Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Образование морозостойкого состояния растениий 9
1.1.1. Общие принципы формирования устойчивости растений к пониженным температурам 9
1.1.2. Роль абсцизовой кислоты в формировании низкотемпературной устойчивости растений 16
1.2. Изменения метаболизма клеточной стенки растений при действии неблагоприятных факторов окружающей среды 22
1.3. Процессы, происходящие в клеточной стенке при низкотемпературной адаптации и действии АБК 28
1.4. Гликозидазы клеточных стенок растений 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2. Обработка растительных объектов 41
2.3. Приготовление белковых экстрактов 42
2.4. Определение белка 43
2.5. Определение гликозидазной активности 43
2.6. Выделение фракций полисахаридов 44
2.7. Антронный метод определения Сахаров 45
2.8. Определение каллозы 45
2.9. Измерение морозостойкости 46
2.10. Определение митотического индекса клеток суспензионной культуры озимой пшеницы 47
2.11. Статистическая обработка результатов 47
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 48
3.1. Исследование влияния низкой положительной температуры на гликозидазы проростков разных сортов пшеницы и ржи при низко температурной адаптации 48
3.1.1. Влияние низкотемпературного воздействия на активность гликозидаз и устойчивость проростков разных сортов яровой пшеницы и озимой ржи 48
3.1.2. Сравнение влияния высокоочищеной олигосахаридной фрак ции, индуцирующей морозостойкость, на активность гликозидаз яровой пшеницы и озимой ржи 56
3.2. Влияние эффекторов на индуцируемую АБК активацию глико зидаз корней проростков озимой пшеницы 63
3.2.1. Изменение активности гликозидаз и содержания нецеллюлозных фракций полисахаридов клеточной стенки при действии АБК 63
3.2.2. Влияние АБК на активность гликозидаз закаливающихся проростков озимой пшеницы 70
3.2.3. Действие циклогексимида на индуцированное АБК изменение активности гликозидаз корней проростков озимой пшеницы 75
3.2.4. Действие флуфеназина на индуцированное АБК изменение активности гликозидаз корней проростков озимой пшеницы 80
3.3. Характеристика действия АБК на ростовые параметры и формирование морозостойкого состояния суспензионной культуры озимойп шеницы 84
3.3.1. Характеристика и особенности развития суспензионной культуры озимой пшеницы 04
3.3.2.Влияние АБК на рост и митотический индекс суспензионной культуры озимой пшеницы 89
3.3.3. Особенности возникновения морозостойкости суспензионной культуры озимой пшеницы под действием АБК 93
4 3.3.4. Влияние АБК на активность гликозидаз культуры озимой
пшеницы в течение пассажа 100
Заключение 103
Выводы 106
Список использовашои литературы
- Общие принципы формирования устойчивости растений к пониженным температурам
- Приготовление белковых экстрактов
- Определение митотического индекса клеток суспензионной культуры озимой пшеницы
- Изменение активности гликозидаз и содержания нецеллюлозных фракций полисахаридов клеточной стенки при действии АБК
Введение к работе
Актуальность работы. Температура среды - один из основных экологических факторов, определяющих продуктивность растений, может изменяться в широком диапазоне значений - для нее характерны суточные, сезонные, годовые колебания. Устойчивость растений к низким температурам позволяет им выживать в зимних условиях, а весной возобновлять рост и развитие.
В формировании низкотемпературной устойчивости в процессе осенней закалки принимают участие все клеточные компартменты. События, имеющие место на уровне протопласта в ходе термоиндуцированных изменений клетки, в целом, хорошо охарактеризованы. При этом, представления о процессах, происходящих в клеточной стенке под действием низких температур, а также ее роли в низкотемпературной устойчивости ещё только формируются. Будучи многокомпонентной системой, клеточная стенка участвует в росте и развитии клеток и вовлекается в такие процессы, как устойчивость к различным неблагоприятным воздействиям среды (Tabuchi, Matsumoto, 2001; Piro et al., 2003). Являясь динамичным клеточным компартментом, клеточная стенка непрерывно претерпевает значительные изменения состава и структуры. Неизбежно образуемые при этом фрагменты полисахаридов вовлечены в регуляцию процессов жизнедеятельности растений. Так, например, хорошо известно, что олигосахаридные продукты являются активными эли-ситорами защитных реакций при патогенной инфекции (Albersheim et al., 1983). Выделенные в последнее десятилетие эндогенные олигосахариды, повышающие морозостойкость растений, открывают новый этап в развитии представлений о механизмах формирования адаптационных процессов (Забо-тинаидр., 1998,2003).
Одним из основных аргументов для формирования представлений о клеточной стенке, как о динамичной структуре, является присутствие в ней большого спектра ферментов. Среди них наиболее распространён класс гид-
7 ролаз, к которому относятся гликозидазы. Показано, что они участвуют в модификации клеточной стенки в процессе роста клеток, созревания плодов (Ма-suda et al., 1985, Ranwala et al., 1992), а также в защитных реакциях растений в ответ на действие патогенов (Seo et al., 1995). Эти ферменты вовлечены также в процессы модификации полисахаридов клеточной стенки в ходе низкотемпературной адаптации (Заботин и др., 1998), что представляет для нас наибольший интерес. Особого внимания заслуживает участие гликозидаз в ката-болических реакциях, исследование которых актуально как с точки зрения их роли в образовании регуляторных молекул (Тарчевский, 2001), так и особенностей формирования морозостойкости растительного организма.
Цель и задачи исследования. Целью работы является характеристика вовлеченности гликозидаз клеточной стенки в формирование морозостойкого состояния растений.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Провести сравнительное исследование активности гликозидаз проростков различных по устойчивости сортов пшеницы и ржи при формировании низкотемпературной адаптации.
Оценить влияние олигосахаридной фракции, индуцирующей морозостойкость, на активность гликозидаз клеточной стенки проростков озимой пшеницы.
Оценить влияние АБК, инициирующей морозостойкость, на активность гликозидаз клеточной стенки проростков озимой пшеницы.
4. Охарактеризовать некоторые особенности формирования морозо
стойкости клеток при действии АБК в модельной системе - суспензионной
культуре озимой пшеницы Triticum timopheevli Zhuk.
Научная новизна работы. Показано, что повышение активности гликозидаз является частью процесса адаптации озимых злаков. Впервые обнаружено влияние олигосахарина НТ, индуцирующего морозостойкость, на активность гликозидаз. Установлено, что реакция ферментов на действие температуры и олигосахарина НТ характерна только для озимых растений и не явля-
8 ется сорто- и видоспецифичной. Впервые выявлена активация гликозидаз под действием АБК; показано, что этот процесс сопровождается изменением пропорции нецеллюлозных полисахаридов клеточной стенки. Использование частично синхронизированной суспензионной культуры клеток озимой пшеницы позволило показать, что процесс инициации закаливания определяется долей воспринимающих (компетентных) сигнал АБК клеток.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе получили развитие представления о регуляторных механизмах низкотемпературной адаптации и, в частности, процессов, происходящих на уровне клеточной стенки. Показано, что активация гликозидаз, как часть термоиндуцирован-ных катаболических реакций включена в генетическую программу адаптации клеток. Она может быть физиологическим показателем закаливающихся растений. Расшифровка механизмов перестройки клеточной стенки в ходе низкотемпературной адаптации поможет изменять свойства растительных организмов на молекулярном уровне, что позволит создавать новые устойчивые сорта растений.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 4 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (241 наименование, из них 56 на русском языке).
Общие принципы формирования устойчивости растений к пониженным температурам
Значительный вклад в разработку целостной теории повышения устойчивости и закаливания растений к низким температурам был внесён И.И. Тумановым (1979). Устойчивость озимых растений к низким температурам приобретается ими в процессе осеннего закаливания. Закаливание - поэтапный процесс, который в естественных условиях происходит на фоне постепенного снижения температуры, от слабоположительных (первая фаза) до отрицательных (вторая фаза), и приводит к формированию зимостойкости -устойчивости к комплексу суровых условий зимнего периода, который шире понятия морозостойкости, поскольку включает не только устойчивость к низким температурам, но и к выпреванию, вымоканию, зимним оттепелям и т.д. Морозостойкость - это только способность противостоять длительному воздействию низких температур, которая определяется генетическими возможностями вида, сортовыми особенностями и способностью к закалке.
Основополагающим звеном устойчивости растений к низким температурам является поддержание их жизнеспособности в условиях водного дефицита при возникающем обезвоживании тканей, то есть, растения должны обладать механизмами, предотвращающими внутриклеточное замерзание воды и существовать при значительном обезвоживании. К таким можно отнести: высокую проницаемость плазмалеммы для воды, высокое содержание сухого вещества при пониженном содержании воды в клетках и повышенную концентрацию клеточного сока. Уменьшению повреждающего воздействия внеклеточного льда, образующегося в межклетниках, способствует устойчивость протоплазмы к обезвоживанию, её большая водоудерживающая способность, высокая концентрация криопротекторов (Сахаров, белков, свободных аминокислот, полианионов и т.д.), стабилизирующих структуры клеток. Таким образом, в процессе закаливания меняются углеводный и водный статусы растения, и, как следствие, значительно изменяются содержимое и свойства протопласта.
На целом ряде растений и клеточных культур экспериментально доказана связь накопления Сахаров с морозоустойчивостью (Трунова, 1963; Perrars, Sarham, 1984; Volenec et al., 1991; Koster, Lynch, 1992; Vagujfalvi et al., 1999; Kalengamaliro et al., 2000). Было показано, что холодовая адаптация сопровождается изменением углеводного метаболизма, при этом увеличивается как активность ферментов, участвующих в этом процессе (Holaday et al, 1992), так и их количество (Guy et al., 1992). Подобные изменения наблюдаются уже в течение часа действия пониженных температур (Колупаев, Трунова, 1994). Одной из основных функций накопления Сахаров является повышение осмотического потенциала, предотвращающего или замедляющего замерзание протопласта. Кроме того, накапливающиеся углеводы стабилизируют белково-липидные комплексы клетки, предотвращая их денатурацию при водном дефиците, вызванном образованием льда в межклетниках, и являются антинуклеаторами, ингибирующими образование льда (Alberdi, Сог-cuera, 1991). И, наконец, защитная функция Сахаров проявляется в снабжении растений энергией, при отсутствии фотосинтетических процессов во время закаливания (Дорофеев и др., 2004). При этом, в повышении устойчивости озимых растений к низким температурам участвуют как полисахариды, так и отдельные моносахара. Так, например, наблюдалась тесная зависимость между содержанием ди- и олигосахаридов и морозостойкостью пшеницы и ржи (Дорофеев и др., 2004), а в работе (ОИеп, 1984) было показано, что фруктоза и глюкоза противодействовали адгезии между мембранами и межклеточным льдом, предотвращая повреждения. Важную роль в адаптации к низким температурам играют белки и свободные аминокислоты. Показано, что содержание свободных аминокислот у морозостойких сортов более высокое, чем у неморозостойких (Дорофеев и др., 2004). Так, повышенный уровень пролина сопровождался увеличением способности растений переносить низкую температуру (Machackova et al., 1989; Tantau, Dorffling, 1991; Стаценко, 1992; Dorffling et al., 1993; Murelli et al., 1995). Во время адаптации активно накапливается аспарагиновая кислота и лизин (Стаценко, 1992). Известно, что формирование устойчивости растений к холодам и морозам связано с увеличением абсолютного содержания белка в клетке (Колоша, Костенко, 1976; Levit, 1980; Родченко, 1985; Pinedo et al., 2000), поскольку показано, что ингибирование синтеза белка с помощью циклогексимида снижает или полностью подавляет процесс формирования устойчивости (Трунова, Зверева, 1977; Титов, Шерудило, 1990; Новицкая и др., 1995). Большое внимание уделяется роли отдельных белков и целых семейств в повышении морозостойкости растений (Thomashow, 1990; Hughes, Dunn, 1996; Pearce, 1999; Thomashow, 2001; Войников и др., 2004). Такой интерес к данному аспекту адаптации не случаен, поскольку, синтез специфических белков при холодовом воздействии связан с развитием устойчивости растения к низким температурам (Kasperska-Palacz et al., 1977; Войников, Корытов, 1991; Anderson et al., 1994; Guy, Li, 1998). Значительное внимание в этом плане уделяется исследованиям белков-шаперонов (Hernandez, Vierling, 1993; Guy, Li, 1998).
Приготовление белковых экстрактов
Количество белка в образцах определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Реакционная смесь содержала 90 мкл дистиллированной воды, 10 мкл белка и 1 мл раствора Кумасси, контроль - 100 мкл воды и 1 мл раствора Кумасси. Измерение оптической плотности проводилось на приборе спектрофотометре "Specol" (Германия) при длине волны 595нм. Количество белка определяли по калибровочной кривой, используя БСА (бычий сывороточный альбумин) в качестве стандарта.
Ферментативную активность гликозидаз измеряли по модифицированной методике (Masuda et al. 1988), с использованием в качестве субстратов 4-метилумбеллиферил меченые сахара (4-Ми-гликозиды), ("Sigma", США). Реакционная смесь (0,5 мл) содержала: 0,48 мл 0,1 М фосфат-цитратного бу фера (Mcllvaine) (рН 5,0), 0,02 мл 4-Ми-гликозида, растворенного в том же буфере и 10 мкл белкового препарата. Концентрация каждого субстрата в реакционной смеси была: для 4-Ми-Р-0-галактозида - 75 мкМ, 4-MU-P-D-глюкозида - 500 мкМ, 4-Ми-а-Ь-арабинозида - 75 мкМ, 4-MU-P-D-маннозида - 75 мкМ, 4-Ми-Р-О-фукозида - 25 мкМ. Реакцию проводили при 37С в течение 10 минут. О величине ферментативной активности судили по количеству отщепившегося 4-метилумбеллиферона, содержание которого измеряли на спектрофлюориметре MPF-44B (Perkin Elmer, США) при длине волны 448 нм (длина волны возбуждения 325 нм). Активность фермента выражали в нМ 4-метилумбеллиферона, умножая на коэффициент (2,3), рассчитанный из калибровочной кривой для 4-метилумбеллиферона (натриевая соль) и относили к единице сырого веса (мг) за единицу времени (мин), или в процентах к исходному значению контрольных образцов.
Корни проростков (2 см от кончика), фиксировали в термостате при 100С в течение 30 мин, затем сушили при 60С до постоянного веса. Для выделения клеточной стенки 100 мг сухого растительного материала растирали в фарфоровой ступке. К растертой до гомогенного состояния массе добавляли 5 мл фосфатного буфера (рН 7.0) и центрифугировали при 10000 об/мин 15 мин. Осадок промывали три раза 80 % ацетоном, и центрифугировали при том же режиме. Высушенные при комнатной температуре клеточные стенки гомогенизировали с 5 мл оксалатного буфера (рН 5.2) с добавлением 0,05 М ЭДТА. Полученный гомогенат выдерживали 1 час на водяной бане при температуре 80С и затем центрифугировали при 10000 об/мин 15 мин. Осадок ещё раз ресуспендировали в том же буфере и повторяли ту же операцию. Полученная надосадочная жидкость представляла пектиновую фракцию клеточной стенки. Затем к осадку добавляли 5 мл 0,05М КОН с добавлением 0.01% боргидридом натрия и оставляли на 24 часа при комнатной температу ре, затем центрифугаровали 15 мин при 10000 об/мин, после чего собирали надосадочную жидкость. Таким образом, была получена 0,05М КОН фракция гемицеллюлоз. Последующие фракции гемицеллюлоз были получены таким же образом, путём последовательной экстракции 1М КОН и 4М КОН.
К 1 мл раствора исследуемого образца добавляли 2 мл 0,2% раствора ан-трона растворённого в 98% Н2 SO4, при этом пробирки были погружены в ледяную баню. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и кипятили 10 мин, после чего быстро охлаждали погружением в лёд. Измерение оптической плотности проводилось на приборе спектрофотометре "Specol" ("Karl Zeiss" Германия) при длине волны 620 нм.
Клетки суспензионной культуры озимой пшеницы фильтровали через ткань Miracloth ("Calbiochem", США) и отмывали на фильтре дистиллированной водой. Порции клеток по 200 мг вносили в центрифужные пробирки и фиксировали 3 мл 80% этанола (в течение 10-24 ч для удаления автофлуоресцентного материала). После центрифугирования в течение 6 минут при 10 тыс. об/мин к осадку приливали 3 мл 1М NaOH и дезинтегрировали 2 раза по 2 минуты (22 кГц, 0.5 А) на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 (Россия). Каллозу экстрагировали нагреванием разрушенных клеток в течение 15 минут при 80С. После этого суспензию центрифугировали 6 минут при 10 тыс. об/мин. Супернатант использовали для исследования каллозы. Для этого 200 мкл супернатанта, экстрагированного щёлочью, смешивали с 400 мкл 0.1%-ного анилинового синего, появлялось фиолетово-красное окрашивание; добавляли 210 мкл ЇМ НС1, окраска раствора становилась тёмно-синей, и добавляли 590 мкл 1М глицин-NaOH ("Serva", Германия), рН 9.5. После перемешивания пробирки с образцами погружали в термостат на 20 минут при 50С. За это время происходило обесцвечивание раствора. Флуоресценцию измеряли через 30 мин, после выдерживания образцов при комнатной температуре, на спектрофотометре MPF-44B, ("Perkin Elmer", США), при длине волны возбуждения 397 нм и излучении 483 нм. Количество кал-лозы рассчитывали по калибровочной кривой с пачиман ("Sigma", США).
Определение митотического индекса клеток суспензионной культуры озимой пшеницы
Поскольку, было установлено влияние 16-ти часовой предобработки олигосахарина НТ на активность гликозидаз, и, этот же временной интервал, как упоминалось выше, необходим для увеличения морозостойкости растений, было предпринято более детальное исследование влияния собственно олигосахарина НТ в течение этих 16-ти часов на основном объекте исследований - озимой пшенице Казанская 84. Как видно на рисунке 7, влияние олигосахарина НТ на гликозидазы было обнаружено уже в первые 3-6 часов его действия при комнатной температуре, вызвав небольшое снижение их активности. Далее, к 9 часам воздействия, наблюдалось краткосрочное увеличение активности ферментов, с последующим понижением к 14 часам.
Таким образом, из результатов, представленных в данном разделе можно предположить, что, во-первых, основные события в запуске процесса низкотемпературной перестройки под действием олигосахарина НТ происходят именно в первые часы, что обуславливает более высокую устойчивость предобработанных проростков; во-вторых, направленность реакции гликозидаз, то есть активация или ингибирование, усиливается обработкой олигоса-харином НТ, что, в свою очередь, соотносится с его влиянием на морозостойкость разных сортов и видов злаковых (табл. 2). Учитывая последнее обстоятельство, можно заключить, что данный олигосахарин является неотъемлемой частью программы низкотемпературной адаптации, по крайней мере, злаковых культур. Его влияние на гликозидазную активность можно оценить как действие не только продукта ферментативной реакции, а эффектора, способного индуцировать процесс морозостойкого состояния самостоятельно, при комнатой температуре (Трофимова, Торощина, 2003). То есть, олигосахарин НТ способен "включать" механизмы адаптации, следовательно, активация гликозидаз отражает регуляторную роль гидролитических процессов, связанных с реорганизацией клеточной стенки, для прохождения адаптации растительного организма в целом.
Образование морозостойкого состояния растений, находящихся при комнатной температуре может быть индуцировано экзогенным добавлением фитогормона - абсцизовой кислоты (АБК) (Mantyla et al., 1995; Veisz et al., 1996), причем, вызываемые ею изменения метаболизма клетки в целом, затрагивают и свойства клеточной стенки. Так, было показано увеличение ее сухой массы, редукция растяжения, утолщение клеточной стенки и усиление регид-ности под действием АБК (Kutschera, Schopfer, 1986; Rajashekar, Lafta, 1996). To есть, АБК индуцирует изменения в клеточной стенке, аналогичные наблюдаемым и при закаливании низкими положительными температурами. В настоящее время существуют представления о том, что низкая температура и АБК могут иметь независимые пути трансдукции сигнала (Реагсе, 1999; Thomashow, 1999; Gusta et al., 2005), и, следовательно, можно предположить, что механизмы вызываемых ими эффектов не совпадают. А поскольку, как было выявлено, способность к закаливанию и изменение активности гликозидаз совпадают и включены в программу адаптивной реакции клеток озимых растений, мы сравнили влияние АБК на активности гликозидаз на начальных этапах формирования низкотемпературной адаптации, с действием собственно температуры на эти ферменты. Активность ферментов оценивали в двух белковых фракциях: растворимой и ионно-связанной (экстрагируемой NaCl).
Как видно на рисунке 8, активность всех исследованных нами гликозидаз: а-арабинозидазы, р-галактозидазы, Р-глюкозидазы, р-фукозидазы и Р-маннозидазы снижалась через 6 часов воздействия гормоном, но уже к 9 часам наблюдалась их активация. Через сутки эксперимента активность ферментов снова значительно снижалась, особенно у глюкозидазы - примерно в два раза, и затем наблюдалось постепенное возвращение к исходному уровню. К третьим суткам воздействия гормона вновь наметилась тенденция к увеличению ферментативной активности всех исследуемых гликозидаз.
Анализ активности гликозидаз связанных с клеточной стенкой (рис. 9) показал, что уже к 6-8 часам после добавки абсцизовой кислоты активность ферментов (за исключением глюкозидазы) значительно повысилась и к 9 часам достигла максимума. Активность глюкозидазы слабо повышалась к 8 часам, а затем наблюдалось 2-х кратное снижение активности к суткам действия АБК. Активность остальных ферментов к этому времени хотя и снижалась, но оставалась на достаточно высоком уровне. На вторые сутки эксперимента обнаружился второй пик активности.
Интересно, что наблюдаемая активация ферментов продолжалась в течение суток, как и в случае действия низкой положительной температуры (Заботин и др., 1995). Следует также отметить, что активация гликозидаз под действием АБК предшествует повышению устойчивости проростков (рис.10).
При действии собственно закаливающей температуры, активация гликозидаз как в растворимой, так и ионно-связанной фракциях наблюдалась через 3-6 часов, что предшествовало уменьшению количества полисахаридных фракций, которое отмечалось после 6 часов температурного воздействия. При сравнении содержания матриксных полисахаридов и их синтеза с изменением гликозидазной активности, был сделан вывод, что, уменьшение количества полисахаридов является результатом как уменьшения их образования, так и увеличения их деградации. Через сутки действия низкой температуры происходило значительное повышение включения радиоактивной метки во фракции гемицеллюлоз, тогда как включение в целлюлозу оставалось на низком уровне, а в пектинах - восстанавливалось до исходного уровня (Заботин и др., 1998).
Изменение активности гликозидаз и содержания нецеллюлозных фракций полисахаридов клеточной стенки при действии АБК
Поскольку было обнаружено, что абсцизовая кислота способна активировать гликозидазы, возник вопрос о вовлеченности белоксинтезирующего аппарата клетки в регуляцию этого процесса. Это тем более интересно, так как есть данные, что циклогексимид незначительно изменял содержание Сахаров и не влиял на активность инвертазы, т.е. углеводный метаболизм, который обеспечивает клетку криопротекторами, при адаптации активируется непосредственно, независимо от белоксинтезирующего аппарата (Колупаев, Трунова 1992).
При исследовании влияния ЦТ на индуцируемую АБК активацию гли-козидаз, представленную в работе на примере глюкозидазы, были получены следующие результаты. Предварительная обработка ЦТ за 15 часов до внесения АБК как в растворимой, так и в ионно-связанной фракциях (рис.15, 16), снимала эффект гормона. Это свидетельствует о том, что регуляция этих ферментов сопряжена с функционированием белок-синтезирующей системы, а так же позволяет нам сделать вывод о сходстве механизмов регуляции метаболизма клеточной стенки под действием гормона с механизмами регуляции под действием собственно температуры. Так, на корнях проростков озимой пшеницы было показано, что циклогексимид полностью подавлял фазу активации гликозидаз клеточной стенки, наблюдавшуюся в первые часы закаливания низкой температурой (Барышева и др., 1999). Влияние ингибито 79 ров синтеза белка на активность ферментов может проявляться либо непосредственно, путем снижения концентрации фермента и его суммарной активности в пробе, либо через влияние на экспрессию белковых эффекторов, регулирующих, например, ферментативную активность. Как было предположено Барышевой с коллегами (1999), подавление циклогексимидом термоин-дуцированного адаптивного "всплеска" активности гликозидаз происходит, по-видимому, через блокирование экспрессии генов, ответственных за образование регуляторных молекул, которые в норме ответственны за активацию гликозидаз клеточной стенки.
В этой же работе был обнаружен интересный факт - за время предобработки этим ингибитором при комнатной температуре повышалась активность гликозидаз, что так же наблюдалось в момент внесения АБК в обеих фракциях (рис. 15,16). Это позволяет детальнее интерпретировать сделанные в работе выводы. В литературе имеются данные, показывающие, что ингибиторы белкового синтеза существенно влияют на накопление некоторых классов м-РНК в эукариотических клетках (Bostock et al., 1999; Shen et al., 2001). Так, например, при исследовании регуляции экспрессии холодо-индуцируемого гена репы rdlip, являющегося фактором транскрипции, было обнаружено, что его м-РНК накапливалась при низкой (0,1 мкМ) или высокой (100 мкМ) концентрации ЦТ (Ito et al., 1999) без воздействия температуры. Следует отметить, что этот ген индуцировался также АБК и солевым стрессом. Индукция гена ячменя HVA22 (его гомологи найдены во многих видах злаковых, Arabidopsis, дрожжах и т.д.) обнаруживалась как под действием АБК, так и ЦТ, а при их совместном действии наблюдался синергический эффект на экспрессию (Shen et al., 2001).
Такой процесс, когда накопление некоторых транскриптов усилено или пролонгировано ингибиторами, например, циклогексимидом, называется супериндукцией. Есть несколько предположений для обяснения эффекта супериндукции транскрипционных факторов: 1) происходит ингибирование синтеза лабильных репрессоров, что действуют отрицательно на разные су-периндуцибельные гены, 2) замедление транскрипции и стабилизация РНК благодаря прекращению их трансляции или 3) может наблюдаться положительное действие как агониста сигналов, стимулирующих фосфорилирование факторов транскрипции (Shen et al., 2001). Возможно, что ингибиторы белкового синтеза могут блокировать лабильные факторы, которые в норме необходимы для деградации РНК определенных генов. В работе Mahadevan, Edwards (1991) высказано предположение, что ингибиторы белкового синтеза положительно активируют транскрипцию через присущую им способность взаимодействовать с молекулами внутриклеточных сигналов. Действительно, обнаружен ряд холодо-индуцируемых генов, в том числе и кальций-зависимой протеинкиназы, которые индуцировались низкими концентрациями ЦТ (Berberich, Kusano, 1997).
Исходя из данных представленных здесь экспериментов, пока сложно определить точный механизм, с помощью которого ингибитор может акти-вировть гликозидазы. Характерно, что как в случае индукции АБК (рис. 15,16), равно как и температурой (Барышева и др., 1999), циклогексимид подавлял именно фазу активации ферментов.
