Содержание к диссертации
Введение. 6
I. Обзор литературы. 12
1. Состав и структура клеточной стенки. 12
2. Биосинтез компонентов клеточной стенки. 21
3. Биосинтез целлюлозы. 21
3.1. Субстраты биосинтеза целлюлозы и пути их образования. 24
3.2. Каталитический центр. Терминальные комплексы, розетки. 28
3.3.Ориентация микрофибрилл. Участие цитоскелета в формировании клеточной стенки растений. 36
4. Первичная и вторичная клеточная стенка. 45
5. Использование методов микроскопии для изучения клеточной стенки растений. 49
II. Объекты и методы. 60
1. Общая характеристика объектов исследования. 60
1.1 .Флоэмные волокна стебля льна-долгунца (Ыпит usitatissimum L). 61
1.2. Волоски семян хлопчатника {Gossypium hirsutum L.). 67
1.3. Культура клеток циннии {Zinnia elegans L.), формирующая трахеальные элементы. 68
2. Подготовка растительного материала. 71
3. Флуоресцентная микроскопия. 75
3.1. Подготовка срезов стебля льна-долгунца. 75
3.2.Подготовка клеток циннии. 77
4. Сканирующая электронная микроскопия. 79
5. Трансмиссионная электронная микроскопия (метод ультратонких срезов). 79
6. Цитохимический анализ. 88
7. Иммуноцитохимический анализ. 89
7.1. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителом к (3-(1-»4)-D - галактанам на ультратонких срезах стебля льна. 89
7.2. Проведение иммуноцитохимической реакции с антителами к сахарозосинтазе, актину и каллозе на ультратонких срезах волосков семян хлопчатника и трахеальных элементах циннии. 90
8. Статистическая обработка результатов. 93
8.1. Количественная оценка иммуноэлектронно- микроскопической метки на срезах флоэмных
волокон льна-долгунца. 94
8.2. Количественная оценка иммуноэлектронно- микроскопической метки на срезах волосков
семян хлопчатника. 94
микроскопической метки на срезах
трахеальных элементов циннии. 95
III. Результаты и обсуждение. 97
1. Волокна склеренхимы: флоэмные волокна льна-долгунца. 97
1.1. Флюоресцентная микроскопия. 97
1.1.1. Характеристика и использование точки слома
(ТС) для планирования и проведения экспериментов. 97
1.1.2. Окрашивание срезов Cellufluor (СФ). 99
1.1.3. Окрашивание срезов специфическим
красителем на пектиновые вещества (СКП). 114
1.1.4. Динамика формирования флоэмных волокон. 120
1.1.5. Аутофлуоресценция лигнина во флоэмных волокнах и сосудах ксилемы в стебле льна-долгунца. 124
1.1.6. Механическое разделение пучков флоэмных волокон (луба) и слоя клеток вторичной ксилемы (древесины). 125
1.2. Изучение строения флоэмных волокон и структуры клеточной стенки методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). 131
1.2.1. Расслоение стебля льна-долгунца на последних стадиях созревания. 131
1.2.2. Поверхность флоэмных волокон. Закрученность волокон. 139
1.3. Изучение флоэмных волокон в ходе онтогенеза растений льна-долгунца методами трансмиссионной электронной микроскопии. 143
1.3.1. Ультраструктура флоэмных волокон. 143
1.3.2. Цитохимический анализ флоэмных волокон. Результаты окрашивания срезов по методу Тьери. Двуслойность клеточной стенки волокон. 152
1.3.3. Иммуноцитохимический анализ распределения галактана в тканях стебля льна-долгунца. 156
1.3.4. Определение локализации лигнина во флоэмных волокон и вторичной ксилемы методом цитохимии- ческого анализа фермент-золото (enzyme-gold). 182
2. Трихомы: волоски семян хлопчатника. 193
2.1. Ультраструктура волосков семян хлопчатника. 194
2.2. Иммуноцитохимическая локализация клеточных структур, белков и полисахаридов, участвующих в формировании клеточной стенки и входящих в ее состав. 201
2.2.1. Иммуноцитохимическая локализация сахарозосинтазы. 202
2.2.2. Иммуноцитохимическая локализация каллозы. 211
2.2.3. Двойное иммуномечение ультратонких срезов: сахарозосинтаза + каллоза. 213
2.2.4. Иммуноцитохимическая локализация актина. 214
2.2.5. Двойное иммуномечение ультратонких срезов: сахарозосинтаза + актин. 218
3. Трахеальные элементы: культивируемые клетки циннии {Zinnia elegans L.). 220
3.1. Ультраструктура трахеальных элементов циннии. 220
3.2. Иммунофлуорусцентная микроскопия. 221
3.3. Электронно-микроскопическая иммунолокализация клеточных структур и белков, участвующих в формировании клеточной стенки трахеальных элементов циннии. 224
3.4. Анализ взаиморасположения структур с использованием иммуноцитохимических реакций на ультратонких серийных срезах. 230
Заключение. 231
Выводы. 237
Список литературы. 238
Введение к работе
.
Целлюлоза является основным по массе органическим веществом биосферы, широко используется во многих современных производствах (Тарчевский, Марченко, 1985). При этом, как отмечается в ряде работ (Amor et al., 1995, Delmer, 1999, Haigler et al., 2001), нет другого такого процесса в растениях, который был бы столь важен и столь мало изучен на молекулярном уровне, как синтез целлюлозы. Основное количество целлюлозы содержится в так называемых вторичных клеточных стенках растений. Вторичная клеточная стенка - это слой клеточной стенки, который формируется клетками, закончившими свой рост. Он характерен, в первую очередь, для клеток тканей, выполняющих опорно-механическую и проводящую функции. Эти клетки обычно обладают рядом особенностей: значительная длина (до нескольких сантиметров), особенности роста, индивидуальная динамика клеточных органелл, толстая клеточная стенка, состав клеточной стенки. Жизнедеятельность этих специализированных клеток в большой степени направлена на интенсивный синтез компонентов клеточной стенки, поэтому они являются удобным объектом для изучения процесса формирования вторичной клеточной стенки и, в частности, процесса биосинтеза целлюлозы.
Синтез микрофибрилл целлюлозы в растениях является высоко скоординированным процессом, который происходит на поверхности плазматической мембраны (Delmer, 1982). Имеются основания полагать, что биосинтез целлюлозы обусловлен взаимодействием нескольких белков и участием ряда органелл (Delmer, Amor, 1995, Haigler et al., 2001., Salnikov et al., 2001, 2003), однако детали этого процесса и взаимодействия структур едва начинают поддаваться пониманию.
Незаменимым инструментом в исследовании механизмов синтеза целлюлозы и других структурных полисахаридов являются методы электронной микроскопии. Однако их использование для клеток, имеющих вторичную клеточную стенку, сталкивается с рядом проблем. Так, достижение высокого качества химической фиксации материала для ультраструктурных исследований осложняется толщиной клеточной стенки, а также наличием крупной вакуоли и, как следствие, особой чувствительностью к изменениям осмотичности растворов-фиксаторов. Все эти факторы усиливают неизбежность тенденции к медленной химической фиксации, иммобилизирующей цитоплазму в состоянии, когда она уже значительно нарушена в ходе приготовления образца (Mersey, McCully, 1978). Артефакты химической фиксации приносят особенный ущерб исследованиям синтеза целлюлозы, который организован в пределах клеточного кортекса и особенно чувствителен к манипуляциям в ходе приготовления образцов для электронной микроскопии. Появление новых методов фиксации, таких как замораживание-скалывание, замораживание-замещение и замораживание-замещение под высоким давлением, открывают новые возможности для исследований растительных клеток и тканей. Однако к началу наших исследований они не были адаптированы для анализа клеток с толстой вторичной клеточной стенкой.
Цель и задачи исследования.
Целью нашей работы было изучение структурно-функциональных характеристик формирования клеточных стенок в тканях, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы. Ее реализация связывалась с решением следующих задач:
1. Адаптировать современные методы анализа ультраструктуры растительных тканей для клеток, характеризующихся толстой клеточной стенкой с высоким содержанием целлюлозы.
2. Проанализировать динамику формирования клеточных стенок в различных тканях, формирующих вторичнюу клеточную стенку.
3. Охарактеризовать ультраструктуру разных типов клеток, специализированных на формировании вторичной клеточной стенки.
4. Определить локализацию ключевых структур и белков, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
5. Сопоставить структурно-функциональные характеристики формирования первичной и вторичной клеточной стенки.
Научная новизна работы.
В работе получили развитие представления о динамичности и мозаичности структуры клеточной стенки и механизмах формирования целлюлозных микрофибрилл. Показано, что механизмы синтеза целлюлозы первичной и вторичной клеточной стенки качественно различимы.
Проведено комплексное исследование по изучению динамики роста и формирования склеренхимных волокон с использованием методов световой флуоресцентной микроскопии, электронной микроскопии (сканирующая и трансмиссионная) и иммуноцитохимического анализа. Впервые продемонстрированы особенности формирования вторичных клеточных стенок флоэмных волокон льна-долгунца. Выявлена постсинтетическая модификация р-(1— 4)-0-галактана во время утолщения клеточной стенки, доказана тканеспецифичность этого высокомолекулярного полимера. Впервые продемонстрирована мозаичность распределения лигнина и других фенольных соединений во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца.
Разработаны методы криогенной фиксации (замораживание-замещение) и особый режим проводки образцов через градиент эпоксидных смол. В результате такой фиксации появилась возможность описать ряд органелл волосков семян хлопчатника, включая структуры аппарата Гольджи, мультивезикулярные тельца и пропластиды.
Впервые на ультраструктурном уровне локализована особая форма сахарозосинтазы, связанная с плазматической мембраной. При анализе серийных ультратонких срезов впервые установлено взаиморасположение отдельных клеточных структур, участвующих в формировании микрофибрилл целлюлозы.
Основные положения, выносимые на защиту.
1). В формирующемся стебле льна-долгунца, в верхней его части существует специфический участок - «точка слома», где стебель значительно меняет свои механические свойства, что связано с изменением стадии формирования флоэмных волокон.
2). Утолщение клеточной стенки флоэмных волокон льна-долгунца начинается на внешней периферии пучка и продолжается по направлению к центру стебля.
3). Обнаруженный во вторичной клеточной стенке флоэмных волокон льна-долгунца буферорастворимый галактан является тканеспецифичным, то есть присутствует только во флоэмных волокнах этих растений.
4). Вторичная клеточная стенка флоэмных волокон характеризуется мозаичностью распределения лигнина и других фенольных соединений.
5). Метод замораживания-замещения позволяет установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур-антигенов.
6). В клетках, специализированных на интенсивном синтезе целлюлозы, во время отложения вторичной клеточной стенки всегда присутствует особая форма сахарозосинтазы, которая локализована вплотную к плазматической мембране.
7). Актиновые микрофиламенты не являются обязательными участниками формирования вторичных клеточных стенок, а обнаруживаются лишь при сложной пространственной организации этого процесса, например, при образовании локальных утолщений клеточных стенок в трахеальных элементах.
8). Каллоза существует в виде постоянного слоя в ходе формирования вторичной клеточной стенки волосков семян хлопчатника и, вероятно, выполняет роль невзаимодействующего матрикса, в котором происходит кристаллизация микрофибрилл целлюлозы.
Практическое значение работы.
Практическое значение данной работы во многом определяется тем, что объектами исследования были флоэмные волокна льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) и волоски семян хлопчатника {Gossipium hirsutum L.) -ткани важнейших технических культур. Получены данные, позволяющие изменить представление об их формировании.
Проведен комплексный анализ формирования клеточной стенки волокон льна-долгунца, что может послужить практическим руководством для изучения сходных по значению технических культур таких, как конопля, рами и других.
Детально разработаны приемы быстрой криогенной фиксации растительной ткани (замораживание-замещение), анализа серийных ультратонких срезов, современных методов иммуноцитохимии, что может быть использовано в работах, где необходимо установить стабильно воспроизводимую локализацию лабильных белковых структур.
Личный вклад соискателя.
Представляемые в работе данные были получены в совместных исследованиях с коллегами из лаборатории Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН и в лаборатории электронной микроскопии Техасского технического университета (США). В диссертацию включены и вынесены на защиту только те результаты, в которых автору принадлежит существенная или определяющая роль.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены автором на регулярных итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН, на трех Всесоюзных конференциях "Биосинтез целлюлозы" (Казань 1980, 1985, 1990), на Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1982), на VI Всесоюзном симпозиуме "Ультраструктура растений" (Чернигов, 1988), на регулярных международных конференциях по клеточной стенке (VI Cell Wall Meeting -Nijmegen, Голландия, 1992, VII - Santiago de Compostella, Испания, 1995, VIII -Norwich, Англия, 1998, IX - Toulouse, Франция, 2001, X -Sorrento, Италия, 2004), на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на V Съезде физиологов растений России (Пенза, 2004). Диссертационная работа в завершенном виде была представлена в виде устного доклада на семинарах в Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН и в Техасском техническом университете (Лаббок, США).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано около 60 научных работ. В список опубликованных работ входят две монографии, статьи в отечественных ("Доклады РАН", "Физиология растений", "Цитология", "Ботанический журнал") и зарубежных ("Plant Molecular Biology", "Phytochemistry", "Plant Physiology", "Protoplasma", "Annuar Botany", "Natural Fiber", "Industrial Crops and Products") журналах, а также материалы, представленные на конференциях и изданные в научных сборниках.
Структура и объем работы.
Основной текст диссертации изложен на 272 страницах, состоит из 3 глав, заключения и выводов. Список литературы содержит 369 названий, из них 325 на иностранных языках. Текст диссертации в себя включает 1 тавлицу, 2 схемы, 34 рисунков и 174 фотографии.
Благодарности. Приношу свою благодарность профессору д. б. н. Лозовой В.В., под руководством которой в институте были заложены основы исследований физиологии растения льна-долгунца, коллегам, работавшим со мной в разные годы в КИБ КНЦ РАН., с.н.с, к.б.н. Агеевой М.М., с.н.с, к.б.н. Чемикосовой СВ., к.б.н. доценту кафедры физиологии и биотехнологии растений Казанского государственного университета О.А. Тимофеевой, сотрудникам ГНУ ВНИИЛ РАСХ (Торжок) д.б.н. А.А. Жученко и к.б.н Л.Н. Курчаковой, сотрудникам БелНИИЗ (Жодино) д.с.-х.н. М.И. Афонин), Е.Д.
Мироновой, Л.М. Кукреш, коллегам из Агротехнологического института (Вагенинген, Нидерланды), особенно Jan van Dam, коллегам Техасского технического университета (Лаббок, Техас, США) С.Н. Haigler, М. Grimson - за совместные экспериментальные работы и плодотворное обсуждение полученных данных. Неоценима роль заведующего нашей лабораторией механизмов роста растительных клеток КИББ КНЦ РАН, моего научного консультанта, превосходного руководителя Татьяны Анатольевны Горшковой, без всесторонней поддержки и помощи которой эта работа была бы осуществима с большими трудностями. Выражаю искреннюю признательность академику И. А.
Тарчевскому, по инициативе и усилиями которого в КИБ КНЦ РАН были организованы работы по изучению растительной клеточной стенки.
