Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1. Симбиотическая азотфиксирующая система бобовых растений 10
1.1. Биологическое значение симбиотической фиксации азота 10
1.2. Азотфиксирующие микроорганизмы 11
1.3. Этапы формирования бобово-ризобиального симбиоза 13
1.4. Образование клубенька 15
1.5. Бактероид 17
1.6. Нитрогеназа 19
1.7. Генетика азотфиксирующего симбиоза 21
2. Взаимоотношения партнеров симбиоза на уровне разделяющих их медиальных зон 25
2.1. Роль перибактероидного пространства 25
2.2. Роль перибактероидной мембраны 28
2.2.1. Транспорт метаболитов через перибактероидную мембрану 29
2.2.2. Дикарбоксилатньїй переносчик перибактероидной мембраны 31
2.2.3. Нодулин 26 32
2.2.4. АТФазы перибактероидной мембраны 33
2.2.5. Транспорт Н* и NH/ через перибактероидную мембрану 34
2.2.6. Интеграция метаболических взаимоотношений партнеров симбиоза через перибактероидную мембрану 35
Экспериментальная часть 47
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования 47
1. Выращивание растений 47
2. Получение фракции бактероидов, симбиосом и везикул перибактероидной мембраны из корневых клубеньков бобовых 4S
3. Регистрация мембранного потенциала (Ду) и трансмембранного градиента рН (АрН) перибактероидной мембраны 49
4. Регистрация выхода Са из симбиосом 50
5. Регистрация поглощения Са симбиосомами и везикулами перибактероидной мембраны 50
6. Регистрация активного транспорта Са через перибактероидную мембрану 51
7. Электронномикроскопическая цитохимия аккумуляции кальция в клетках клубеньков и симбиосомах 51
8. Определение нитрогеназной активности клубеньков и изолированных из них симбиосом 52
9. Определение активности НАДН-зависимой малатдегидрогеназы клубеньков 53
10. Регистрация осмотических изменений объема симбиосом 54
ГЛАВА III. Кальций аккумулирующая функция симбиосом 55
1. Субклеточная локализация Са в клетках корневых клубеньков люпина желтого и бобов при эффективном и неэффективном симбиозе 55
2. Действие Са2+-активных соединений и экзогенного Са2> на симбиосомальную компартментацию этого катиона у люпина желтого и бобов 62
3. Обсуждение 72
ГЛАВА IV. Транспорт Са через перибактероидную мембрану 78
1. Са2' -транслоцирующая АТФаза 78
1.1. Электронномикроскопическая визуализация аккумуляции Са в симбиосомах люпина желтого в присутствии АТФ и Mg 79
1.2. Идентификация и характеристики кальциевого насоса 82
1.3. Обсуждение 88 2. Са2+-каналы 91 2.1. Действие блокаторов Са -каналов на распределение и перераспределение Са в симбиосомах in situ на фоне Са2+-дефицита 92
2.2. Действие верапамила на выход Са из симбиосом бобов в присутствии ЭГТА и при деполяризации перибактероидной мембраны 94
2.3. Обсуждение 99
ГЛАВА V. Включение Са2+ в контроль нитрогеназнои активности 101
1. Некоторые эпи- и генетические аспекты детерминирования активности нитрогеназы кальцием 101
2. Действие Са - активных соединений (ЭГТА, ионофор А23187) на нитрогеназную активность симбиосом люпина желтого и бобов in vivo и in vitro 104
3. Действие блокаторов кальциевых каналов и ЭГТА на нитрогеназную активность корневых клубеньков и симбиосом бобов 107
4. Возможные механизмы действия Са2+ на процессы, определяющие азотфиксирующую активность клеток корневых клубеньков бобовых 109
5. Обсуждение 120
Заключение 125
Выводы 129
Список литературы
- Биологическое значение симбиотической фиксации азота
- Получение фракции бактероидов, симбиосом и везикул перибактероидной мембраны из корневых клубеньков бобовых
- Действие Са2+-активных соединений и экзогенного Са2> на симбиосомальную компартментацию этого катиона у люпина желтого и бобов
- Электронномикроскопическая визуализация аккумуляции Са в симбиосомах люпина желтого в присутствии АТФ и Mg
Введение к работе
Биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы - глобальный процесс, от изучения механизмов которого зависит решение целого ряда важнейших проблем теоретического и практического значения. Среди последних: расширение круга способных к симбиотическому усвоению азота сельскохозяйственных культур, повышение продуктивности и накопления в них белка за счет интенсификации эффективности бобово-ризобиального симбиоза, обогащение почв биологическим азотом, улучшение на этой основе их экологического состояния и др.
Благодаря новым методическим подходам, базирующимся на достижениях химии, физико-химической биологии, генетики, агрономии и растениеводства, к настоящему времени значительно расширился круг фундаментальных исследований в области симбиотической азотфиксации. Это даёт основание для оптимистического взгляда на решение актуального вопроса - удовлетворения потребностей человечества в пищевом и кормовом белке, дефицит которого остается острой проблемой. Надо полагать, что в XXI веке многие современные технологии, направленные на получение и применение синтетических азотных удобрений, начнут уступать свои лидирующие позиции практическим инновациям по интенсификации биологической фиксации молекулярного азота. Начиная с 70-х годов, азотфиксация уже стала реально рассматриваться как одна из альтернативных областей, имеющая первостепенную важность для научных исследований в области сельского хозяйства. На основании современного научного прогноза ожидается, что к 2100 году урожай зерновых и бобовых за счет биологической азотфиксации достигнет более 100 ц/га (Brady, 1982).
Начало истории разработки проблемы биологической фиксации азота воздуха восходит к классическим трудам Ж. Б. Бусенго. Он не только построил научную теорию питания растений минеральным азотом (1837 г.),
7 но и впервые показал способность бобовых «усваивать» молекулярный азот. С тех пор был пройден огромный путь в разработке проблемы. На смену агрономическому приходили более новые - физиологические, биохимические и генетические подходы. Но самым важным на этом пути было событие, связанное с пионерскими опытами Дж. Карнахана по экспериментальному выделению и идентификации нитрогеназы - реального фермента, обеспечивающего фиксацию молекулярного азота микроорганизмами (Carnahan et al., 1960).
Значительными достижениями в этой области в период с 1960-х годов следует рассматривать результаты исследований по структуре и регуляции нитрогеназы, её" потребности в АТФ, ферредоксину и флаводоксину как донорам электронов, гидрогеназе, поглощающей Нг, легтемоглобину, обеспечивающему защиту нитрогеназы от кислорода, регуляции ключевых ферментов метаболизма углерода и азота, а также др. В числе последних отметим расшифровку мультигенной природы азотфиксирующего симбиоза растений.
Анализ результатов работы 13-ти Международных конгрессов по фиксации молекулярного азота (International Congress on Nitrogen Fixation), 20 Североамериканских конгрессов, посвященных этой теме (North American Conference on Symbiotic Nitrogen fixation), 5 Европейских конференций по бобовым ( European Conference on Grain Legumes) и других научных мероприятий дают основание считать, что в число приоритетных направлений по проведению исследований в этой области в настоящее время выдвигаются:
Химия и биохимия нитрогеназы и ее влияние на другие механизмы, функционирующие в азотфиксирующих микроорганизмах;
Тонкие системы обмена сигналами между партнерами симбиоза, обуславливающие формирование симбиотического аппарата;
Разнообразие и эволюция азотфиксирующих микроорганизмов, их систематизация и модификация на основе молекулярно-генетических методов;
Регуляция ключевых ферментов азотфиксирующей системы;
Окружающая среда и азотфиксирующая система.
Среди этих направлений большое значение придается малоизученной проблеме - изучению механизмов взаимоотношений партнеров симбиоза. Новым подходом на этом пути явились исследования, совершенно по-новому трактующие традиционные фундаментальные проблемы физико-химической биологии взаимоотношений симбионтов на уровне пространственно разобщающих их зон — перибактероидной мембраны (ПБМ) и перибактероидного пространства (ПЫТ). Стимулом к изучению этих вопросов послужил тот факт, что если в азотфиксирующей системе бобовых не формируется ПБМ, то такая система по азотфиксирующему признаку оказывается неэффективной. Кроме того, изучение биогенеза и функций ПБМ имеет важное общебиологическое значение с точки зрения понимания происхождения эукариотической клетки, в которой хлоропласты, митохондрии и ядро также, вероятнее всего, возникли на основе симбиогенеза.
Несмотря на достигнутый прогресс в понимании роли ПБМ в регуляции симбиотических взаимоотношений на уровне метаболитов (Измайлов, 1996; Udvardi et al., 1997), до сих пор ограничены представления о вкладе данной мембраны в регуляцию ионных потоков, в частности, ионов кальция (Измайлов, 2003). Между тем, этот ион играет большую роль в развитии растительной клетки (Hepler, Wayne, 1985) и является важнейшим регулятором внутриклеточных процессов в растении (Sanders et al., 1999; Blatt, 2000), будучи вторичным мессенджером в передаче экто- и эндосигнала, участвует в регуляции транслокации других ионов, например, калия. Остаются неясными вопросы, связанные с механизмами транспорта Са2+ через симбиотическую мембрану, созданием Са-дискретных пулов в инфицированной клетке, участием этого катиона в регуляции ключевых процессов и тем самым установлении мутуалистического типа взаимоотношений про- и эукариотических клеток, направленных на реализацию азотфиксирующих свойств всей симбиотической системы.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель работы состояла в изучении механизмов участия кальция во взаимоотношениях через симбиотическую - ПБМ про- и эукариотических клеток клубеньков люпина желтого и бобов, направленных на реализацию азотфиксирующей активности их симбиотических систем.
В связи с этим разрабатывались следующие проблемы:
Компартментация кальция в неинфициров энных и инфицированных азотфиксирующих клетках корневых клубеньков.
Роль симбиосомы в запасании кальция в инфицированных клетках клубеньков.
Идентификация и характеристика локализованных в перибактероидной мембране Са-транспортных систем: Са2+ -транслоцирующей АТФазы, Са-каналов.
Сопряженность процессов аккумуляции Са2+ симбиосомой и его включения в контроль нитрогеназной активности клубеньков.
Механизмы действия Са2+ на процессы, определяющие азотфиксирующую активность клубеньков.
Биологическое значение симбиотической фиксации азота
В процессе образования симбиотической системы бактериальные и растительные клетки клубенька претерпевают структурные и метаболические изменения, что позволяет им выполнять функцию фиксации N2 и ассимиляции продукта его восстановления - NH3.
Развитие микросимбионта внутри растительной клетки включает три стадии: незрелые бактероиды, зрелые бактероиды, стареющие бактероиды (Андреева, 1992). В зрелых бактероидах находится нитрогеназный комплекс, восстанавливающий молекулярный азот при наличии АТФ и "активированных электронов". В инфицированной клетке синтезируется леггемоглобин — гемопротеид, ограничивающий доступ кислорода к бактероидам — необходимое условие их жизнедеятельности и активности нитрогеназы. Продукт азотфиксации - аммиак выходит из бактероида в растительную клетку, где на его основе синтезируются аминокислоты и уреиды с помощью соответствующих ферментов азотного обмена.
В бактероидах находится большое количество лютеиновых и липопротеидных гранул, высокое содержание гликогена и поли-3-оксимаслянной кислоты (Bergersen, Turner, 1968). Адаптация бактероидов к условиям симбиоза приводит к перестройке их дыхательной цепи, затрагивающей терминальные оксидазы (цитохромы с 552 и Р450) (Appleby et al., 1981). Бактероиды отличаются от бактерий повышенной проницаемостью мембраны (van Brussel et al,, 1977), что облегчает обмен субстратами, продуктами азотфиксации и сигнальными молекулами между растительной клеткой и эндосимбионтом.
Клетки, инфицированные бактероидами, приобретают ряд структурных особенностей. Их отличительной чертой является наличие большого количества митохондрий (Werner, 1978), которые располагаются по периферии и обладают значительно более крупными размерами, большим числом крист по сравнению с аналогичными органеллами неинфицированных клеток (Андреева и др., 1995). Число митохондрий на единицу площади цитоплазмы в инфицированных клетках клубеньков сои в 4 раза больше, чем в неинфицированных (Newcomb et al, 1985). Высокое содержание митохондрий позволяет генерировать достаточное для азотфиксации количества энергии, а их пристеночное расположение облегчает к ним доступ кислорода (Goodchild, Bergersen, 1966). В связи с переходом бактерии в стадию бактероидов, в растительной клетке наблюдается гипертрофия цитоплазмы и ядра (Dart, 1977; Libbenga et al.,1973), уменьшаются или полностью исчезают вакуоли (Хайлова, 1978). Происходит разрастание канальцев эндоплазматического ретикулюма (ГЭР), увеличение числа пластид, усиливается синтез крахмала (Мишустин, Шильникова, с.77, 1973). В результате создаётся уникальная система, восстанавливающая молекулярный азот более эффективно, чем свободноживущие азотфиксаторы, хотя восстановление азота как свободноживущих, так и симбиотических азотфиксаторов осуществляется при участии ферментативного комплекса, нитрогеназаы (Postgate, 1970).
Восстановление молекулярного азота до аммиака осуществляется в бактероидах с участием нитрогеназы. Она катализирует три сопряжённые реакции: восстановление N2 в NHj в присутствии АТФ и донора электронов; гидролиз АТФ до АДФ и неорганического фосфата; АТФ-зависимое выделение Н2 (Шилов, 1974). Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью. Кроме азота она может катализировать реакции восстановления ряда других субстратов: Н4, N0, цианида, изоцианида, азида, ацетилена (Dilworth, 1966; Hardy, Knight, 1967; Hardy et al., 1968).
Нитрогеназа состоит из двух белков - Fe-белка и MoFe-белка. Первый из них имеет молекулярную массу 56000-67000, является димером и содержит негеминовое железо, связанное непосредственно с атомом серы белка. Второй - тетрамер, с молекулярной массой 200000-270000, содержит негеминовое железо и два атома молибдена. Оба белка нитрогеназы инактивируются кислородом. Особенно чувствителен к кислороду Fe-белок. Эванс с сотрудниками высказали предположение, что в клубеньках бобовых растений повреждающее действие кислорода на нитрогеназу объясняется образованием перекисей. Зашита от действия кислорода осуществляется ферментативной системой, разрушающей перекиси при участии аскорбиновой кислоты и глютатиона (Evans et al., 1987).
Защиту нитрогеназного комплекса от свободного кислорода осуществляет специализированный белок - леггемоглобин. Это гемопротеид, полипептидная часть которого синтезируется в протоплазме растительной клетки, а простетическая геминовая часть - в бактероидах (Кретович, 1987; Кретович, 1994). Молекулярная масса леггемоглобина составляет 15000-16000. Он локализуется в цитоплазме растительной клетки. Дискуссионным остаётся вопрос о его локализации в ПБП (Измайлов, 1996). Леггемоглобин синтезируется на последних стадиях формирования симбиоза и составляет 30-40% всех растворимых белков цитозоля растительной клетки клубенька, придавая ему ярко-розовую окраску. Леггемоглобин является естественным индикатором активности симбиоза. Функция леггемоглобина заключается в связывании кислорода и к ограничении его доступа к нитрогеназному комплексу и дыхательной цепи бактероида. Деградация леггемоглобина оказывает ингибирующее действие на активность симбиотической азотфиксации.
Для работы нитрогеназы необходима энергия, поставляемая комплексом Mg-АТФ, который связывается с Fe-белком. Для гидролиза Mg-АТФ до Mg-АДФ и неорганического фосфата нужны оба компонента нитрогеназы, т.е. комплекс Fe-белка и MoFe-белка (Лихтенштейн и др., 1978; Сырцова, 1989). Mg-АДФ является мощным ингибитором нитрогеназы, поэтому соотношение Mg-АТФ и Mg-АДФ, образующееся в процессе азотфиксации, является важным фактором активности нитрогеназы. Каталитические центры переноса электронов и гидролиза АТФ находятся в зоне, связывающей оба белка олигомера нитрогеназы, образуя как бы мостик между ними (Thorneley, 1990). Эти данные получены на основе опытов in vitro. Расход же энергии на азотфиксацию in vivo очень велик. Бактероиды Rhizobium для восстановления в аммиак одной молекулы N2 должны израсходовать от 25 до 35 молекул Mg-АТФ.
Нитрогеназа катализирует восстановление ионов водорода до молекулярного водорода. Восстановление происходит при участии АТФ и Mg2+, причём субстратами являются гидратированные ионы водорода. Некоторые штаммы клубеньковых бактерий обладают ферментной системой, катализирующей окисление части молекулярного водорода, образующегося под действием нитрогеназы (рециклизация водорода). Таким образом, клубеньковые бактерии имеют источник дополнительной энергии, необходимой для превращения молекулярного азота в аммиак. Однако ещё Вильсон (Wilson, 1940) показал, что водород является ингибитором процесса азотфиксации у красного клевера.
Получение фракции бактероидов, симбиосом и везикул перибактероидной мембраны из корневых клубеньков бобовых
Выделение субклеточных структур проводили при +4С путем центрифугирования гомогената корневых клубеньков в ступенчатом градиенте перкола— 10, 25, 50% для эффективных клубеньков люпина желтого и 10,25 и 60% для эффективных клубеньков бобов.
Для этого свежесобранные корневые клубеньки, промытые дистиллированной водой с ЭДТА, а затем без ЭДТА, осторожно гомогенизировали в среде следующего состава: 0,4 М сахароза, 10 мМ ГФ, 26мМ антиоксиданта БГТ, 3 мМ Na2 ЭДТА, 3 мМ MgSO , 30 мМ трис-МЭС, рн-7,6. Гомогенат фильтровали через капроновую ткань и наносили на трехступенчатый градиент перкола и затем центрифугировали при 5000 х g (30 мин). Эта процедура позволяла разделить бактероиды, окруженные ПБМ, цитозольную фракцию растительных клеток клубенька и бактероиды без ПБМ. Далее фракция бактероидов с ПБМ, собранная на интерфейсе 25/50 % перкола, подвергалась дополнительной очистке от перкола центрифугированием при 5000 х g (20 мин) в изотонической среде, содержащей 0,4 М сахарозы, 10 мМ ГФ, 2 мМ ДТТ, 1 мМ Na2 ЭДТА, 0,5 мМ БГТ, 1 мМ MgSO , 30 мМ трис-МЭС, рН-7,2.
Полученный таким образом осадок бактероидов, окруженных ПБМ, далее ресуспендировали в гипоосмотической среде (10 мМ ГФ, 2мМ ДТТ, 0.5 мМ БГТ ) под давлением, создаваемым путём пропускания суспензии через шприц для более полного разрушения ПБМ.
Гомогенат, полученный после гипоосмотического шока, наносили на двуступенчатый градиент сахарозы 25/40%, содержавшей 15 мМ трис-МЭС рН-7,0 , центрифугировали на ультрацентрифуге L5 ("Beckman", США), ротор SW 40 при 159,6 тыс. g в течение 90 мин. Фракцию везикул ПБМ собирали в интерфейсе 25/40% - сахарозы, бактероиды без ПБМ - в осадке.
Белок во фракции симбиосом, бактероидов, везикул определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976), предварительно обрабатывая их 0,05%-ным Тритоном Х-100 и используя в качестве стандарта сывороточный альбумин.
3. Регистрация мембранного потенциала (Д\у) и трансмембранного градиента рН(дрН) перибактероидной мембраны За кинетикой образования на ПБМ Д\у и ДрН следили по изменению разности поглощений при 590 и 610 нм (значение при 590 нм минус значение при 610 нм) и 492 и 540 нм (значение при 492 нм минус значение при 540 нм) потенциал чувствительного зонда оксонола VI (Apell, Bersch , 1987) и проникающего ДрН-индикатора акридинового оранжевого (Palmgren , 1991), соответственно. Оптические измерения проводили при комнатной температуре (20 - 25С) на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония) в двухволновом режиме работы прибора в кюветах с длиной оптического пути 1 см без перемешивания.
В случае регистрации Ац/ по изменению флуоресценции оксонола VI измерения проводили на спектрофлуориметре Hitachi-850 (Япония). Длина волны возбуждающего света составляла 580 нм, а испускаемого - 630 нм, ширина щели 6 нм. Другие условия были такие же, как и при абсорбционных измерениях Д\у.
Основная среда инкубации содержала 0,4 М сорбит, 3 мМ MgS04, 20 мМ MES/BTP (рН-6,8 или 5,5) и 4 мкМ оксонола VI или 16 мкМ акридинового оранжевого. Концентрация белка в препаратах симбиосом и везикул ПБМ составляла в пробах 200-400 и 100-150 мкг/мл соответственно.
4. Регистрация выхода Са2+ из симбиосом За выходом Са из изолированных симбиосом следили по изменению разности поглощений при 720 и 650 нм (ДА 72о-«5о) непроникающего через биологические мембраны Са -индикатора арсеназо ПІ (Thomas , 1982), добавленного в концентрации 19 мкМ к инкубационной смеси, содержащей 0,4 М сорбит, 20 мМ Hepes- ВТР (рН 7,0), 30 мМ КС1 и примерно 80 мкг общего симбиосомального белка. Спектрофотометрические измерения проводили при комнатной температуре на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония) в двухволновом режиме работы прибора.
5. Регистрация поглощения Са симбиосомами и везикулами ПБМ За поглощением Са2+ изолированными симбиосомами и везикулами ПБМ следили по изменению разностей поглощений при 720 и 650 нм (ДА 720-650) непроникающего через биологические мембраны Са -индикатора арсеназо III. Измерения проводили при комнатной температуре на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония) в двухволновом режиме работы прибора. Инкубационная смесь содержала 0,4 М сорбита, 20 мМ Hepes- бис- трис-пропана (рН 7,2 ), 3 мМ Mg S04, 27 мкМ арсеназо III и 100-150 мкг мембранного белка. Процесс поглощения Са2+ выделенными мембранными препаратами инициировали путём добавления к ним 1мМ Na2-ATO или 3 мМ Mg S04.
6. Регистрация активного транспорта Са2+ через ПБМ За активным транспортом Са2+ через ПБМ изолированных симбиосом следили по изменению флуоресценции при 530 нм проникающего через мембраны Са индикатора хлортетрациклина (Dixon et al., 1984), возбуждая её светом при 380 нм. Измерения проводили на спектрофлуориметре Hitachi -850 (Япония). Инкубационная смесь содержала 0,4 М сорбита, 20 мМ Hepes-бис- трис- пропана (рН 7,2 ), 1 мМ ЭГТА, 100 мкМ Mg S04 , 20 мкМ хлортетрациклина и примерно 50 мкг симбиосомального белка. Процесс активного поглощения Са + запускали после достижения стационарного уровня кинетики пассивного распределения хлортетрациклина между симбиосомами и инкубационной смесью путём добавления в неё 1мМ Na2-АТФ.
Действие Са2+-активных соединений и экзогенного Са2> на симбиосомальную компартментацию этого катиона у люпина желтого и бобов
При слабоэффектнвном симбиозе значительных изменений ультраструктуры инфицированных клеток не происходило. Форма и размеры бактероидов соответствовали норме (эффективному симбиозу), объем ПБП значительно не изменялся. При 2 ммоль кальция количество гранул в бактероидах было понижено, мелкие гранулы выявлены на ПБМ (рис. 7а). При повышении снабжения растений кальцием (4.5 и 7.0 ммоль) количество гранул в цитоплазме бактероидов было невелико, однако количество и размер их на ПБМ увеличивались (рис. 76). Они обнаруживались в небольшом количестве в ПБП. При 12 ммоль кальция не происходило существенного увеличения числа гранул в бактероидах, но наблюдалось резкое увеличение размера гранул к их числа в ПБП (рис. 7в). При этом появлялось значительное количество клеток, находившихся в состоянии деградации. Такие клетки наблюдались не только при избыточной дозе кальция, но и при оптимальном снабжении им растений, что может говорить о раннем старении инфицированных клеток при слабоэффективном симбиозе. В этом случае гранулы продукта реакции хаотично накапливались во всех компартментах клетки.
Таким образом, различное обеспечение растений кальцием в процессе их роста отражалось на аккумуляции того катиона в симбиосомах, причем в случае эффективного симбиоза она принимала на себя функцию главного Са-аккумулирующего компартмента.
Действие Са-активных соединений и экзогенного кальция на симбиосомальную компартментаїгаю этого катиона у люпина желтого и бобов Нами были проведены опыты на корневых клубеньках, где искусственным путем уменьшали эндогенный пул кальция в симбиосомах под действием Са-ионофора и ЭГТА. Локализацию Са определяли электронно-микроскопически с помощью пироантимоната калия. а также на изолированых симбиосомах, где Са выявлялся с помощью прс пикающего флуоресцентного индикатора Са2+ - хлортетрациклина.
Результаты исследований субклеточной локализации Са в инфицированных клетках клубеньков люпина желтого, выращенных при дозе кальция в питательной среде 3 ммоль, показали, что многочисленные электронно-плотные гранулы Са-ПА присутствуют во многих внутриклеточных компартментах (в эухроматине ядра, матриксе митохондрий, цистернах ГЭР и диктиосомах аппарата Гольджи) и в симбиосомах (Рис. 8). В последних они ясно выявлялись на поверхности ПБМ, обращенной в цитозоль растительной клетки, отчетливо были видны в ПБП симбиосом, часто примыкая к ПБМ, и в большом числе были локализованы в цитоплазме бактероидов. Таким образом, in situ симбиосомы в достаточной степени обогащены кальцием. Фактически те же особенности субклеточной локализации кальция, в том числе и на уровне симбиосом, наблюдались нами и после 2-часовой инкубации корней люпина желтого в забуференной воде в отсутствие добавленного кальция (Рис.9а).
Описанная выше картина распределения Са-комплексов с ПА в симбиосомах in situ заметно изменялась после 2- и 4-часовой инкубации корней растений в той же буферной среде, содержащей ЭГТА и ионофор А23187. Как следует из микрофотографий инфицированных клеток клубеньков, в этом случае наблюдались явные симптомы обеднения симбиосом кальцием. Они выражались в заметно меньшем числе, по сравнению с контролем (Рис. 9а), электронно-плотных гранул Са-ПА в бактероидах, в ПБП и на ПБМ симбиосом (Рис. 96). Наиболее сильный эффект имел место после 4-часовой инкубации корней в среде с Са-активными агентами, в результате которой бактероиды почти полностью лишались гранул продукта цитохимической реакции, только в единичном числе они наблюдалось в ПБП и в существенно меньшем числе присутствовали на ПБМ симбиосом (Рис. 9г). Следует отметить, что некоторое снижение числа гранул Са-ПА, по сравнению с контролем, в цитоплазме бактероидов и ПБП симбиосом наблюдалось и после 4-часовой инкубации корней в забуференной воде в отсутствие в ней выбранных С а активных соединений (Рис. 9в). Существенным представляется и то обстоятельство, что небольшое число гранул Са-ПА остается связанным с ПБМ симбиосом даже после 4-часовой обработки корневых клубеньков средой с Са-активными агентами.
Явные признаки обеднения симбиосом люпина желтого кальцием мы наблюдали и после совместного действия на них ЭГТА и ионофора А23187 в условиях in vitro . Можно видеть, что в результате такой обработки заметно снижалось, по сравнению с контролем (Рис. 10а), число электронно-плотных гранул Са-ПА как на наружной поверхности ПБМ и в ПБП симбиосом, так и внутри бактероидов (Рис. 106). Интересно, что добавление 5 мМ СаС12 к изолированным симбиосомам, преинкубированных в течение 30 мин в той же среде в отсутствие ЭГТА, но в присутствии ионофора А23187, приводило к появлению большого числа электронно-плотных гранул Са-ПА на наружной поверхности ПБМ, хотя внутри симбиосом, а именно в ПБП и бактероидах, заметного увеличения числа таких гранул не обнаруживалось (Рис. 10в).
В опытах с бобами выявлены аналогичные изменения в характере распределения Са2+ в инфицированных клетках клубеньков под действием ионофора А23187. Число гранул продукта реакции заметно снижалось на ПБМ, в бактероидах и в ПБП при двухчасовом действии ионофора и, особенно сильно, после четырёхчасового его действия .
Важно отметить в этой связи, что характер распределения визуально наблюдаемых катионных комплексов ПА к обработке растительных тканей Са-хелатором ЭГТА свидетельствует о том, что эти комплексы содержат ионы именно кальция и что выбранная нами методика позволяет избирательно визуализировать этот катион в тех областях клетки, где его локальная концентрация достаточно высока (Wick, 1982). Вместе с тем, экспериментальное подтверждение Са-аккумулирующей способности симбиосом было получено в опытах, выполненных на препаратах изолированных симбиосом и выделенных из них бактероидов.
Электронномикроскопическая визуализация аккумуляции Са в симбиосомах люпина желтого в присутствии АТФ и Mg
В результате симбиотического взаимодействия азотфиксирующей бактерии и бобового растения, вызывающего образование корневых клубеньков, в цитозоле инфицированных клеток наблюдается повышение концентрации ионов кальция и протонов (Cardenas et al., 1999,2000). В поддержании оптимального уровня Са2+ в цитозоле принимают участие различные транспортные системы.
Согласно современным представлениям в клетке действует несколько механизмов, обеспечивающих поддержание концентрации ионов кальция в цитозоле. Одни из них осуществляют удаление избытка Са из цитозоля (Са2+ - АТФазы и Са /Н4" - антипортеры), а другие способствуют повышению концентрации ионов кальция в цитозоле за счёт открывания кальциевых каналов. Основной вклад в снижение концентрации ионов кальция вносят закрывание кальциевых каналов в результате гидролиза ИФ3 специфическими фосфатазами и активация кальциевых насосов (Са -АТФаз), которые за счёт энергии гидролиза АТФ переносят ионы кальция в обратном направлении против градиента концентрации, восстанавливая исходные значения градиента Са2+ и, в связи с этим, способность клеток воспринимать новый элиситорный сигнал (Тарчевский, 2002, с.79).
В растениях найдены различные Са2+ - АТФазы, принадлежащие в том числе к автоингибирующемуся (АСА) типу (которые регулируются комплексом Са - кальмодулин). Са - АТФазы АСА-типа растений локализуются в ГЭР и плазматических мембранах, тогда как в животных клетках этот тип АТФаз локализован исключительно на плазматических мембранах. Активность Са - АТФаз АСА-типа ГЭР в Arabidopsis ингибируется Са2+- зависимой протеинкиназой (Hwang et al., 2000). Обнаружены зависимые и независимые от кальмодулина С а - АТФазы. Установлен элиситориндуцированныи синтез кальмодулин-стимулируемой кальциевой АТФазы плазмалеммы (Chung et al., 2000).
Растительные клетки содержат группу ионных помп, Са2+ - АТФаз Р-типа (Evans, Williams, 1998), ингибируемых ванадатом (Bush, 1995). Са2+-помпы найдены на плазмалемме, тонопласте (Андреев, 2001), ГЭР, пластидах и других мембранах. Показано, что Са - транспорт в изолированных лі мембранных везикулах осуществляется Са - АТФазами Р-типа, АТФ-зависимыми, ингибируемыми ванадатом, нечувствительными к протоно форам. Са2+- транспортная активность с такими характеристиками была найдена во всех мембранных препаратах из растений, полученных из клеток корней, листьев, культуры клеток, колеоптилей и алейроновых клеток (Bush, 1995). В добавление к вышеперечисленным характеристикам растительные Са - АТФазы имеют высокое сродство к Са , ингибируются низкими концентрациями эритрозина Б и имеют низкую специфичность к АТФ как субстрату для формирования фосфоэнзима и транспорта (Chen et al., 1993; Williams et al., 1990). Кинетический анализ АТФаз многих типов клеток показал, что кажущуюся Км для Са находится в области с 0,07мкМ до 12мкМ (Liss et al., 1991; PicKard et al., 1993; Bush, 1994).
Однако в литературе отсутствовали данные о наличии Са -помпы на ПБМ симбиосом азотфиксирующих клубеньков бобовых. В связи с этим перед нами стояла задача выяснить присутствует ли она на ПБМ.
В следующей серии экспериментов мы попытались доказать, что процесс аккумулирования Са2 симбиосомами АТФ-зависимый. В качестве контроля использовали симбиосомы, выделенные из корневых клубеньков люпина жёлтого, а затем зафиксированные в присутствии ПА. Часть выделенных симбиосом была энергизирована в течение 1,5 часов добавлением АТФ и Mg2+ в инкубационную среду, содержащую ионы кальция, а затем фиксирована, как описано в разделе "Объекты и методы". Для селективного определения действия Са2+-транслоцирующей АТФазы в ПБМ, мы использовали 20 мМ Mg , учитывая высокое сродство такого типа энзимов к Mg АТФ в клеточных мембранах (Evans and Williams, 1998).
Результаты, представленные нарис. 13 показали, что в препаратах симбиосом контрольного варианта немногочисленные гранулы продукта реакции Са-ПА локализованы на наружной стороне ПБМ, но не обнаружены в ПБП (рис. 13а). В противоположность этому, электронные микрофотографии симбиосом, инкубированных с АТФ и Mg показали многочисленные крупные гранулы Са-ПА на большей части поверхности ПБМ, а также в ПБП (рис. 136). Другое важное наблюдение - отсутствие этих гранул в присутствии ванадата, известного ингибитора АТФаз Р-типа (рис. 13в).
Учитывая вышеизложенное мы приходим к выводу, что полученные результаты находятся в соответствии с фактом, согласно которому симбиосомы аккумулируют Са при участии Са -транслоцирующей АТФазы.
Похожие диссертации на Транспорт Ca2+ через перибактероидную мембрану, его аккумуляция в симбиосомах и включение в контроль нитрогеназной активности в корневых клубеньках бобов и люпина желтого
