Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Холодовое повреждение теплолюбивых растений 10
1.2. Окислительный стресс у растений 24
1.3. Роль липидов и десатураз в устойчивости растений к низкотемпературному стрессу 35
1.4. Трансгенные растения, как модель для изучения физиологических и молекулярных основ устойчивости к гипотермии 43
Глава 2. Объекты и методы исследования 48
2.1. Объекты исследования 48
2.2. Определение количества липидов и их жирнокислотного состава 51
2.3. Определение проницаемости мембран, как показателя устойчивости растений к гипотермии 54
2.4. Определение интенсивности перекисного окисления липидов 55
2.5. Определение количества супероксидного анион-радикала 56
2.6. Определение активности супероксиддисмутазы 57
2.7. Определение количества перекиси водорода 58
2.8. Измерение активности мембрансвязанной формы фермента пероксидазы 59
2.9. Определение активности каталазы 60
2.10. Методы исследования ультраструктуры клеток и хлоропластов 61
Глава 3. Результаты и обсуяедение 63
3.1. Влияние гена desC Д9-ацил-липидной десатуразы из цианобактерии Synechococcus vulcanus на содержание и жирнокислотный состав липидов мембран растений табака 63
3.2. Изменения устойчивости растений табака к гипотермии под влиянием встроенного гена desC А9-ацил-липидной десатуразы ..72
3.3. Влияние пониженной температуры на рост растений табака, трансформированных геном desC А9-ацил-липидной десатуразы.84
3.4. Изменения ультраструктурной организации хлоропластов при адаптации к гипотермии растений табака, трансформированных
геном desC А9-ацил-липидной десатуразы 89
3.5. Уровень окислительного стресса при охлаждении растений табака, трансформированных геном desC А9-ацил-липидной десатуразы 99
3.6. Влияние охлаждения на активность антиоксидантных ферментов растений табака, трансформированных геном А9-ацил-липидной десатуразы 106
3.6.1. Изменения активности супероксиддисмутазы в процессе охлаждения контрольных и трансформированных растений табака 106
3.6.2. Влияние охлаждения на содержание перекиси водорода и активность пероксидазы в листьях растений табака, трансформированных геном Д9-ацил-липидной десатуразы 111
3.6.3 Изменения активности каталазы растений табака, трансформированных геном А9-ацил-липидной десатуразы, при гипотермии 117
Заключение 121
Выводы 126
Литература 129
- Трансгенные растения, как модель для изучения физиологических и молекулярных основ устойчивости к гипотермии
- Определение количества липидов и их жирнокислотного состава
- Изменения устойчивости растений табака к гипотермии под влиянием встроенного гена desC А9-ацил-липидной десатуразы
- Уровень окислительного стресса при охлаждении растений табака, трансформированных геном desC А9-ацил-липидной десатуразы
Введение к работе
Температура является одним из наиболее значимых лимитирующих факторов среды, определяющих географическое распространение и продуктивность растений. По реакции на температуру выделяют следующие группы растений:
1) Морозоустойчивые виды, способные выживать после действия отрицательной температуры с образованием межклеточного и внеорганного льда (древесные, кустарники, озимые культуры и др.).
2) Холодоустойчивые растения, способные развивать резистентность к пониженным положительным температурам, но погибают от образования льда в тканях (картофель, горох и др.).
3) Теплолюбивые виды, которые повреждаются при снижении температуры ниже 8-10С (огурец, рис, табак и др.).
Будучи пойкилотермными организмами, растения зависят от температуры окружающей среды и в большинстве случаев не способны избегать действия экстремальных температур. Важность проблемы холодоустойчивости растений обусловлена еще и тем, что на 64% территории суши растения испытывают губительное действие низких температур. Тепловой режим среды обитания оказывает существенное влияние на интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов, рост и продуктивность растений (Туманов, 1979; Levitt, 1980; Дроздов и др., 1984; Трунова, 1984). Поскольку у растений отсутствуют механизмы регуляции температуры, они вынуждены постоянно адаптироваться к колебаниям температуры внешней среды. В последнее время глобальное изменение климата на планете сопровождается усиливающейся нестабильностью, выражающейся, в том числе, и в резких перепадах температуры. В связи с этим возрастает актуальность проблемы устойчивости растений к гипотермии, поскольку продуктивность многих сельскохозяйственных культур связана с формированием этого свойства.
Несмотря на то, что вторая половина XX века увенчалась крупными достижениями в области исследования физиолого-биохимических основ устойчивости растений к гипотермии, единая теория адаптации к низкой положительной температуре до сих пор не создана.
В отличие от морозостойких, теплолюбивые растения не только не способны выживать после действия отрицательных температур, но повреждаются даже низкими положительными температурами (Туманов, 1979; Levitt, 1980; Дроздов и др., 1984).
Наиболее широкое распространение в литературе получило представление о том, что основной причиной повреждения и гибели теплолюбивых растений при пониженных температурах является недостаточно высокая степень ненасыщенности жирных кислот (ЖК) мембранных липидов и, как результат этого, неспособность предотвратить их фазовый переход из жидкокристаллического состояния в твердый гель (Lyons, 1973; Хохлова, 1975; Кириченко и др., 1978; Thompson et al., 1989; Лось, 2005). У морозостойких растений в период низкотемпературной адаптации синтезируются липиды, обогащенные линоленовой кислотой, которые повышают текучесть мембран (Vereshchagin et al., 1990). У холодостойких растений при низкой положительной температуре также не наблюдается фазовых переходов липидов благодаря повышению в них уровня ненасыщенности ЖК, в результате чего клеточные мембраны остаются функционально активными в широком диапазоне низких положительных температур (Хохлова, 1975; Кириченко и др., 1978; Новицкая и др., 1999).
В то же время, несмотря на установленную корреляцию содержания ненасыщенных ЖК в мембранных липидах с устойчивостью к низким температурам, до сих пор мало данных, касающихся теплолюбивых растений, в особенности, участия десатураз - ферментов, осуществляющих образование двойных связей в насыщенных жирных кислотах.
В связи с низкотемпературным стрессом особый интерес представляет А-9 ацил-липидная десатураза, вызывающая образование двойной связи в А9-положении стеарата (18:0) с образованием олеиновой кислоты (18:1), которая, в свою очередь, служит субстратом для образования ди- и триеновых (линолевой и линоленовой) ЖК, что, в конечном итоге, приводит к изменению структурного и функционального состояния мембран растения (Los, Murata, 1998; Лось, 2005). Исходя из этого, можно предположить, что введение в геном растения табака дополнительного гена desC А9-ацил-липидной десатуразы приведет к повышению содержания ненасыщенных ЖК в мембранных липидах.
В связи с этим, цель настоящей работы состояла в изучении роли А9-ацил-липидной десатуразы в липидном метаболизме и формировании устойчивости теплолюбивых растений к гипотермии и окислительному стрессу на примере табака, трансформированного геном desC из Synechococcus vulcanus. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать ферментативную активность десатуразы по изменению содержания липидов и составу жирных кислот и выявить по этим показателям различия между контрольными и трансформированными линиями табака.
Выявить различия в устойчивости разных линий трансгенных и контрольных растений табака к гипотермии путем определения ионной проницаемости мембран (по выходу электролитов) и установить ее связь с содержанием липидов и входящих в их состав ненасыщенных жирных кислот.
Определить различия в устойчивости трансформированных и контрольных растений по изменению ростовой реакции и ультраструктуры клеток в условиях пониженной температуры.
Изучить изменения в устойчивости растений к окислительному стрессу под влиянием встроенного гена А9-ацил-липидной десатуразы, используя метод определения перекисного окисления липидов.
Изучить вызванные действием низкой температуры изменения в содержании супероксидного анион-радикала и перекиси водорода у трансформированных и контрольных растений и выявить влияние введенного гена desC А9-ацил-липидной десатуразы на эти показатели.
Исследовать систему антиоксидантной защиты в динамике охлаждения контрольных и трансформированных растений путем изучения активности супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы.
Трансгенные растения, как модель для изучения физиологических и молекулярных основ устойчивости к гипотермии
При действии низких положительных температур на холодостойкие и теплолюбивые растения, прежде всего, повреждаются липидные компоненты мембран. В 1973 году Лайонсом (Lyons, 1973) была предложена мембранная теория устойчивости, в соответствии с которой гибель растений при низких температурах и адаптация к ним связана с жидкостными свойствами липидных бислоев внутриклеточных мембран. Было отмечено, что первичная роль в способности растений к перенесению холода принадлежит мембранным липидам, в частности, их свойству сохранять жидко-кристаллическое состояние мембран и предохранять их от перехода в твердо-гелевую структуру (Lyons, 1973; Lee, 1977). Известно, что фазовые переходы даже малых фракций мембранных липидов, приводящие к образованию твердофазных доменов, вызывают нарушения клеточных мембран и повреждение клеток (Thompson, 1989). С фазовым переходом связано фазовое разделение компонентов мембран, характеризующееся появлением в плоскости бислоя участков гелевидных липидов, частично или полностью свободных от белков. Текучесть мембраны определяется рядом физических и химических факторов, и поддержание ее имеет большое значение для ее функциональной активности (Кириченко, 1984; Piatt-Aloia, Thomson, 1987).
Повышение вязкости мембран при низких температурах приводит к ослаблению взаимодействий «белок-липид» и усилению взаимодействий «белок-водная фаза» (Lenaz, Castelli, 1985). В результате в липидном слое мембраны происходит вертикальная миграция белков. При этом периферические белки могут окончательно утратить связь с мембраной, переходя в окружающую водную фазу. Вертикальная миграция белков представляет собой своеобразный буферный механизм, позволяющий быстро уменьшить вязкостность мембраны за счет снижения доли поверхности бислоя, занятого белками. Следовательно, повышение отношения содержания липиды/белки в мембранах при гипотермии будет оказывать положительное влияние на текучесть мембран (Новицкая и др., 1999). Поскольку этот признак является одним из важных адаптационных механизмов, обеспечивающих выживание организмов в условиях гипотермии, начиная с 70-х годов прошлого столетия, было проведено большое количество исследований, в которых показано, что при адаптации повышается общее содержание мембранных (полярных) липидов. В частности, интенсивно синтезируются фосфолипиды, которые входят в состав всех мембран клеточных структур (Панкратова, Хохлова, 1977). К ним относятся фосфатидилхолин, участвующий в образовании ламмелярной структуры мембран. Преимущественный синтез этих липидных форм представляет собой один из механизмов, позволяющих избежать перехода липидного бислоя в отдельных участках мембраны в инвертированную гексагональную фазу. Полярная головка фосфатидилхолина обеспечивает ему более низкую температуру фазового перехода по сравнению с фосфатидилэтаноамином (Kotyk et al., 1988). Более того, преимущественное включение в мембрану сильно гидратированного фосфатидилхолина способствует избеганию фазового перехода при сильной дегидратации внутриклеточных мембран (Uemura, Steponkus, 1997). Так, мембраны микросом, изолированные из закаленных тканей листьев рапса, характеризовались более выраженными жидкостными свойствами и имели более высокое содержание фосфолипидов (Itzhaki et al., 1991). Уже после 6-часовой акклиматизации арабидопсиса к холоду в плазмалемме было отмечено увеличение содержания фосфо- и гликолипидов (Ristic et al., 1993). Увеличивается также содержание ди- и моно- галактолипидов, локализованных в мембранах хлоропластов (Нюппиева и др., 1980; Джанумов и др., 1992; Новицкая, Трунова, 2000).
Показано, что при адаптации теплолюбивых растений огурца отношение содержания полярных липидов к белкам возрастает (Новицкая и др., 1999). В тилакоидах хлоропластов дикого вида томата, более устойчивого к холоду по сравнению с культурным, также обнаружено более высокое отношение липиды/белки (Walker et al, 1991).
Установлено, что отношение фосфолипидов к стеринам в плазмалемме в процессе адаптации также увеличивается. Поскольку только плазменная мембрана содержит стерины и имеет большую жесткость, чем другие мембраны клетки, повышение содержания фосфолипидов к стеринам имеет большое значение в период адаптации к гипотермии (Van Deenen, 1972).
Особенно важная роль в процессе адаптации к низкотемпературному воздействию отводится повышению содержания ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов в результате десатурации насыщенных, которую осуществляют ацил-липидные десатуразы (Лось, 1997). Давно известно, что способность клеток растений адаптироваться к холоду в значительной степени определяется их возможностью синтезировать ненасыщенные ЖК, повышающие жидкостность липидного бислоя и предотвращающие фазовое разделение липидов (Белоус, Бондаренко, 1982; Хохлова, 1975).
Такой способ сохранения текучести мембран был обнаружен у бактерий, растений и животных (Хочачка, Сомеро, 1982), и важную роль в этом процессе играют десатуразы, которые вызывают образование двойных связей в жирных кислотах и тем самым способствуют повышению устойчивости мембран к действию низкой температуры (Лось, 1997).
Десатуразы ЖК высших растений можно разделить на два типа в зависимости от переносчика субстрата: растворимые ацил-АПБ-десатуразы используют ЖК, связанные с ацил-переносящим белком (АПБ), и мембрансвязанные ацил-липидные десатуразы, которые используют в качестве субстрата жирные кислоты, находящиеся в составе мембранных липидов (Los, Murata, 1998) .
Ранее считалось, что клетки растений имеют только растворимые ацил-АПБ-десатуразы, которые отвечают за образование первой двойной связи в положении А9, а затем уже ацил-липидные десатуразы образуют дополнительные двойные связи. Однако недавно обнаружено новое семейство мембрансвязанных А9-ацил-липидных-десатураз, представители которого гомологичны ацил-липидным А9-десатуразам цианобактерий (Fukuchi-Mizutani, et al., 1992; Fukuchi-Mizutani, et al., 1995).
Определение количества липидов и их жирнокислотного состава
Вторая половина XX века увенчалась крупными достижениями в области исследования физиолого-биохимических основ устойчивости растений к гипотермии. Последние десятилетия были посвящены выяснению молекулярных основ низкотемпературной адаптации. Этому способствовало применение методов молекулярной биологии и генетики.
Для изучения проблемы холодоустойчивости в последнее время широко применяют метод генетической инженерии, представляющий возможность получить трансгенные формы, экспрессирующие гены различного происхождения.
Использование трансгенных растений является принципиально важным подходом в изучении физиологических и молекулярных основ адаптации, т. к. позволяет путем суперэкспрессии гена (или генов), кодирующего соответствующие белки, выявить их роль в устойчивости к гипотермии. С помощью этих методов были открыты гены, экспрессируемые низкой температурой (сог-гены, cold regulated genes) и кодирующие COR-белки (белки холодового шока). Так, во время холодовой адаптации Arabidopsis thaliana синтезировались регулируемые холодом COR 15 и COR 6.6 кДа полипептиды, кодируемые соответственно сог\5а согб.6 генами. Известно, что COR15 белки локализуется в хлоропластах, a COR6.6 в цитозоле. В присутствии COR15am белка наблюдалось специфическое ультраструктурное изменение, выражающееся в образовании определенной поверхностной морфологии в ламеллярных доменах. Однако, ни COR15am, ни С(Ж6.6-белки не участвуют в специфическом белково-фосфолипидном взаимодействии, изменяющим вызванное дегидратацией состояние фаз фосфолипидных везикул (Webb et al., 1996). Изучая молекулярный механизм экспрессии генов белков холодового шока, было обнаружено, что экспрессия сог\5а. гена связана с суперэкспрессией транскрипционного фактора CBF 1 (CRT/DRE binding factor), эффект которого был оценен путем введения его из арабидопсиса в холодочувствительные растения томата. Они показали, что конститутивная (без действия низкой температуры) экспрессия генов CBF1 в трансгенных растениях томата может эффективно регулировать гены, связанные со стрессовыми ответами. Например, сверхэкспрессия генов CBF1 может индуцировать экспрессию COR генов в растениях томата, что влияет на повышение степени устойчивости трансгенных растений к окислительному стрессу. Это обусловлено экспрессией гена каталазы, приводящей к увеличению каталазной активности и снижению уровня Н2О2 (Hsieh et al., 2002).
Не менее плодотворным было использование трансгенных растений в изучении роли уже известных ферментативных и неферментативных белков в развитии процесса адаптации, конечный вклад которых можно оценить по динамике устойчивости. С этой целью растения трансформировали генами белков, которые по ряду предположений, участвуют в этом процессе.
Так, например, была подтверждена важная роль антиоксидантных ферментов трансгенных растений, обладающих повышенной активностью и более высокой холодоустойчивостью по сравнению с исходными растениями. В одной из работ в теплолюбивые растения были введены гены марганцевой, медно-цинковой, и железной-супероксиддисмутазы (Gupta et al., 1993; Van Camp et al., 1996). Сверхпродукция этих ферментов повышала антиокислительную способность клеток и тем самым защищала от окислительного стресса и стимулировала рост и фотосинтез растений при пониженных температурах.
В настоящее время в литературе имеется достаточно много примеров повышения устойчивости растений к гипотермии при введении чужеродных генов, кодирующих белки, которые участвуют в адаптации к этому стрессу. Более высокую устойчивость к холодовому стрессу проявляли трансгенные растения риса и табака со способностью синтезировать глицинбетаин, а также формы с перенесенными генами ряда других белков (Kim et al., 2001). Экспрессия гена AtCHIP, кодирующего белок убиквитин в растениях арабидопсиса, повышала устойчивость сразу к холодовому и высокотемпературному стрессам, вызванные пониженной и повышенной температурами соответственно (Yan et al., 2003).
Использование трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген дрожжевой инвертазы, явилось новым подходом, позволяющим в условиях in vitro изменять углеводный метаболизм растений и регулировать сам процесс устойчивости к гипотермии (Deryabin et al., 2004). Показано, что введение гена дрожжевой инвертазы, расщепляющей молекулу сахарозы с образованием двух молекул моносахаров, приводила к повышению содержания растворимых форм Сахаров в клетках и устойчивости растений к гипотермии.
Очень важным подходом в изучении механизмов адаптации растений и, в частности, роли десатураз является использование трансгенных растений, экспрессирующих гены десатураз жирных кислот. Способность таких трансгенных растений к адаптации связывается с их способностью к изменению текучести мембран посредством изменения количества ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидпх.
Так, ген А-9 десатуразы из Anacystis nidulans, введеный в растения гороха, повышал холодоустойчивость растений путем образования двойных связей в 18:0 и 16:0 ЖК липидов мембран в положении А-9 (Ishizaki-Nishizawa et al., 1996).
Повышенная холодоустойчивость обнаружена у трансгенных растений табака с введенным геном хлоропластной со-3- десатуразы из Arabidopsis thaliana, превращающая линолевую кислоту в линоленовую в фосфолипидах мембран (Hamada et al., 1998), или А-9-десатуразы из цианобактерии рода Anacystis nidulans, при этом возрастал уровень полиненасыщенных жирных кислот в большинстве мембранных липидов (Kodama et al., 1994). Ненасыщенность жирных кислот фосфатидилглицерина хлоропластов табака и степень его устойчивости к охлаждению повышены трансформацией добавочной ДНК из Arabidopsis thaliana, кодирующей глицерол-3-фосфат-ацилтрансферазу (Murata et al., 1992). Повышение количества триеновых жирных кислот на 10% наблюдалось в листьях табака с введенным геном FAD-7 из Arabidopsis thaliana, кодирующим со-3-десатуразу, ответственную за образование триеновых жирных кислот (Kodama et al., 1994).
Изменения устойчивости растений табака к гипотермии под влиянием встроенного гена desC А9-ацил-липидной десатуразы
Известно, что у теплолюбивых растений липидный состав мембран реагирует на понижение температуры достаточно быстро. В сложной молекуле фосфолипидов все наиболее важные элементы строго детерминированы качественно и количественно. Только жирные кислоты подвержены влиянию и генетического контроля, и условий среды. Обычно, при действии стрессора, в первую очередь, меняется степень ненасыщенности мембранных липидов (отношение содержания ненасыщенных ЖК к уровню насыщенных). У морозостойких растений в период низкотемпературной адаптации синтезируются липиды, обогащенные линоленовой кислотой, что предотвращает их переход из жидкокристаллической фазы в твердый гель.
Еще в 1979 году Christiansen выдвинул предположение о связи между ненасыщенностыо жирных кислот и степенью холодоустойчивости теплолюбивых растений. Было показано, что в проростках хлопчатника при закаливании количество линоленовой кислоты в полярных липидах увеличивается вместе с холодоустойчивостью. Затем Raison с сотрудниками в 1980 показал, что митохондриальные липиды у устойчивых к холоду растений содержат большее количество ненасыщенных жирных кислот по сравнению с теплолюбивыми видами как, например, хлопчатник, липиды митохондрий которого содержали больше насыщенных жирных кислот.
Такая способность клеток растений к адаптации путем изменения текучести мембран посредством увеличения количества ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах связывается с работой десатураз жирных кислот - ферментов, отвечающих за образование двойных связей в их цепях.
Работа десатураз и изменение степени ненасыщенности жирных кислот при понижении температуры были детально изучены на примере цианобактерий Anabaena variabilis М-3. Показано, что при снижении температуры с 38 до 22С содержание 18:1 снизилось с 20 до 10%, в то время как содержание линоленовой кислоты (18:3) возросло с 0,1 - 0,5% до 25 - 30% за 48 часов. Содержание линолевой (18:2) возростало в первые 6-10 часов воздействия низкой температуры, а затем начало снижаться, поскольку 18:2 служит субстратом для соЗ-десатуразы, превращающей линолевую в ос-линоленовую кислоту (Sato, Murata, 1980).
В Synechocystis sp. РСС 6803 снижение температуры с 34 до 22С также приводило к снижению содержания моно- и диеновых жирных кислот и к накоплению терминальных продуктов десатурации - а 18: 3 А9 ,2 ы3 и 18:4 А6 9 12 "3 (Wada, Murata, 1990).
В то же время, несмотря на установленную корреляцию содержания ненасыщенных ЖК в мембранных липидах с устойчивостью к низким температурам, до сих пор мало данных, подтверждающих участие десатураз в формировании устойчивости теплолюбивых растений к холоду, в связи с чем нами были проведены исследования участия А9-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости к окислительному стрессу и гипотермии, на примере теплолюбивых растений табака, трансформированных геном desC А9 ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus.
Прежде всего, в наших исследованиях следовало подтвердить ферментативную активность десатуразы трансформированных растений табака путем анализа содержания липидов и входящих в их состав жирных кислот.
Как видно из рисунка 6, по абсолютному содержанию мембранных липидов в листьях исследуемые линии трансформированных растений табака можно разделить на две группы.
К первой группе отнесены растения с более высоким, по сравнению с контролем, содержанием липидов (линии desl, des2, des7, deslO), а ко второй группе растения с более низким содержанием (линии des3 и des8). Контроль занимал промежуточное положение. При этом содержание липидов в первой группе растений было почти в 2 раза выше, чем во второй, и составляло среди линий в среднем 8.94 мкМ/г сырой массы. Во второй группе исследуемых линий (линии des3 и des8) содержание липидов было даже ниже контрольных растений почти на 20 % и составляло в среднем 4.63 мкМ/г сырой массы. Наряду с общим содержанием липидов, определяли состав входящих в них жирных кислот.
Данные таблицы 1 показывают, что липиды листьев изученных линий и контрольных растений включали 7-12 индивидуальных видов Сіз -Сго ЖК, причем наибольшим их разнообразием отличались линии des8 и deslO. Главными ЖК липидов контрольной линии были пальмитиновая (16:0), и линоленовая (18:3), в значительном количестве содержались также пальмитолеиновая (16:1), стеариновая (18:0) и линолевая (18:2) кислоты. Что касается трансгенных растений, то и по данному показателю изученные линии также четко подразделялись на две группы. Линии, принадлежащие к группе 1 (desl, des2, des7, deslO), отличались от контроля пониженным содержанием 16:0 и повышенным уровнем 18:3, а линии группы 2 (des3 и des8) - наоборот, более высоким содержанием 16:0 и более низким - 18:3. Кроме того, линии группы 1 характеризовались несколько повышенным, а линии группы 2 - пониженным уровнем олеиновой кислоты, в то время как для стеариновой кислоты наблюдалась обратная картина (табл.1). Столь существенные различия в жирнокислотном составе липидов обусловили и разный уровень их ненасыщенности в листьях разных линий. Так, линии группы 1 по данному показателю на 18-32% превосходили контрольный вариант, а линии группы 2 - на 19-24% уступали ему (рис.7), что подтвердило разделение линий трансформированного табака на 2 группы.
Уровень окислительного стресса при охлаждении растений табака, трансформированных геном desC А9-ацил-липидной десатуразы
Как было отмечено ранее, выдерживание теплолюбивых растений при пониженных температурах приводит к появлению многочисленных симптомов повреждений, величина которых является функцией температуры, длительности выдерживания в холодных условиях, вида растения и физиологического состояния растительного материала (Morris, 1982). При действии гипотермии прежде всего повышается проницаемость клеточных мембран, происходит деполяризация мембранного потенциала плазмалеммы, рН (кислотность) цитоплазмы сдвигается в кислую сторону, увеличивается уровень перекисного окисления липидов.
Новые подходы к изучению роли генома в холодовом повреждении и устойчивости основаны на использовании мутантов и трансгенных растений (Bartels, Nelson, 1994). Так, показано резкое изменение степени чувствительности к охлаждению у растений табака при введении разных генов из Arabidopsis thaliana (Murata et al., 1992; Kodamaetal., 1994).
Анализ литературы показывает, что растения и цианобактерии способны десатурировать жирные кислоты мембранных липидов в ответ на изменения температуры окружающей среды. Ранее было выявлено, что Д9-ацил-липидная десатураза из клеток S. vulcanus, оптимальная температура роста которых составляет 55С, сохраняла активность и в условиях умеренных температур (30 и 20С) (Kiseleva et al., 1999; Kiseleva et al., 2000). На основании наших данных анализа состава и содержания ЖК листьев табака, трансформированного геном desC А9-ацил-липидной десатуразы, можно предположить, что этот фермент, проявит активность и при более низкой температуре и тем самым повысит устойчивость растений к гипотермии.
Для изучения изменений холодоустойчивости растений табака под влиянием встроенного гена А9-ацил-липидной десатуразы были использованы два метода: 1) метод определения степени проницаемости клеточных мембран по электропроводности водных экстрактов из тканей растений (Hepburn et al., 1986) и 2) метод определения интенсивности перекисного окисления липидов по накоплению продукта окисления - малонового диальдегида (Жиров и др., 1982). Первый метод характеризует изменения при охлаждении барьерных функций клеточных мембран, второй метод позволяет фиксировать процессы перекисного окисления липидов, которые приводят к разрушению полиненасыщенных жирных кислот и появлению гидропероксидных группировок в составе гидрофобной зоны мембран. Оба метода позволяют выявить различия в степени повреждения трансформированных и контрольных растений под действием низких температур.
Определение устойчивости контрольных и трансгенных растений табака по выходу электролитов. Данный метод позволяет выявить нарушение структуры клеточных мембран при охлаждении, следствием чего является повышение их проницаемости, которое легко регистрируется в виде резкого увеличения скорости утечки растворенных веществ из тканей растений. Основную массу этих веществ представляют ионы, особенно ионы К+, которые составляют до 80% всех вытекающих электролитов. В экстрактах присутствуют также аминокислоты и другие органические соединения (Guinn, 1971). Показано, что выход ионов зависит от температуры охлаждения и продолжительности ее действия (Wright, Simon, 1973). Выход электролитов из клетки может быть обратимым и необратимым в зависимости от интенсивности охлаждения.
Увеличение выхода электролитов может происходить как за счет повышения пассивной проницаемости мембран в результате возникновения пор или разрывов мембран или вследствие модификации мембранных каналов меняющимся липидным микроокружением, а также в результате подавления активного транспорта ионов в клетку с одновременным усилением их выхода из клетки через ионные каналы (Simon, 1974). Таким образом, повышенный выход растворенных веществ является типичным элементом реакции клетки на повреждающее воздействие низких температур, а степень его усиления определяет чувствительность растения к гипотермии (Приходько, 1977).
Известно, что пониженные температуры, увеличивая проницаемость клеточных мембран, главным образом, плазмалеммы, вызывают интенсивный выход ионов во время охлаждения из клеток в клеточные стенки и межклетники (апопласт), откуда электролиты при последующей инфильтрации и встряхивании легко вымываются в воду. Это позволяет определять изменение проницаемости клеточных мембран после охлаждения интактных растений табака, что и было использовано в нашей работе.
При анализе экспериментальных данных было выявлено, что при оптимальной температуре выращивания 22С (без охлаждения) трансгенные и контрольные растения по коэффициенту повреждения отличались незначительно (табл.2), что свидетельствует об одинаковом неповрежденном состоянии мембран данных растений. Из рисунка 9 видно, что охлаждение увеличивало проницаемость мембран всех вариантов. Причем наибольшая степень повреждения наблюдалась у растений линий второй группы - des3 и des8, что указывает на индуцированное Холодовым повреждением повышение проницаемости клеток и более высокую их чувствительность к действию низких температур. В то же время у растений первой группы (desl, des2, des7 и deslO) выход электролитов хотя и увеличивался, но в меньшей степени по сравнению с неохлажденными растениями (табл. 2) и охлажденным контролем.
