Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Анализ существующих методов биотестирования, особенности, преимущества и недостатки 10
1.2 Дафнии и другие ветвистоусые ракообразные в определении токсичности водной среды 17
1.3 Влияние условий экспонирования на чувствительность рачков к токсикантам 22
1.4. Механизмы влияния токсических веществ на дафний 30
1.5. Особенности питания ветвистоусых ракообразных 37
1.6. Трофическая активность дафний и способы ее регистрации 44
Глава 2. Объект и методы исследования 48
2.1. Объект исследования 48
2.2. Методика эксперимента по оценке выживаемости дафний 49
2.3. Методика эксперимента по оценке трофической активности дафний .51
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 53
3.1. Влияние условий вращения на жизнеспособность и чувствительность дафний к модельным токсикантам 53
3.2. Выживаемость дафний при различных условиях экспонирования в присутствии токсикантов 59
3.2.1. Влияние плотности посадки рачков на их чувствительность к токсикантам 59
3.2.2. Влияние присутствия кормовых организмов в воде на чувствительность дафний к токсикантам 61
3.2.3. Влияние состава культивационной воды на чувствительность дафний к токсикантам 63
3.3. Оценка эффективности различных способов регистрации трофической активности дафний 67
3.4. Трофическая активность дафний при различных условиях экспонирования в присутствии модельных токсикантов 72
3.4.1. Влияние плотности посадки рачков и количества добавляемого корма на их трофическую активность 72
3.4.2. Влияние возраста и энергетического статуса дафний на их трофическую активность и чувствительность к токсикантам 76
3.4.3. Влияние температуры окружающей среды на трофическую активность дафний и их чувствительность к токсикантам 79
3.4.4. Влияние времени внесения корма в тестируемую пробу на чувствительность дафний и к токсикантам 83
3.5. Сравнение показателей выживаемости и трофической активности дафний при исследовании действия тяжелых металлов и других проб воды 87
Заключение 92
Выводы 94
Список использованных источников 95
Приложения 117
- Дафнии и другие ветвистоусые ракообразные в определении токсичности водной среды
- Особенности питания ветвистоусых ракообразных
- Влияние состава культивационной воды на чувствительность дафний к токсикантам
- Влияние плотности посадки рачков и количества добавляемого корма на их трофическую активность
Введение к работе
Загрязнение водной среды является одной из наиболее актуальных экологических проблем. Для оценки степени техногенного воздействия на водные экосистемы наряду с методами химического анализа используют биотестирование как интегральный показатель токсического загрязнения среды (Зайцева и др., 1994; Моисеенко, 2005; Филенко, 2007).
Среди этих методов важное место занимает определение токсичности среды с использованием низших ракообразных. Эти методы широко применяются для целей экологического контроля, как в России, так и за рубежом (Брагинский, 2000; Жмур, 2001; ISO, 1996, 2001; US ЕРА, 2002). В качестве тест-реакции в анализе на острую токсичность используют смертность рачков, а при установлении хронического токсического действия проводят наблюдения за изменением плодовитости и качества потомства. Несмотря на то, что хронический метод способен дать более глубокую оценку токсичности, острые опыты в значительной степени» способствуют сокращению объема работ, позволяя в существенно более короткие сроки получать информацию о качестве вод.
Использование быстрых ответов гидробионтов .на загрязнение может значительно снизить трудозатраты и время на проведение экологического контроля воды. Кроме того, длительные экспозиции приводят к изменению исходных физико-химических свойств и состава исследуемых проб, вследствие чего оценка качества среды может быть не всегда корректной (Лесников, 1983; Брагинский, 1989; Сазонова и др., 1997; Vosyliene, 2007). Данное обстоятельство особенно значимо при работе со сточными водами. Важное значение оперативность тест-реакции приобретает в различного рода чрезвычайных ситуациях, сопровождающихся загрязнением окружающей среды. В связи с этим остается актуальным поиск более оперативных методов токсикологического анализа.
Решение этой проблемы возможно как за счет сокращения длительности выполнения широко используемого метода биотестирования на рачках по показателю выживаемости, так и применение более быстрых тест-функций, основанных на поведенческих и физиологических реакциях ракообразных. Их использование позволяет во многих случаях определить сублетальные (не вызывающие гибели) концентрации загрязняющих веществ (Брагинский, 2000). Одной из этих реакций является трофическая активность дафний, то есть величина поглощенного дафниями корма за определенный промежуток времени. Вместе с тем, не совсем ясно, насколько адекватным будет изменение величины данного показателя уровню токсичности анализируемых вод и выживаемости самих рачков.
Существует также возможность изменения чувствительности дафний в результате варьирования условий выполнения анализа (Брагинский, 1987; Adema, 1978; Stuhlbacher at al., 1993; Kim at all, 2001). Для показателя выживаемости это время экспонирования, режим кормления, плотность посадки и физико-химические свойства культивационной воды. Для трофической активности важно знать условия экспонирования рачков, а так же определить метод оценки скорости потребления корма (микроводоросли).
Целью работы явился анализ действия токсичных веществ и загрязненных водных сред на выживаемость и трофическую активность Daphnia magna Straus в зависимости от условий проведения эксперимента.
Задачи:
Изучить влияние условий экспонирования (вращение проб с тест-культурой рачков, плотность посадки, наличие корма, качество культивационной воды, продолжительность и другое) на выживаемость и трофическую активность дафний в присутствии токсикантов.
Оценить информативность показателей быстрой и замедленной флуоресценции культуры водоросли, используемой в качестве корма, при определении трофической активности дафний в токсикологическом эксперименте.
3. Сравнить чувствительность рачков по показателям трофической активности и выживаемости при биотестировании растворов модельных токсикантов, природных и сточных вод.
Научная новизна. Впервые показано, что вращение тестируемых проб воды поддерживает в них содержание кислорода на оптимальном для жизнедеятельности рачков уровне. Определены условия экспонирования рачков, обеспечивающие увеличение чувствительности и оперативности тест-реакций. Трофическую активность дафний в присутствии токсикантов, измеряемую по количеству потребленных клеток водоросли, можно более точно установить методом регистрации интенсивности нулевого уровня быстрой флуоресценции хлорофилла. Предварительное экспонирование дафний в тестируемой среде без добавления пищи усиливает воздействие токсикантов на трофическую активность рачков.
Защищаемые положения:
1. Умеренное вращение тестируемых- проб со скоростью 6-8 оборотов в минуту не создает для рачков дафний стрессовых условий и способствует повышению их чувствительности к токсикантам, что существенно сокращает продолжительность проведения токсикологического эксперимента.
2. Токсическое действие на дафний уменьшается в результате: связывания загрязняющих веществ с компонентами культивационной воды, адсорбции кормовыми объектами (клетками водоросли), а также при увеличении количества рачков в объеме тестируемой пробы.
3. Трофическая активность дафний адекватно и оперативно отражает воздействие на них токсичных веществ.
Практическое значение. На основе полученных данных разработана, аттестована, допущена для целей государственного экологического контроля и используется в более 100 организациях в РФ оперативная методика определения токсичности вод и водных вытяжек по смертности дафний (ПНД Ф 14.1:2:4.12-06 16.1:2.3.3.9-06; ФР.1.31.2009.06641). Кроме того, разработана и готовится к аттестации методика определения токсичности вод и водных вытяжек на основе изменения трофической активности дафний.
Апробация. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях различного уровня: X Всероссийской студенческой научной конференции «Экология и проблемы защиты окружающей среды» (КрасГУ, 2003); Международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология южной Сибири и сопредельных территорий» (ХГУ, 2004, 2005, 2007); Межрегиональной научно-практической конференции «Объединение субъектов РФ и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири» (Красноярск, 2005); Международной конференции памяти д.б.н., проф. Б.А.Флерова «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005, 2008); Всероссийской конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2006); Первой открытой научно-практической конференции молодых работников ФГУП "ГХК" (Железногорск, 2006); Международной конференции «Биоиндикация в экологическом мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006); Российской школе-конференции. молодых ученых «Экотоксикология: Современные биоаналитические системы, методы и технологии (ИБФМ РАН - Пущино, 2006); Второй научной конференции с участием стран СНГ "Современные проблемы физиологии биохимии водных организмов" (Петрозаводск, 2007); XII международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2007, 2010); XLVI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Глобальные проблемы и принципы устойчивого развития (Новосибирск, 2008); Региональной научно-практической конференции «Региональные проблемы природопользования и охраны окружающей среды» (Куртамыш, 2008); Научно-практической конференции с международным участием «Современные фундаментальные проблемы гидрохимии и мониторинга качества поверхностных вод России» (Азов, 2009, Ростов-на-Дону, 2009); Международной научной конференции и международной школе для молодых ученых «Проблемы экологии: чтения памяти профессора М.М. Кожова» (Иркутск, 2010).
Результаты работы были представлены на выставках НТТМ-2006 (г. Москва, 2006); 1-й и 2-й Городских ассамблеях (г. Красноярск, 2008; 2009); молодежном форуме (г. Красноярск, 2008); молодежном форуме «Селигер-2009».
Исследования по теме диссертации проведены при поддержке Сибирского федерального университета (грант на выполнение молодежного инновационного проекта «Разработка оперативного метода и аппаратуры для биотестирования токсичности вод на низших ракобразных» (2007 г.); грант на выполнение молодежного научно-исследовательского проекта «Исследование модификации токсических свойств тяжелых металлов в природных и сточных водах» (2007 г.); грант на выполнение коммерческого проекта «Разработка и внедрение оперативных технологий биологического контроля качества окружающей среды в систему государственного и ведомственного экологического мониторинга» (2007 г.); грант на выполнение молодежного проекта «Разработка оперативных методик определения токсичности воды флуоресцентными методами» (2008 г.); грант на выполнение инновационного проекта «Создание комплекса оперативных технологий биомониторинга окружающей среды» (2008 г.)) и Красноярского краевого фонда науки (индивидуальный грант для молодых ученых 17G (2007 г.); грант для участников международных конференций и стажировок среди студентов, аспирантов и молодых учёных - 2010 (КФ-129)).
Публикации. По теме исследований опубликовано 33 работы, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, получен 1 патент РФ.
Структура работы. Диссертация изложена на 122 страницах, содержит 6 таблиц, 22 рисунка, 5 приложений, состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. Список литературы включает 169 наименований, в том числе 87 на иностранном языке.
Личный вклад автора. Представленная работа является обобщением научных исследований, проведенных автором лично. Автор принимала активное участие при проведении исследований, систематизации, обработке, анализе и интерпретации полученных результатов.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю кандидату биологических наук, профессору Ю.С. Григорьеву за ценные советы и помощь в проведении работы; сотрудникам кафедры экологии и природопользования за ценные консультации при выполнении и оформлении результатов работы.
Дафнии и другие ветвистоусые ракообразные в определении токсичности водной среды
Беспозвоночные удобны в биотестировании, т.к. они быстро адаптируются к лабораторным условиям и чувствительны к токсическим веществам. В последние годы на этих животных исследуют физиологические, морфологические и генетические последствия хронического воздействия токсикантов (Моисеенко, 2005).
Наиболее широко используемой в экотоксикологии группой беспозвоночных являются низшие ракообразные (Бубнов и др, 2007). Популярность использования этих организмов в качестве тест-обектов обусловлена, главным образом, простотой их культивирования и незначительными размерами, которые позволяют работать с относительно небольшими по объему пробами воды (Зайцева и др., 1994). Дафнии способны давать целый комплекс тест-реакций, имеют короткий жизненный цикл и высокую плодовитость в оптимальных условиях культивирования (Мисейко и др., 2001; Sarma, Nandini, 2006). Это позволяет прослеживать последствия токсического действия на протяжении ряда поколений. Партеногенетическое размножение ветвистоусых рачков дает возможность использовать в токсикологических экспериментах однородную культуру, где все особи обладают сходными параметрами и синхронно реагируют на загрязнители (Baird, 1989; Sarma, Nandini, 2006).
Из недостатков использования дафний следует отметить, что в случае наличия маслянистых веществ на поверхности пробы воды, рачки попросту прилипают к поверхностной пленке и постепенно погибают. Действие пленки может также маскировать влияние других форм загрязнения (Лесников, 1983).
Впервые D. magna как индикатор токсичности воды была предложена в 1929 г. (Брагинский, 2000). В СССР начало подобных исследований связано с работами Н.С.Строганова (1971) и его школы, Е.А.Веселова (1988) и Л.А.Лесникова (1983). Позже последователями американской школы биотестирования была предложена Ceriodaphnia dubia. Этот вид, наряду с D. magna и D. pulex, был введен в руководства по биотестированию во многих странах мира (Дятлова, 2001; Leeuwangh, 1978).
На современном этапе наиболее применяемыми тест-объектами в экотоксикологических исследованиях в России являются Daphnia magna и Ceriodaphnia afflnis (Арсан, 2007). В Северной Америке работают преимущественно с видом Ceriodaphnia dubia (Harmon et al, 2003). В европейской литературе показано использование в основном Daphnia magna и значительно реже, прежде всего для оценки вод в определенных климатических условиях (например, тропические регионы), предлагается использовать дафний других видов и таких родов как Moina, Simocephalus и Daphnosoma и др. (Sarma, Nandini, 2006; Wu, 2006). Не смотря на то, что из всех ветвистоусых рачков D.magna проявляет наименьшую чувствительность к модельным токсикантам (Дятлова, 2001), этот вид в биотестировании используется наиболее часто.
Биотестирование на дафниях рекомендовано для контроля качества вод различного происхождения (Рекомендации, 1994), а также вытяжек из отходов и почв (Маячкина, Чугунова, 2009; Терехова, 2009).
Различают острые и хронические тесты с использованием этих организмов. Первые рассчитаны на получение экспресс-информации о токсичности исследуемого вещества, вторые - на выявление долговременного эффекта действия токсикатов, в частности малых и ультра малых концентраций (Брагинский и др., 1987). В хронических экспериментах с дафниями помимо их выживаемости оценивают изменение плодовитости и качества получаемого потомства (количество, размеры, мутации и др.) (Исакова, 1980). Ввиду длительности анализов (от 7 до 21 суток) по определению хронического токсического действия они менее популярны, чем острые опыты. Некоторые авторы предлагают заменять длительные опыты по оценке плодовитости рачков оценкой роста неполовозрелых дафний в течение 2-3 дней, основываясь на том, что количество потомства созревшей дафнии зависит от интенсивности ее роста на ювенильной стадии, наиболее чувствительной к воздействию токсикантов (Hanazato, 1998; Barata et al, 1999). Впоследствии методы для обнаружения подострого токсического действия предлагались и другими авторами (Knops et al, 2001; Lazorchak et al, 2008).
Несмотря на более высокую чувствительность тестов на хроническое токсическое действие (Adema, 1978), результаты острого токсикологического тестирования имеют не меньшее значение, так как дают возможность за более короткие сроки получить информацию о возможной угрозе загрязнения. Острый токсический эффект у дафний может проявляться комплексом визуально наблюдаемых симптомов: смертность или иммобилизация,/ рефлекторно-поведенческие реакции (вращение вокруг своей оси, замедление взмахов антенн, замедление частоты сердечного ритма, выброс яиц и развивающихся эмбрионов), изменение пигментации, угнетение питания и других (Лесников, 1983; Брагинский, 2000). На основе некоторых поведенческих реакций- были предложены методические приемы обнаружения токсичности (Rosa et al, 2008). В качестве дополнительных показателей в остром опыте можно учитывать изменение окраски тела, кишечника, жирового тела, гонад, степень наполнения кишечника пищей, а также изменение на молекулярно-генетическом уровне (Park, Choi, 2007). Изменения перечисленных показателей нередко предшествует гибели животных, что позволяет использовать их для ранней диагностики (Исакова, Колосова, 1989).
Особенности питания ветвистоусых ракообразных
Исследование способа питания дафний важно для понимания механизма воздействия токсикантов на эту тест-функцию.
Большинство ветвистоусых питается, отфильтровывая мелкую, находящуюся в воде взвесь. Основной пищей служат бактерии и мелкие органические остатки — детрит, а также растворенное органическое вещество (Кокова, 1982). Наибольше значение имеют бактерии. (Мануйлова, 1964, Крючкова, 1989). Помимо бактерий, фильтрующие ветвистоусые используют в пищу одноклеточные водоросли. Они могут заглатывать только самые мелкие виды протококковых и зеленых водорослей (Scholten et al, 2005).
Фильтрация пищи рачками происходит непрерывно. Процесс питания дафний непосредственно связан с движением грудных ножек, направляющих ток воды внутрь раковины, где происходит отфильтровывание твёрдых частиц, скапливающихся в брюшном желобке и направляющихся затем в ротовое отверстие. В кишечник пища поступает по мере удаления отбросов (дефекации) (Смирнов, 1973; Scholten et al, 2005,). Даже после наполнения кишечника рачки продолжают фильтровать, и отфильтрованные частицы двигаются вперед по их брюшному желобку, но в рот они не попадают: ротовые придатки и задний отдел тела выталкивают их снова в воду. Рачки начинают заглатывать пищу только после того, как кишечник хотя, бы частично освободится от ее остатков (Гиляров, 1980).
В этом случае может наблюдаться скопление пищи в желобе, которое свидетельствует о неблагополучии в питании дафний. Обычно это происходит когда во взвеси много слизистых частиц. Чрезмерно высокое содержание кормовых частиц и старых клеток водорослей снижает активность питания дафний, и они могут погибнуть вследствие засорения пищевого аппарата (Кокова, 1982; Исакова, Колосова, 1989).
Фильтрационный аппарат дафний представляет собой туловищные конечности, которые утратили функцию органов движения, а приобрели функцию собирания мелких пищевых частиц. Все действия фильтрационного аппарата осуществляются многочисленными, различными по строению, щетинками (Гиляров, 1980). У дафний и некоторых других Cladocera фильтрующие щетинки имеются только на третьей и четвёртой парах конечностей. Минимальные размеры пищевых частиц определяются густотой расположения щетинок на фильтрующих придатках рачков. На фильтре удерживаются лишь те частицы, которые больше минимального расстояния между щетинками. При отборе дафниями частиц также имеет значение ширина разделяющей створки брюшной щели, в которую устремляется входящий ток воды. Очень узкая входная щель дафний ограничивает доступ крупных частиц. Всё устройство и действие фильтрационного аппарата рачков исключает возможность активного отбора частиц в соответствии с их пищевой ценностью (Гутельмахер, 1970; Кокова, 1982; Крючкова, 1989). Фильтрационный аппарат ракообразных обладает высокой улавливающей способностью. При низкой концентрации взвеси практически все частицы, попадающие в фильтрационную камеру, направляются в рот. Нижний предел размера потребляемых частиц определяется расстоянием между фильтрующими пластинками (1-2 мкм), а верхний зависит от размера тела (Смирнов, 1973).
В то же время в некоторых литературных источниках (Иванова, 1970; Крючкова, 1989) отмечается, что фильтраторы различают частицы на основании их размера и очертаний. Очевидно, что механизм избирания при истинной фильтрации состоит не в активном избегании или отфильтровывании тех или иных частиц, т.е. не носит характер активного выбора, а определяется улавливающими способностями их фильтрационного аппарата (Сущеня, 1975; Монаков, 1998; Kmet et al, 2004).
По исследованиям Гаевской (1949) - избирательное, а не пассивное отношение к пищевым качествам фильтрационного материала в той или иной степени присуще всем фильтраторам. Животное может фильтровать или не фильтровать, если несъедобная взвесь угнетает его жизнедеятельность или если у него выработаны, адаптации в форме соответствующего изменения поведения. Прекращение фильтрации или изменение её скорости уже содержат черты избирательности (Сущеня, 1975).
Кроме того, были отмечены предпочтения Daphnia magna при питании водорослево-бактериальной смесью: присутствие в пищевой смеси клеток E.coli способствовало значительному снижению потребления клеток хлореллы, в то время как на поглощение данных бактерий присутствие водоросли оказывало несущественное влияние (Hadas et al, 1982). Также избирательная фильтрационная активность отмечалась у цериодафний по отношению к разным пищевым организмам сходного размера (Gladyshev et al, 2000).
Каким бы ни был механизм отбора пищевых частиц дафниями, во многом интенсивность их питания зависит от условий среды (Гутельмахер, Алимов, 1970). Для количественной оценки питания дафний применяется такая1 характеристика как скорость, с которой животные потребляют пищу (рацион). На величину рациона влияет ряд факторов, в частности, количество и качество пищи, ее доступность, температура окружающей среды, активность, физиологическое состояние и возраст животных и т.д.
Известно, что с увеличением концентрации пищи до определенного предела, называемого точкой «трофического насыщения», рацион животных-фильтраторов тоже растет и зависит как от массы тела, так и от концентрации пищи (Иванова, 1970; Крючкова, Рыбак, 1983; Kersting, 1978; Kim, 2003).
При низких концентрациях пищевых частиц, для которых характерна предельно высокая активность работы фильтрационного аппарата животных, пищевой рацион в наибольшей степени зависит от концентрации пищи в среде (Сущеня, 1975). В дальнейшем возрастающие концентрации пищевой взвеси вызывают снижение скорости фильтрации, в результате чего потребление пищи происходит несколько медленнее, чем увеличение ее концентрации в среде. Затем рацион ракообразных, не смотря на продолжающееся повышение концентрации, остается, примерно, на одном уровне. В этом случае скорость фильтрации находится в обратной зависимости от концентрации пищевых частиц (Иванова, 1970; Монаков, 1998; Сущеня, 1975). Избыток доступной пищи, свыше 3 млн кл/мл, приводит к снижению ее усвояемости и . засорению фильтрационного аппарата. Концентрация водорослей 0,7 - 1 млн. кл/мл является оптимальной дляразвития дафний. При концентрации водорослей ниже 5 тыс кл/мл рачки не в состоянии обеспечить свои пищевые потребности (Исакова, Колосова, 1989).
Влияние состава культивационной воды на чувствительность дафний к токсикантам
Известно, что чувствительность дафний к токсическим веществам зависит от состава культивационной (разбавляющей) воды (Голованова, 2008; Barata, 1998; Adema, 1978). В качестве таковой в России обычно рекомендуется использовать отстоянную водопроводную воду (Жмур, 2007; Строганов, 1971). Вместе с тем ее химический состав значительно варьирует в разных городах и даже в пределах одного города. В результате этого чувствительность биотеста может оказаться не одинаковой при использовании водопроводной воды, полученной из разных мест водозабора.
С целью проверки данного предположения нами были проведены токсикологические эксперименты на водопроводной воде, взятой из разных районов города Красноярска (рис. 5). Для оценки различий ее качественного состава в каждую пробу был добавлен бихромат калия в концентрации 1 мг/л.
Результаты экспериментов подтвердили, что действие этого токсиканта в водах из разных районов города существенно различается. Наименьший эффект бихромат калия оказывал в водопроводной воде из Кировского и Советского районов, снабжаемых из инфильтрационных водозаборов, а наибольший - в воде из поверхностного водозабора на р. Енисей (главный корпус СФУ).
Такие различия можно объяснить тем, что природные воды, поступающие на водозабор, содержат многие вещества, способные образовывать комплексы с тяжелыми металлами, в составе которых они становятся недоступными для тест-организмов (Kim et al, 2001; Моисеенко, 2006; Jeon et al, 2010). Кроме того, в воде, обладающей высокой степенью жесткости возникает конкурентное взаимодействие ионов тяжелых металлов с ионами КҐ, Са2+ и Mg2+ за места связывания на органических веществах или на теле тест-организма (Munger et al, 1999; Kim et al, 2001; Heijerick, 2003).
Проблема связывания токсикантов в зарубежных методиках решается путем использования искусственной солевой среды для выращивания и проведения биотестирования на рачках (Baer et al, 1999; ISO, 1996; US ЕРА, 2002). Однако применение такой среды требует дополнительных затрат на ее приготовление и длительной адаптации к ней культуры рачков.
Для корректировки состава культивационной (разбавляющей) воды нами был предложен более простой способ. С целью уменьшения связующей способности водопроводная вода разбавлялась дистиллированной водой до уровня, при котором сохранялась 100%-ная выживаемость дафний в контрольном варианте, а чувствительность к модельному токсиканту соответствовала установленной норме. Этот прием был опробован нами на водопроводной воде из артезианской скважины (показатель электропроводности - 400 uS/см). Как и ожидалось, в исходной пробе воды бихромат калия в концентрациях 0,5 и 1 мг/л не оказывал какого-либо токсического эффекта на рачков дафний (рис. 6). При разбавлении этой воды дистиллированной действие модельного токсиканта значительно усиливалось, что позволило достигнуть требуемого уровня чувствительности биотеста. При этом во всех контрольных вариантах данного опыта выживаемость дафний оставалась на уровне 100%. Отсюда следует, что после разбавления водопроводной воды с повышенным уровнем минерализации и как следствие высокой связующей способностью, она становиться пригодной для использования в качестве культивационной воды.
Таким образом, проведенные исследования показали, что повышения чувствительности дафний к токсикантам можно достичь за счет уменьшения плотности их посадки в тестируемом растворе, снижения степени минерализации культивационной воды, а так же, не внося корм рачкам при проведении острого токсикологического эксперимента. Последнее стало возможным в результате сокращения длительности выполнения самого эксперимента в устройствах УЭР-03.
На основе сделанных заключений была разработана и аттестована новая более оперативная методика биотестирования токсичности различных вод по показателю смертности дафний, рекомендованная для целей государственного экологического контроля.
Влияние плотности посадки рачков и количества добавляемого корма на их трофическую активность
Согласно данному выражению высокие значения трофической активности можно достигнуть разными способами. Например, увеличивая количество дафний, приходящееся на единицу объема можно сократить. время, необходимое для поглощения предложенного им корма до нескольких часов. Однако, если использовать этот прием при постановке токсикологического эксперимента, то чувствительность биотеста может упасть, поскольку в этих условиях на каждую особь будет приходиться меньшее количество токсичных веществ, как это было показано в экспериментах описанных в главе 3.2. Кроме того, степень воздействия токсикантов на рачков будет еще более снижена в результате сокращения времени их контакта с поллютантами (Yu and Wang, 2002). Поэтому уменьшение длительности эксперимента с целью получения более быстрого ответа оправдано только до определенных пределов. Наиболее оптимальным представляется вариант проведения теста на токсичность при использовании относительно небольшого числа рачков, достаточного для получения статистически достоверного результата и невысоком содержании корма в среде, поскольку количество добавляемого корма будет определять долю его изъятия дафниями за время эксперимента.
В связи с этим были исследованы различные варианты плотности посадки рачков и количества добавляемого корма. Результаты показали (таблица 5), что количество съедаемого корма возрастало пропорционально увеличению числа рачков в единице объема. Причем эта закономерность наиболее четко прослеживалась при помещении рачков в воду, где концентрация водорослевого корма соответствовала более низкой оптической плотности 0,02 D суспензии. Это может быть связано с тем, что при малом количестве клеток в среде и больших плотностях посадки дафний возникает дефицит корма. И, наоборот, при меньшей плотности посадки (5 дафний во флаконе) и высоком содержании корма (D=0,04) доля его потребления была очень низкой. При этом в условиях избытка корма нельзя исключить возможность снижения скорости- питания рачков в результате переполнения у них желудочно-кишечного тракта и засорения фильтрующего аппарата (Гутельмахер, Алимов, 1979).
На основании анализа полученных данных и с учетом обстоятельств, описанных выше, для оценки токсического действия на трофическую активность дафний представляется наиболее оправданным использовать вариант с плотностью посадки 10 рачков на каждую пробу воды объемом 50 мл и исходным содержанием корма в среде, эквивалентным оптической плотности 0,02. Дополнительные аргументы в пользу обоснованности этих рекомендаций были получены в опытах с бихроматом калия (рис. 9). Оказалось, что наибольшее воздействие на трофическую активность дафний данный токсикант проявляет при невысоком содержании корма, близком D=0,02.
Таким образом, при использовании в эксперименте 10 рачков на 50 мл воды и добавлении корма (водоросли хлореллы) в количестве, эквивалентном оптической плотности 0,02, время, необходимое рачкам для поглощения из среды большей части водоросли, находится в диапазоне 18 ± 2 часов. Указанная длительность эксперимента обеспечивает не только достаточный период воздействия токсиканта на тест-организм, но и позволяет минимизировать возможное влияния ритмов питания дафний на результаты определения скорости потребления корма. Поскольку большая часть этого времени приходится на ночные часы, то это также позволяет максимально снизить прирост численности клеток водоросли в период проведения токсикологического эксперимента.
При исследовании действия токсикантов на функциональные показатели рачков дафний необходимо учитывать тот факт, что их чувствительность может варьировать в зависимости от возраста и размера рачков. Так, молодые дафнии вследствие более эффективной фильтрации аккумулируют на единицу веса больше тяжелых металлов по сравнению с более крупными и зрелыми особями (Брагинский, 2000; Stuhlbacher et al., 1993; Yu and Wang, 2002).
Вместе с тем, возраст тест-организмов влияет и на величину измеряемой трофической активности, поскольку количество потребляемой животными пищи напрямую зависит от его размеров: более взрослые и крупные особи зато же время съедают больше пищи (Лузгин, 1990; Hanazato, 1998).
В связи с этим представляло интерес определить возраст дафний, при котором рачки проявляют высокие уровни трофической активности и достаточную чувствительность к загрязнителям.
Результаты экспериментов, проведенных с рачками различного возраста и представленные на рисунке 10, показывают, что с возрастом особи съедают больше внесенного корма. Однако при этом степень воздействия модельного токсиканта на трофическую активность дафний существенно снижается. Если у рачков возрастом 1 сутки и менее снижение трофической активности на 20% наблюдалось при концентрации бихромата калия 0,5 мг/л, то у двухсуточных особей такое снижение тест-функции отмечалось только при концентрации 1 мг/л токсиканта. Трехсуточные дафнии сохраняли высокую скорость потребления корма при всех концентрациях вносимого токсиканта. Следует также указать, что у суточных рачков даже в контрольном варианте регистрировались невысокие значения трофической активности. Низкие показатели потребленного корма уменьшают диапазон реагирования тест-функции и тем самым снижают достоверность получаемых результатов. Таким образом, наиболее подходящей для использования в токсикологическом эксперименте можно считать возрастную группу дафний более 1, но менее 2-х суток. Существенное влияние на величину трофической активности рачков может оказать их энергетический статус (сытость рачков), которым они обладают на момент проведения биотеста (Гиляров, 1980). Можно предположить, что рачки, испытавшие временное отсутствие пищи, будут более интенсивно потреблять корм и, при этом быть более уязвимыми к воздействию токсиканта. Это предположение было подтверждено в экспериментах с бихроматом калия (рис. 11).
![Методическое обеспечение экоаналитического контроля технологических сред в зонах предприятий по утилизации О-изобутил-S-[(2-диэтиламино)этил] метилтиофосфоната (RVX)](/i/i/4708/572659.png "Методическое обеспечение экоаналитического контроля технологических сред в зонах предприятий по утилизации О-изобутил-S-[(2-диэтиламино)этил] метилтиофосфоната (RVX) Густылева Людмила Константиновна")
