобилизуемая защищенная форма сукцината при восстановлении нормального дыхания благодаря блокированию ее утилизации через реакции цикла трикарбоновых кислот (Shelp, 1995). Местом локализации накопленной ГАМК может являться вакуоль, где обнаружено значительное содержание отдельных аминокислот (Francis, 1999; Андреев, 2001). К сожалению, размеры вакуолярных фондов свободных аминокислот изучены только лишь для клеток небольшого количества растений. Изменение же вакуолярного фонда аминокислот при стрессах, включая и гипоксический, практически ранее не исследовалось. Одним из путей утилизации избыточного количества ГАМК является включение ее в клетках проростков гороха в процессы образования агликона специфического соединения изосукцинимид-|3-гликозида (ИС-гликозид) (Zemlianukhin et al., 1984). Показано, что в расщеплении этого гликозида участвует [3-глюкозидаза,
которая представлена не только цитоплазматической, но и клеточносвязанной молекулярной формой (Ершова и др., 2000). Однако роль молекулярных форм клеточносвязанной р-глюкозидазы растений остаётся не достаточно изученной, а для условий гипоксического стресса практически не рассматривалась.
Цель исследования. Целью данной работы является изучение влияния гипоксии и повышенных концентраций диоксида углерода на компартментацию свободных аминокислот у растений с различной устойчивостью и активность молекулярных форм Р-глюкозидазы растений.
Задачи работы.
Изучить с использованием мембранотропного соединения ДМСО распределение ряда свободных аминокислот, включая ГАМК, между цитоплазматическим и вакуолярным фондами клеток бобовых и злаковых растений, различающихся устойчивостью, в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода.
Исследовать влияние регуляторов роста на процессы накопления и внутриклеточную компартментацию свободных аминокислот у растений с разным типом обмена веществ в условиях гипоксического стресса и СОг-среды.
Определить влияние гипоксии и повышенных концентраций углекислого газа на активность различных форм клеточносвязанной Р-глюкозидазы растений гороха.
Выяснить характер связывания р-глюкозидазы с клеточными стенками, а также исследовать динамику активности отдельных молекулярных форм р-глюкозидазы в онтогенезе растений гороха.
Изучить некоторые физико-химические и кинетические свойства молекулярных форм клеточносвязанной Р-глюкозидазы растений при нормальной аэрации, в условиях гипоксии и СОг-среды.
Научная новизна. Показана роль вакуоли в компартментации обмена не только вторичных метаболитов, но и ряда свободных аминокислот
(аспартат, глутамат, а-аланин, ГАМК), что имеет важное значение в процессах адаптации аминокислотного звена метаболизма растений, обладающих разной степенью устойчивости к условиям гипоксического стресса в клетках растений. Показано действие фитогоромонов кинетина и эпибрассинолида (ЭБ) на процессы накопления «стрессовых» аминокислот, а-аланина и ГАМК, и их внутриклеточную локализацию в условиях нормальной аэрации и при дефиците кислорода в клетках растений.
Установлено существование, наряду с цитоплазматической, нескольких связанных с клеточными стенками молекулярных форм Р-глюкозидазы растений гороха. Разработана схема очистки и получен электрофоретически гомогенный препарат адсорбированной молекулярной формы фермента |3-глюкозидазы. Исследованы физико-химические и кинетические параметры адсорбированной и ионосвязанной р-глюкозидазы. Показаны изменения активности отдельных молекулярных форм Р-глюкозидазы в ходе онтогенеза растений гороха.
Обнаружено, что высокие концентрации диоксида углерода вызывали более значительные изменения в накоплении и локализации свободных аминокислот в клетках растений, а также влияли на физико-химические свойства всех молекулярных форм Р-глюкозидазы растений гороха.
Практическая значимость. Отработана методика исследования внутриклеточного распределения свободных аминокислот между цитоплазмой и вакуолью с использованием мембранотропного соединения ДМСО у растений, которая может применяться при изучении компартментации и других соединений при действии стрессовых воздействий.
Проведенные исследования влияния фитогормонов кинетина и ЭБ на содержание и внутриклеточное распределение свободных аминокислот показали, что данные регуляторы роста можно использовать для повышения устойчивости растений к стрессовым факторам, в частности к гипоксии.
Разработанные способы выделения и очистки клеточносвязанной |3-глюкозидазы растений гороха могут быть использованы для получения ферментных препаратов в производственных и лабораторных условиях. Материалы работы используются в учебном процессе на кафедре биологии растений и микробиологии Воронежского государственного педагогического университета при чтении лекций по физиологии растений, а также при выполнении курсовых и дипломных работ.
Положения, выносимые на защиту:
1. Анализ объемов вакуолярных фондов клеток с использованием
ДМСО свидетельствует, что разные виды растений значительно различаются
по содержанию свободных аминокислот в этом клеточном компартменте.
2. В условиях гипоксии значительно возрастает роль вакуолярного
фонда в накоплении «стрессовых» аминокислот ГАМК и а-аланина и это не
зависело от видовой принадлежности растений.
Исследования действия фитогормонов кинетина и ЭБ показывают, что они могут сглаживать изменения в метаболизме растений, в частности в процессах образования и накопления «стрессовых» аминокислот (ГАМК, а-аланин), вызванных действием стрессовых факторов.
С использованием высокоочищенных (в том числе гомогенных) ферментных препаратов молекулярных, связанных с клеточными стенками, и цитоплазматической форм |3-глюкозидазы показано, что в условиях кислородной недостаточности изменялись величины Km и Vmax. СС^-среда вызывала в ряде случаев более значительные изменения, чем условия обычной гипоксии этих параметров.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международной научной конференции «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (Сыктывкар, 2002), конференции, посвященной 65-летию Ботанического сада им. проф. Б.М. Козо-Полянского (Воронеж, 2002), V съезде Общества Физиологов Растений России (Пенза, 2003), на 6-ой, 7-ой, 8-ой Пущинских школах-конференциях
молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2004 г.г.), XI съезде РБО (Барнаул, 2003), всероссийской научно-практической конференции (Ярославль, 2003), VII международной научно-практической экологической конференции «Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов» (Белгород, 2002), научно-практической конференции «Регуляция продуктивного процесса сельскохозяйственных растений» (Орел, 2006) и XV FESPB Congress (Lyon, France, 2006).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 19 публикациях, включая 9 статей и 10 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 181 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (8 глав), заключения, выводов и списка литературы (212 источника), приложения. Иллюстрированный материал включает 31 рисунков и 21 таблицу.
Работа выполнена в период обучения в аспирантуре, частично финансировалась по проекту Министерства образования и науки РФ в рамках тематических планов (2001-2003 годов), а также являлась частью научно-исследовательской работы кафедры, включенной в тематику РАН по проблеме «Растительный мир и его охрана».
Дыхательный обмен растений в условиях гипо- и аноксии
Анаэробный стресс широко распространен в природе. Примером организмов, переносящих длительное отсутствие кислорода, служат облигатные анаэробные бактерии, симбиотические азотфиксируюшие микроорганизмы и различные позвоночные и беспозвоночные животные (Hochachka, 1986.). Высшие растения могут переносить аноксию, используя, в зависимости от вида растения, более или менее эффективные механизмы защиты от этого вида стресса. Основной причиной пониженной доступности кислорода в почве является затопление, поскольку избыток воды в почвенном профиле нарушает газообмен между почвой и атмосферой (Erdmann, 1988): диффузия кислорода в воде идет в 10000 раз медленнее, чем в воздухе (Thompson, 1991.). Корни растений, чувствительных к аноксии, утрачивают способность поглощать элементы минерального питания, за этим следует преждевременное старение листьев. Более того, прекращение поглощения воды снижает водный потенциал клеток (Crawford, 1978.). Напротив, растения, живущие в условиях временного затопления, - это виды с хорошей адаптацией к аноксии.
Способность корней переносить анаэробные условия, когда кислород перестает поступать из атмосферы, тесно связана со способностью растений видоизменять свой обмен веществ. Чтобы выжить в отсутствие кислорода, растения строго контролируют такие показатели гомеостаза, как осмотический и ионный баланс, рН. Для этого растения регулируют скорости метаболических процессов и синтезируют специфические соединения (Косаковская, 1998).
В связи со спецификой воздействия кислородной недостаточности в первую очередь перестройки затрагивают процесс дыхания (Костина, 1992). В отсутствие кислорода, сопровождающимся повышением концентрации углекислоты, синтез АТФ в дыхательной цепи исключается. В результате, гликолиз остается единственным источником энергии, необходимой для поддержания активности клеток. Повторное окисление НАД-Н+ осуществляется реакциями анаэробного дыхания (ферментации), среди которых преобладает спиртовое брожение (Bertani, 1991.). При этом в расчете на одну молекулу глюкозы образуются всего две молекулы АТФ - против 38, синтезируемых в ходе аэробного дыхания; в результате, в первые же минуты действия стресса резко падает энергетический заряд клетки (Ricard, 1994.). Благодаря эффекту Пастера, увеличение энергопродукции достигается усиленным расходованием углеводов (Waters, 1991). Из-за недостатка энергии, необходимой для поглощения питательных элементов, резко подавляется передвижение Сахаров в корень и во многих случаях снижается уровень углеводов, которые доступны для анаэробного дыхания (Bertani, 1991). Свободные гексозы играют важную роль в поддержании осмотического потенциала клетки, и снижение их концентрации должно компенсироваться накоплением других соединений, например, аминокислот и органических кислот (Crawford, 1978.).
Недостаток кислорода в атмосфере оказывает ряд существенных изменений в метаболизме белков (Косаковская, 1998). Большинство авторов, исследовавших этот процесс, пришли к выводу, что гипоксия замедляет синтез белков (Войцековская, 1993; Чиркова, 1999, 2002). Однако в ряде случаев удавалось обнаружить образование новых белков и полипептидов, отсутствовавших в растениях, не подвергавшихся аноксическому воздействию, т. е. на фоне резкого замедления метаболических функций тканей развиваются защитные механизмы против гипоксии (выработка новых белков). При инкубации в течение 1,5 ч в атмосфере аргона наблюдалось значительное снижение включения аминокислоты метионина, поскольку вновь синтезированных полипептидов не обнаруживалось. Однако другая серия белков синтезировалась после более продолжительного анаэробиоза. По всей вероятности, появление ряда белков при кислородной недостаточности способствует поддержанию метаболизма (Vayda, 1988).
В условиях различного газового режима (N2- и атмосфера воздуха) содержание цитоплазматических белков в первые двое-трое суток могло возрастать на 30% по сравнению с исходным. Такое заметное возрастание суммарных белков в первые дни аноксии могло быть артефактом, вызванным недостаточно строгим анаэробиозом. Однако даже в условиях частичного анаэробиоза могут возникать новые «анаэробные» белки (Косаковская, 1998;Mujer, 1993).
В опытах с растениями ячменя и риса в анаэробных условиях показано образование ферментов, участвующих, соответственно, в синтезе аланина и путресцина (Muench, 1994; Reggiani, 1994). При анаэробном прорастании семян риса в проростках появлялась мРНК, специфичная для нитратредуктазы и нитритредуктазы (Mattana, 1994; Mattana, 1996). Глутаматсинтаза и глутаминсинтаза - это ключевые ферменты синтеза глутамата, играющие важную роль в ассимиляции нитратов и реутилизации аммония, высвобождающегося в катаболитических процессах. В колеоптилях риса зарегистрирована экспрессия двух форм глутаминсинтазы (ГС), пластидной ГС2 и цитоплазматической ГС1 (Mattana, 1994). Данные об экспрессии мРНК и белка позволяют предполагать, что в анаэробных условиях синтез ГС1 опережает синтез ГС2. Глутаматсинтаза (ГОГАТ) существует в виде двух изоформ, различающихся донорами электронов: НАД-Н+ и ферредоксином. В опыте с растениями риса показана анаэробная экспрессия ферредоксин-зависимой ГОГАТ, однако изоформа НАДНТОГАТ при этом не экспрессировалась (Mattana, 1996). Судя по экспрессии двух ферредоксин-зависимых ферментов, нитритредуктаза и глутаматсинтаза, в анаэробном обмене аминокислот участвует ферредоксин НАДФ-редуктаза (ФНР), фермент, восстанавливающий ферредоксин в лишенных хлорофилла тканях (Bowsher, 1992). Показано, что в колеоптилях риса экспрессируется корнеспецифичная форма ФНР - изоформа, которая восстанавливает ферредоксин, используя НАДФ-Н+ в качестве донора электронов (Mattana, 1997).
Роль вакуолярного компартмента в организации обмена органических кислот и аминокислот в клетках растений
Четкое пространственное расположение в клетке имеют непосредственные предшественники аминокислот - органические кислоты. Показано высокое содержание в вакуолях органических кислот, доля которых колебалась в пределах 60-80% общего содержания их в клетке. Так из кислот лимонного цикла чаще всего накапливается яблочная и лимонная кислоты. Они могут содержаться как в виде свободных кислот так и в виде различных солей. Щавелевая кислота встречается в виде слабо растворимой кальциевой соли с характерным строением кристаллов (Землянухин и др., 1988). Накопление в вакуолях органических кислот приводит к сдвигу рН в кислую сторону.
Результаты исследований свидетельствуют о способности вакуолей к накоплению аминокислот. Изучение биохимического состава изолированных вакуолей свидетельствовало, о том, что содержание в них аминокислот, органических кислот и белка варьирует на разных стадиях клеточного цикла (Измайлов и др., 1975). Причем максимальное количество аминокислот в вакуолях обнаружено в молодых клетках. В вакуолярном соке найдены все аминокислоты, содержащиеся в белках, в то время как небелковые аминокислоты и их амиды имели преимущественно экстравакуолярную локализацию (Alibert, 1982).
В вакуолях содержится довольно большой набор аминокислот, содержание которых достигает 60% (Farre, 2001) и близко к аминокислотному составу протопластов. Среди аминокислот неизменно преобладает аланин, на долю которого иногда приходится до 67% от их суммы (Давыдова, 1983; Дубинина, 1992.). Установлено значительное преобладание вакуолярного клеточного фонда валина над цитоплазматическим фондом. В вакуолях стареющих листьев овсяницы луговой обнаружено накопление пролина (Duggelin, 1988.), для листьев ячменя - фенилаланина (Homeyer, 1988). Глутаминовая и аспарагиновая кислоты, а также серии, глицин и аспартат как правило, обнаруживаются в следовых количествах, хотя, они образуются при фотосинтезе и транспортируются в вакуоль (Дубинина, 2001; Kaiser, 1982). Впрочем, содержание глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, являющихся по , видимому транспортными формами азота, в протопластах также не велико. Особенно большим колебаниям подвержено содержание глутамина, которое иногда может достигать 30 % от суммы, а большей частью определяется в следовых количествах.
При расчете содержания аминокислот на единицу протопластов и вакуолей оказалось, что между вакуолью и цитозолем существуют большие градиенты в концентрации отдельных аминокислот. Такие аминокислоты, как аланин, валин и у- аминомасляная кислота компартментированны практически полностью в вакуолях (Farre, 2001).
В работах (Ершова, Винокурова, 1998, 2001) проанализировано распределение ГАМК и ряда свободных аминокислот между цитоплазматическим и вакуолярным фондами клетки для растений гороха. Показано, что ГАМК и аланин имели преимущественно цитоплазматическую локализацию. В цитоплазме их содержание составляло от 65 до 72% от общего пула в клетке. В тоже время аспартат и глутамат были приблизительно равно распределены между цитоплазматическим и вакуолярным фондами клетки.
Трудно предположить общее правило, касающееся распределения аминокислот между вакуолями и вневакуолярным пространством. По-видимому, если синтез аминокислот превышает запрос на синтез белка в цитоплазме и экспорт из клеток, то аминокислоты транспортируются в вакуоли. Таким образом, баланс между синтезом аминокислот и их использованием в синтезе белка определяет вакуолярные пулы аминокислот в протопластах (Дубинина, 1992).
Суммарное содержание аминокислот в вакуолях мезофилла листа сахарной свеклы варьирует значительно в зависимости от окружающих условий, в частности освещения. В опытах было показано, что в вакуолях листьев после ночного интервала содержание аминокислот было на полтора порядка меньше, чем после 3-часового освещения (Измайлов, 1975). Вакуолярный пул аминокислот обуславливает независимость азотного метаболизма от окружающей клетку среды. Форма запасания азота в виде аминокислот имеет преимущество перед запасными белками, так как немедленно может использоваться в метаболизме. По мере необходимости хранящиеся аминокислоты мобилизируются и транспортируются в цитозоль, отсюда следует, что процентное содержание аминокислот подвержено большим колебаниям. Наоборот, концентрация аминокислот в цитозоле достаточно постоянна при различных условиях (Писхаренко, 1986).
Распространение и локализация р-глюкозидаз в растительных клетках
Для изучения свойств необходимы способы получения высокоочищенных препаратов фермента. Для очистки р-глюкозидазы растительного происхождения обычно используют методы белковой химии (Диксон и др., 1982). Для экстракции р-глюкозидазы из горца красильного использовали 2мМ ЭДТА (Minavi, 1996), из семядолей гороха- 0,03 % тритон Х-100. Для р-глюкозидазы из зрелых семян маша экстракция проводилась буфером, содержащим 1мМ ZnCl2 (1ч, 4С) (Dey, 1984); из листьев ячменя охлажденным раствором 200 мМ NaCl в 5 мМ К-фосфатном буфере (Li Zhen - Chag, 1989); из растений полыни 0,002 М Na- ацетатным буфером с 0,15 М NaCl, 1мМ МпС12 и СаСЬ (Kudabaeva, 1989).
Фракционирование сульфатом аммония использовали в очистке Р-глюкозидазы из семян риса в концентрации 40-50% (Nagahashi, 1984), листьев пшеницы (Розум, 1983), сладкого миндаля в концентрации 35-70% (Жданов и др., 1980), жасмина в концентрации 20-80% (Shang-sheng D, 1999), семян подсолнечника в пределах 30-65% (Жданов и др., 1980).
От низкомолекулярных примесей фермент р-глюкозидазу отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-150 с обогощением в 13 раз и выходом 30% (Srisomsap, 1996), ультрогеле АсА 44 - и ДЭАЭ - сефарозе CL - 6В (Lecas, 1991), RM - биогеле А и ДЭАЭ - биогеле A (Martinez, 1988), с помощью хроматофокусирования на полибуферном обменнике РВЕ - 94 (Rogalski, 1998), а также использовалась иммуно-цитолюминесценция и вакуумная инфильтрация (Kakes, 1985; Li Zhen - Chag, 1989). p-Глюкозидаза из проростков семян пшеницы очищена в 48 раз и с выходом 15% (Sue М., 2000), из плодов дынного дерева р-глюкозидаза очищена в 1000 раз (Hartman- Schreier, 1986).
Для дальнейшей очистки фермента используют электрофорез со свободной границей, зональный электрофорез на инертной поддерживающей среде, электорофорез в крахмальном геле (Диксон и др., 1982). Для р-глюкозидазы чаще всего применяется метод изоэлектрического фокусирования в стабилизированном градиенте рН (Eksittikul, 1988; Srisomsap 1996; Hartmann - Schreier, 1986.).
Для очистки р-глюкозидазы из проростков гороха авторами (Ершова, Винокурова, 1998-2001) была разработана система очистки, первой стадией которой явилось фракционирование гомогената сульфатом аммония 60-100% насыщения. В данном диапазоне концентрации сульфата аммония, р-глюкозидаза выпадает в осадок практически полностью. Полученный после центрифугирования осадок растворяли в фосфатно-цитратном буфере рН 5,2. При этом достигалась очистка фермента в 5,74 раза. Затем фракцию обессоливали на колонке с сефадексом G-25, уравновешенную 0,1 М фосфатно-цитратным буфером (рН 5,2), со скоростью 20 мл/час. Степень очистки составила 13,6 раз. Обессоленную фракцию наносили на колонку с сефадексом G-100. После гель-хроматографии удельная активность Р-глюкозидазы по сравнению с удельной активностью в гомогенате возрасла в 78,5 раз. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле показал наличие только одной полосы белка, что свидетельствует о гомогенности полученного препарата.
Очень часто у различных организмов находят несколько молекулярных форм р-глюкозидаз, отличающиеся рН и температурным оптимумами, молекулярным весом, изоэлектрической точкой, субстратной специфичностью, и по-видимому, функциональной ролью (Dey, 1984). Из семян и листьев яблони выделили 3 молекулярные формы Р-глюкозидазы, сильно различающихся по удельной активности и сродству к флоридзину, амигдалину и салицину. Методом вакуум - инфильтрацией получали апопластную фракцию ферментов: растворимых и слабосвязанных (ионо-и ковалентно) (Li Zhen-Chag, 1989). Множественные формы арил-р-глюкозидаз были обнаружены и в семенах подсолнечника, откуда выделили 2 формы Р-глюкозидазы (Жданов и др., 1980). Солюбилизированную ацетоном Р-глюкозидазу из проростков горчицы в результате очистки удалось разделить на 3 формы.
Молекулярная масса р-глюкозидазы, выделенной из различных организмов сильно варьирует (таблица 1).
Молекулярная масса р-глюкозидазы дальбергии (Daldergia cochienensis L.) 330 кД (нативная форма фермента) и 66 (денатурированная) (Chantragan, 1996). У семян пшеницы (Triticum aestivum L.) р-глюкозидаза представляет олигомер 260-300 кД с субъединицами 60-58 кД (Sue, 2000), корневища (Costus speciosus L.) -димер ПО кД (субъединицы 54 и 58 кД) (Kentaro, 1996), ягод винограда (Musckat) 98 и 50 кД (Lecas, 1991), маниока съедобного (Manichot esculenta L.) олигомер - субъединица 63 кД (Eksittikul, 1988), колеоптилей кукурузы субъединица бОкД (Esen, 1992), ксилема сосны (Pinus contoetaL.) 60 и 50 кД (Dharmawardhana, 1994), плоды дынного дерева (Cariae papaya L.) 54 и 27 кД (Hartmann-Schreier, 1986), цветков жасмина мономер 35-38 кД (Dong S, 1999). При определении молекулярной массы для цитоплазматической Р-глюкозидазы проростков гороха было установлено, что ее значение составляет 63,0 кД (Ершова, Винокурова, 2000).
Исследование внутриклеточного распределения соединений с использованием ДМСО
Активность р-глюкозидазы определяли с ИС-гликозидом в качестве субстрата по количеству отщепившейся свободной глюкозы. Состав инкубационной смеси: 0,1 мл ферментного экстракта смешивали с 0,1 тМ раствора ИС-гликозида в 1 мл 0,1 М фосфатно-цитратного буфера (рН 4,8 - 5,2). Смесь инкубировали при 37С в течение 30 минут. Реакцию останавливали, добавляя 1 мл 0,2 М раствора Ш2СО3. Оптическую плотность растворов измеряли при длине волны 490 нм на фотоэлектроколориметре КФК-2 (Россия). Содержание глюкозы измеряли с помощью глюкозооксидазного метода.
За единицу активности р-глюкозидазы (Е) принимали то количество фермента, которое катализировало расщепление 1 мкмоль-субстрата за 1 минуту. Удельную активность фермента выражали в Е на 1 мг белка. Белок определяли методом Lowry (Lowry et al.,1951).
Препаративное выделение ИС-гликозида из растений Выделение ИС-гликозида проводили после хроматографического разделения гомогената (Землянухин, Ершова, 1977) Хроматографическое разделение проводили на бумаге «Ленинградская С» в системе растворителей: н.бутанол: уксусная кислота: вода (40:10:50).
Для количественного определения отмеченные участки хроматограммы вырезали, элюировали подогретой водой на водяной бане при t - +60 С. Гликозид (0,1 мл) фотометрировали в 4 мл воды при X - 212 нм на приборе "СФ-56" (Россия). Расчет содержания соединений проводили по предварительно построенным калибровочным кривым и выражали в мг или мкМ на 1 г сырой массы. 5.2.6. Выделение цитоплазматической и клеточносвязанных молекулярных форм Р-глюкозидазы
Выделение цитоплазматической р-глюкозидазы из растений гороха Для выделения цитоплазматической р-глюкозидазы использовали методику (Чкаников и др., 1969), отработанную для проростков гороха (Винокурова, 2001). Навеску листьев (5 г) 10-дневных проростков гороха гомогенизировали с четырехкратным объемом среды выделения следующего состава: фосфатно-цитратный буфер (рН 7,0) с 0,4 М сахарозой и 0,01 М фосфатом калия, настаивали в течение часа. После фильтрования через 4-х слойную ткань гомогенат центрифугировали при 8000 g 30 минут.
Выделение клеточносвязанных молекулярных форм Р глюкозидазы Для выделения клеточносвязанных форм фермента использовали методику Чканикова и Takashi (Чкаников и др., 1969; Takashi, 1997). Навеску листьев (20 г) гомогенизировали с четырехкратным объемом среды выделения: 0,1 М фосфатно-цитратный буфер (рН 7,0) с 0,4 М сахарозой и 0,01 М фосфатом калия. Экстракт фильтровали через плотную нейлоновую ткань, доводя объем до 80 мл. Оставшийся осадок клеточных стенок отмывали 20 мл 0,1 М фосфатно-цитратного буфера (рН 6,0), фильтровали и получали адсорбированную форму Р-глюкозидазы. Далее осадок клеточных стенок обрабатывали в течении 4-х часов при постоянном перемешивании 1М NaCl в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере (рН 4,8) и полученную фракцию центрифугировали 20 минут х 8000 об/мин. Надосадочная жидкость содержала ионосвязанную форму р глюкозидазы. Оставшаяся после всех процедур обработки фракция клеточных стенок содержала ковалентносвязанную форму фермента Р-глюкозидазы (Чкаников и др., 1969; Takashi, 1997).
В предварительных опытах были подобраны концентрации сульфата аммония, при которой фермент выпадает в осадок. При этом использовали концентрации соли 30-100% насыщение растворов сульфатом аммония. Во время высаливания клеточносвязанной р-глюкозидазы осуществляли постоянный контроль за величиной рН. Одновременно анализировали на наличие ферментной активности надосадочную жидкость и выпадший осадок. Установлено, что высаливание фермента происходило при использовании сульфата аммония в интервале от 60 до 100% насыщения.
Для гель-фильтрации использовали сефадексы G-25 и G-100 (Phrmaceae, Швеция). Колонки готовили из стекла, оттягивая один конец, при этом стремились к наличию минимального холостого объема. Сефадекс G-25 набухал в течение 3, a G-100 - в течение 72 часов в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере (рН 7,0) с добавлением 0,02% раствора азида натрия. Колонки наполняли в токе буфера за счет гидростатического давления, хранили в холодильнике и промывали перед работой 0,1 М фосфатно-цитратным буфером (рН 4,8).
