Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 ОБЕСПЕЧЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ НА ОСНОВЕ ОЦЕНКИ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ (Литературный обзор) 9
1.1 Индивидуальные генетически детерминированные процессы биотрансформации экологических токсикантов 9
1.2 Генетические аспекты экологической безопасности 29
1.3 Аналитические методы экологического мониторинга полиморфизма процессов биотрансформации ксенобиотиков 40
Глава 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
2.1 Постановка задач исследования 48
2.2 Аппаратура, объекты и техника эксперимента 51
Глава 3 МЕТОДЫ МОНИТОРИНГА ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННЫХ ПРОЦЕССОВ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА
ЗЛ Получение производных тест-маркеров ацетилирования при их спектрофотометрическом детектировании 58
3.2 Разработка методов определения фенотипа ацетилирования при выведении тест-препаратов с мочой 62
3.3 Разработка методов определения фенотипа ацетилирования на основе оценки содержания тест-препаратов в слюне 70
Глава 4 ЭКСТР АКЦИОННО-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРАЗИНА И ЕГО ЗАМЕЩЕННЫХ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
4. 1 Экстракционное концентрирование гидразина из биологических жидкостей 83
4.2 Экстракционное концентрирование диметилгидразина из биологических жидкостей
Глава 5 ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПУТЕМ МОНИТОРИНГА ПРОЦЕССОВ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ 100
5.1 Изучение токсикокинетики гидразина при метаболизме замещенных гидразина в организме человека 102
5.2 Влияние фенотипа ацетилирования на токсикокинетику гидразина и его замещенных 103
5.3 Оценка риска при воздействии гидразидов кислот и гидразонов на организм человека 111
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 117
ВЫВОДЫ 118
ЛИТЕРАТУРА 119
ПРИЛОЖЕНИЯ 145
- Индивидуальные генетически детерминированные процессы биотрансформации экологических токсикантов
- Аппаратура, объекты и техника эксперимента
- Разработка методов определения фенотипа ацетилирования на основе оценки содержания тест-препаратов в слюне
Введение к работе
Актуальность темы. Генетическая предрасположенность является главной и малоизученной причиной индивидуальной чувствительности организма человека при воздействии токсичных химических веществ. При этом в решении комплекса проблем экологии человека важное место занимают методы для мониторинга генетически детерминированных процессов биотрансформации ксенобиотиков в организме человека*. Это связано с тем, что значительные различия в экотоксическом действии химических веществ обусловливают полиморфизмы процессов их метаболизма. В экологическом аспекте определение биохимических фенотипов метаболизма токсикантов у производственного персонала и населения необходимо для оценки риска интоксикации, канцерогенеза, индивидуальной химической чувствительности, профессиональной пригодности, а также выявлении групп повышенного риска и предупреждения на этой основе проявления неблагоприятных экологических факторов. Влияние экологические факторов также приводят к увеличению наследуемых патологий и лежат в основе многочисленных заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ.
Широкое применение ароматических аминов, гидразина и его замещенных в народном хозяйстве способствует как хронической, так и острой производственной интоксикации человека этими веществами. Процессы метаболизма аминосоединений в организме протекают путем ацетилирования аминогрупп токсикантов, причем активность фермента N-ацетилтрансферазы, контролирующего процессы их биотрансформации, генетически детерминирована у разных людей.
* Соруководителем диссертационной работы по вопросам мониторинга генетически детерминированных процессов биотрансформации ксенобиотиков являлся доктор химических наук, доцент Сергей Юрьевич Гармонов
В связи с этим особую значимость в обеспечении экологической безопасности приобретает мониторинг индивидуальных процессов биотрансформации этих токсикантов как меры предрасположенности в развитии экопатологических реакций организма.
Цель работы состояла в разработке комплекса спектрофото-метрических и экстракционно-спектрофотометрических методов мониторинга тест-маркеров генетически детерминированных процессов ацетилиро-вания аминосоединений в биологических жидкостях, а также установлении закономерностей токсикокинетики, метаболизма гидразина и его замещенных для обеспечения экологической безопасности при их воздействии.
Научная новизна:
обоснован выбор и условия использования гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в качестве тест-препаратов ацетилирования аминосодержащих соединений;
научно обоснованы и установлены условия определения типа ацетилирования путем изучения фармакокинетики гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в слюне и моче при использовании спектрофотометрического детектирования их динитро-бенз-2,1,3-оксадиазольных производных;
разработаны методы оценки скорости генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосоединений, обосновано их использование для обеспечения безопасности и оценки риска при воздействии токсикантов;
впервые установлены условия чувствительного и избирательного экстрак-ционно-спектрофотометрического определения гидразина и 1,1-диметилгидразина в биологических жидкостях человека;
установлена токсикокинетика гидразина в моче и слюне производственного перасонала при биотрансформации гидразидов кислот и гидразонов, протекающая в результате действия фермента
печени N-ацетилтрансферазы. Выявлено влияние активности этого
фермента на токсикокинетику.
Практическая значимость работы. Результаты работы использованы для обеспечения экологической безопасности производственного персонала (ОАО «Казаньоргсинтез», ОАО «Татэнерго», Министерство обороны) и внедрены в клиническую практику (Межрегиональный клинико-диагностический центр, Гастроэнтерологичский центр, Казань).
Экспериментальные результаты и выводы на их основе использованы в учебном процессе КГТУ в дисциплинах «Экологический мониторинг» и «Контроль экологической безопасности».
Разработанный в диссертационной работе комплекс методик и полученные данные о скоростях ацетилирования токсичных аминосоединений в организме человека в зависимости от его фенотипа могут быть использованы для оценки токсичного и канцерогенного риска, обеспечения экологической безопасности производственного персонала химических производств, для дозировки лекарственных веществ и оптимизации их эффективного клинического использования.
На защиту выносятся:
результаты исследования и подбор оптимальных условий спектрофото-метрического определения тест-маркеров ацетилирования в виде их динитробензоксидиазольных производных;
методики установления фенотипа ацетилирования путем оценки фармакокинетических параметров гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в моче и слюне человека, а также результаты их применения в клинических и производственных условиях;
результаты изучения условий экстракционного концентрирования гидразина и 1,1-диметилгидразина в биологических жидкостях в виде 5,7-динитробензофуразановых производных с последующим спектро-фотометрическим определением;
результаты изучения токсикокинетики гидразина в моче и слюне при биотрансформации гидразидов кислот и гидразонов в организме человека;
данные по оценке экологической безопасности населения путем мониторинга фенотипической активности генетически детерминированных процессов ацетилирования в организме человека. Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XII
Международной конференции по химии и химической технологии (Москва, 1998); Научной конференции КГТУ «Пищевые технологии» (Казань, 1998); II и III конференциях молодых ученых "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2002, 2003); XIV и XVI Всероссийской межвузовской научно-технической конференции «Внутрикамерные процессы в энергетических установках, акустика, диагностика, экология» (Казань 2002, 2004); III Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2004); II Всероссийской научно-практической конференции «Социальные, медико-биологические и гигиенические аспекты здоровья человека» (Пенза, 2004).
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 статей и 7 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора; экспериментальной части и четырех глав, в которых описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения; библиографического списка. В приложении представлены акты использования результатов диссертационной работы.
Диссертация изложена на 144 страницах, содержит 27 рисунков, 28 таблиц, 8 схем, библиографический список включает 206 наименований.
Индивидуальные генетически детерминированные процессы биотрансформации экологических токсикантов
Большинство ксенобиотиков подвергаются в организме либо частичному, либо почти полному химическому превращению. Только отдельные соединения выделяются в неизменном виде. Установлено, что чем выше водорастворимость соединения, тем лучше оно ионизируется при физиологических значениях рН, тем в меньшей степени оно способно конструктивно изменяться в организме. Выявлена высокая корреляция между коэффициентом распределения вещества в двухфазной среде: неполярный растворитель (гептан, хлороформ) - вода и степенью биотрансформации [12].
В неизменном виде с мочой, желчью и другими биологическими жидкостями из организма выделяются лишь относительно хорошо водорастворимые вещества. Поскольку большинство ксенобиотиков, являясь липо-фильными, биотрансформируются, логично предположить, что эти два качества весьма тесно связаны, тем более, если учитывать общую тенденцию к повышению гидрофильности в процессе превращений. Однако из этого правила встречаются исключения, и корреляция между скоростью метаболизма некоторых групп соединений и их липидорастворимостью не наблюдается [13] .
Общепризнанно, что печень является основным местом метаболизма ксенобиотиков и что ферменты, катализирующие его, располагаются главным образом в эндоплазматическом ретикулуме [14-17].
У человека существует генетический контроль метаболизма поступающих в организм химических соединений. Так, метаболизм ксенобиотиков, следовательно, процесс детоксикации в организме происходит в результате реакций функционализации (реакции фазы I) и сопряжения (реакции фазы II) [2, 18]. Сначала поступающие в организм чужеродные соединения (канцерогены, лекарства, промышленные яды и пр.) активируются с помощью ферментов семейства цитохромов Р450 или микросомальных эпоксид-гидролаз (тЕРОХ) [19], образуя короткоживущие промежуточные электро-фильные метаболиты, которые обладают генотоксическими свойствами (фаза I). Затем эти промежуточные метаболиты с помощью ферментов семейств глутатионтрансферазы (GSTM), УДФ-глюкуронсульфотрансфераз (UDF), N 11 ацетилтрансфераз (NAT) превращаются в водорастворимые нетоксические продукты и выводятся из организма (фаза II), таким образом, происходит реакция сопряжения (конъюгация) метаболируемых веществ [20]. В результате ряда ферментативных реакций образуется гидрофильные продукты, которые могут легко выводиться из организма. Многие реакции фаз I и фаз II метаболических превращений достаточно хорошо изучены, но пока нет клинических примеров того, что дефицит экогенетических ферментов может компенсироваться другими ферментами [2, 21-23].
Микросомальные ферментативные системы. Многие превращения чужеродных веществ в организме человека осуществляются печеночными микросомами. Так микросомальная фракция печеночного гомогената катализирует как восстановление азосвязеЙ, так и окислительное деметилирование аминоазосоединений. Реакции требуют НАДФ и молекулярного кислорода. Позже установили, что простая ферментная система, локализованная в печеночных микросомах, обуславливает биотрансформацию многих ксенобиотиков. Максимальную активность наблюдали в том случае, если солюбилизированную фракцию замещали НАДФ-Н или системой его восстановления, состоящей из НАДФ, глюкозо-6-фосфата и его дегидрогеназы. Катализирующий эту реакцию, необходим ион магния. Сочетание восстановительного агента с молекулярным кислородом позволяет отнести реакцию к монооксигеназным [24-28].
В микросомах происходит большое число разнообразных реакций окисления: гидроксилирование алифатических, ациклических и ароматических соединений, S- и N-окисление, дезаминирование, О-, N- и S-дезалки-лирование, дегалогенизация. В печеночных микросомах обнаружена также азо- и нитроредуктазная активность [16].
Все процессы, в которых участвует микросомальная система, метабо-лизирующая ксенобиотик, могут рассматриваться просто как различного рода гидроксилирование [29-32]. Полагают, что микросомальная система, метаболизирующая ксенобиотики, функционирует за счет активации кислорода, который затем передается токсиканту (рис. 1.1).
Схема Уэлша (А) и Ульриха (Б): гидроксилирование ксенобиотиков микросомальными монооксид азами и взаимодействие их с цитохромом Р-450
Основными ферментами являются НАДФ-Н-цитохром С редуктаза, флавиновый фермент, участвующий в окислении НАДФ-Н, цитохром Р-450 и НАДФН-цитохром Р450 редуктаза, которая восстанавливает окисленный цитохром Р-450.
Доказано участие цитохрома Р-450 в лекарственном метаболизме: печень и кора надпочечников окисляют стероиды, в том числе и экзогенные, а микросомы этих органов богаты цитохромом Р-450 [31, 33-36]. Многочисленные ферменты этого цитохрома называются группой микросо-мальных оксидаз (МО) или также называемой микросомальной системой метаболизма или монооксигеназной системой. В последние годы выделены изоферменты CYP450 - CYP4503A4, CYP450 2Д6, 2Е1 и другие, ответственные за биотрансформацию различных лекарственных веществ (ЛВ) и эко-токсикантов [3, 20, 37-39].
Ферментативные системы конъюгации. Присоединение метальной группы к субстрату - обычная реакция обмена, широко встречающаяся как в анаболических, так и в катаболических процессах. Метилирование может сопровождаться усилением биологической активности и её ослаблением.
Донором метальной группы является активированный метионин, превращающийся при этом в гомоцистеин. К наиболее важным эндогенным акцепторам относятся никотинамид (образующий N-метилникотинамид), норадреналин (адреналин), ацетилсеротонин (мелатонин), гуанидинацетат (креатин), фосфатидилэтаноламин (фосфатидилхолин), гомоцистеин (мети-онин) и полинуклеотиды (метилированные полинуклеотиды) [40].
В зависимости от функциональной группы в субстрате различают N-, О- и S-метилирование. Так, фенилэтаноламины метилируются при участии фенилэтаноламин-1Ч-метилтрансферазы, локализованной в мозговом слое надпочечников. Максимальная активность выявляется в супернатанте в при-сутствии ионов Mg и глутатиона [41].
Аппаратура, объекты и техника эксперимента
Синтез 4-хлор-5,7-динитробензофуразана (БФЗ), 7-хлор-4,6-динитро-бензофуроксана (БФО) проведен к.х.н. Левинсоном Ф.С. Условия синтеза 5,7-динитробензофуразановых производных аминов и их свойства описаны в работах [187-189].
Полноту превращения аминов в производные, степень извлечения производных при экстракционном концентрировании определяли по результатам спектрофотометрического и хроматографического анализа. Для этого использованы синтетически выделенные производные тест-препаратов и токсикантов, содержащих аминогруппу.
В работе использована система высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) HP 1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG). Схема прибора представлена на рис. 2.1.
Система ВЭЖХ включала в себя четырехканальный градиентный насос HPG1311А с вакуумным дегазатором элюента HPG1322A, ручной инжектор пробы типа Reodyne 5525 HPG1328A, термостат колонки G1316A, диодно-матричный детектор HPG1315A и флуоресцентный детектор HPG1321A с необходимым интерфейсом, 3D систему обработки результатов анализа ChemStation HP Vectra 5ХА с программным обеспечением G2170AA (Hewlett-Packard, Agilent, Waldbronn, FRG). Разделение проводили на колонке Hypersil ODS 4-250 с использованием предколонки Hypersil ODS 4-50 мм. Объем инжектируемой пробы составлял 20 мкл.
Количественную обработку результатов хроматографических определений с различными вариантами детектирования проводили с использованием Chem. Station по площадям хроматографических пиков.
Блок-схема для высокоэффективной жидкостной хроматографии. 1 - инжектор (устройство ввода пробы); 2 - насос высокого давления; 3 -колонка для разделения смеси веществ; 4 - абсорбционный диодно-матричный детектор; 5, 6 и 7 - системно-программный комплекс ("Chem. Station"); 8 - программируемое устройство для создания градиентного элюирования (создания смесей растворителей с заданными свойствами); 9 -флуоресцентный спектрофотометр.
Полноту превращения аминов в производные при экстракционном концентрировании определяли по результатам хроматографического анализа.
Спектры поглощения соединений регистрировали на спектрофотометре СФ-26, оптическую плотность исследуемых растворов в УФ-области измеряли в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Кислотность растворов контролировали рН-милливольтметром MV-87S. В работе использована центрифуга К-23 (Janetszki).
В работе использованы реактивы марок х.ч. и ч.д.а. Для исследований применяли хроматографически чистые ацетонитрил и метанол (Криохром, Санкт-Петербург). Вода хроматографической чистоты получена на установке Simplicity 185 (Millipore, Франция). Обезвоживание растворителей в необходимых случаях проводили над молекулярными ситами ЗА. Экстрагенты (хлороформ, хлористый метилен и изоамиловый спирт) квалификации «х.ч.» использованы без дополнительной очистки.
В работе были использованы лекарственные препараты в виде таблеток сульфадимезин, фтивазид, метазид, салюзид (по 0,5 г) и изониазид, фосфабензид (по 0,3 г) фармакопейной чистоты. Фенотип ацетил ирования определялся в группе обследуемых включающей 180 вариабельно отобранных человек без патологии печени и почек. Токсикокинетические параметры метаболизма замещенных гидразина определялись в группе обследуемых из 50 человек. Возрастная категория группы составила 20-35 лет. Экстракция образцов мочи и слюны проводилась в делительных воронках объемом 0,5 л в течении 15-20 мин. Соотношение объемов биосубстратов и органической фазы при экстракции составляло 10:1 по объему.
Разработка методов определения фенотипа ацетилирования на основе оценки содержания тест-препаратов в слюне
При определении фенотипа ацетилирования в слюне маркеры ацетилирования однократно перорально вводились пациенту в дозе 0,45 г (изониазид) и 0,5 г (сульфадимезин). Слюну собирали каждый час в течение 6-8 часов после приема тест-препарата. Проводили пробоподготовку анализируемых биосубстратов. Добавляли 20% раствор сульфата цинка и 10% трихлоруксусную кислоту депротеинизируюя содержащиеся белковые компоненты при анализе слюны.
При оптимизации условий осаждения веществ белковой природы, содержащихся в образцах слюны, в качестве осадителей были использованы соли цинка и растворы трихлоруксусной кислоты. Как показали полученные результаты, степень осаждения зависит от концентрации соли в растворе-осадителе. С увеличением концентрации раствора сульфата цинка вплоть до 20% наблюдается лучшее осаждение белков. С изменением продолжительности центрифугирования до 10-15 минут также повышается эффективность удаления белковой матрицы.
Методика определения сульфадимезина в слюне при использовании реагента 7-хлор 4,6-динитробензофуроксана и гидразида изоникотиновой кислоты с 5,7-динитробензофуразаном включала почасовой пробоотбор слюны, пробоподготовку и спектрофотометрический анализ выводимых тест-препаратов. Методика определения фенотипа ацетилирования. Перед приемом тест-препарат отбирается слюна не содержащая сульфаниламиды и препараты производные гидразина. Отбирали 2 мл слюны, добавляли 1 мл воды, затем 1 мл 10 %-ного раствора сульфата цинка и 1 мл 0,75 М гидроксида натрия. После химической деструкции содержащихся белков в слюне, осаждали их центрифугированием в течение 15 мин. Далее отбирали 3 мл надосадочной жидкости, добавляли 1 мл фосфатного буфера (рН 6,86), тем самым, восстановив необходимую кислотно-основную среду для проведения реакции дериватизации, затем 0,5 мл БФО (биомаркер - сульфадимезин) и 0,5 мл БФЗ (биомаркер - ГИНК). После завершения химической модификации измеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм в случае если определяется концентрация сульфадимезина и 510 нм изониазида.
Параметры выведения сульфадимезина со слюной при пер-оральном приеме в дозе 0,5 г (достоверность различий между показателями быстрого и медленного ацетилирования Р 0,01)
Кинетические параметры Быстрые ацетиляторы (33 чел) Медленные ацетиляторы (27 чел)
Уровень содержаниясульфадимезина в слюнечерез 1 час, мкг/мл 2,0±0,5 7+2,5
Уровень содержаниясульфадимезина в слюнечерез 2 часа, мкг/мл 2,7±0,3 7±2,0
Уровень содержаниясульфадимезина в слюнечерез 3 часа, мкг/мл 2,5±0,5 7+2,0
Уровень содержания сульфадимезина в слюне: 1- быстрые ацетиляторьт, 2 — медленные ацетиляторы (реагент БФО)
Правильность определения индивидуальных особенностей генетически детерминированных процессов биотрансформации ксенобиотиков и установления фенотипа ацетилирования с использованием методов определения сульфадимезина в моче и слюне была доказана в сравнительной характеристике данных «введено - найдено», представленных в табл. 3.6.
Сравнительная характеристика результатов спектрофото-метрического определения сульфадимезина в моче и слюне
Биологические объекты Сульфадимезин (мкг/мл) Sr Использование растворов трихлоруксусной кислоты для осаждения веществ белковой природы включает дополнительные процедуры нейтрализации надосадочнои жидкости перед проведением последующих аналитических процедур, что затрудняет и технически усложняет процесс пробоподготовки.
Нами была модифицирована методика определения изониазида в слюне, при этом были изменены условия проведения пробоподготовки слюны. Уменьшение объема отбираемой слюны, а также использования для осаждения белков только 20 %-ного раствора сульфата цинка позволило сократить время центрифугирования до 5-10 минут и обеспечить экспрессность аналитических процедур. Параметры экскреции изониазида со слюной при пероральном приеме 0,5 г лекарственного вещества за 6 часов в процентах от дозы составили для сверхбыстрых (7 человек) 0,1-2,4%, быстрых ацетиляторов (30 человек) до 5%, а для медленных (23 человек) 6,8-14,3%.
По данным видно, что меньшему процентному значению количества выведенного изониазида соответствует низкое содержание его в слюне у быстрых ацетиляторов, и наоборот, большему значению — высокое содержание препарата при первых 3 часах измерения у медленных ацетиляторов (табл. 3.8). На рис. 3.9 представлены кинетических кривые выведения изониазида в слюне испытуемых.
