Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1. Осмотическая водная проницаемость биологических мембран 7
1.1 Определение осмотической водной проницаемости мембран ...7
1.2 История открытия аквапоринов 9
1.3 Оценка осмотической водной проницаемости мембран 10
1.4 Осмотическая водная проницаемость липидного бислоя 11
1.5 Структура аквапоринов 13
1.6 Функции аквапоринов 17
1.7 Номенклатура аквапоринов растений 18
1.8 Регуляция осмотической водной проницаемости мембран 23
2. Редокс-регуляция и окислительный стресс 29
2.1 Окислительный стресс в растениях 29
2.2 Оксидазная активность плазмалеммы и НАДФН-оксидаза 31
2.3 Химия редокс-сигналинга-химия тиоловых групп цистеинов...ЗЗ
2.4 Аквапорины, как белки, содержащие цистеины, и ингибирова-ние их активности соединениями ртути 35
2.5 Растения и низкотемпературный стресс 37
Глава II. Материалы и методы исследования 39
Глава III. Результаты и обсуждение 48
1. Осмотическая водная проницаемость плазмалеммы корней и побегов 7-дневных этиолированных проростков гороха 48
2. Влияние редокс-модификаторов SH-групп на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы клеток корней этиолированных проростков гороха 60
3. Осмотическая водная проницаемость и содержание аквапоринов РІР-типа в плазмалемме побегов проростков гороха, выращенных при постоянном освещении 64
4. Влияние выращивания растений при низкой положительной температуре на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы корней гороха и содержание PIP-аквапоринов 69
5. НАДФН-оксидазная активность плазмалеммы 75
6. Роль дефосфорилирования в регуляции осмотической водной проницаемости плазмалеммы 80
Заключение 84
Выводы 86
Список литературы 88
- Определение осмотической водной проницаемости мембран
- Регуляция осмотической водной проницаемости мембран
- Влияние редокс-модификаторов SH-групп на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы клеток корней этиолированных проростков гороха
- Влияние выращивания растений при низкой положительной температуре на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы корней гороха и содержание PIP-аквапоринов
Введение к работе
Исследование водного обмена в растениях привело к формированию композитной модели транспорта воды по тканям растения, в основу которой положено существование двух путей ее переноса, различающихся сопротивлением потоку (Steudle, 1994). Первый - внеклеточный, или апопластный, по которому поглощенная корнем вода диффундирует по межклетникам и клеточным стенкам, встречая на своем пути незначительное сопротивление. Второй - межклеточный, включает перенос воды через мембраны и плазмодесмы живых клеток. Трансмембранный путь, по сравнению с другими, характеризуется высоким сопротивлением водному потоку. Основной его характеристикой является величина осмотической водной проницаемости мембран. Она отражает интенсивность совокупного потока воды через липидный матрикс мембран и аквапорины - белки, функционирующие как водные каналы. Присутствие в мембранах аквапоринов позволяет рассматривать трансмембранный путь как регулируемое русло транспорта воды в растении, роль и вклад которого в общий поток возрастает при изменении условий окружающей среды (Steudle & Henzler, 1995; Maurel, 1997).
Молекулярная организация аквапоринов допускает множество способов регулирования их активности. Получен ряд доказательств в пользу того, что фосфорилирование является универсальным механизмом регуляции большинства аквапоринов растений (Maurel et al., 1995; Johansson et al., 1998; Guenther et al., 2003). Показано также, что существуют другие возможности посттрансляционной модификации этих белков через их метилирование, гликозилирование, протонирование и формирование гетероолигомеров (Verkman and Mitra, 2000; Luu and Maurel, 2005). В последнее время заметен интерес к выяснению роли цистеиновых остатков в аквапоринах. Причиной такого внимания является эффективное ингибирование аквапорин-опосредованной водной проницаемости мембран соединениями ртути и серебра (Niemietz and Tyerman, 2002), а также данные анализа структуры тетрамера аквапорина SoPIP2;l, согласно которым аквапорины PIP-типа содержат 2 пары высококонсервативных цистеинов, локализованных в различных участках петель А и С (Kukulski et al., 2005). Высокая консервативность этих остатков позволила предположить их регуляторную функцию. Поскольку цистеин обладает редокс-активностью (Gilles et al., 2003; Hancock et al., 2006), можно полагать, что редокс-состояние SH-групп в аквапоринах контролируется клеткой, и изменение концентрации эндогенных редокс-регуляторов в цитозоле или апопласте влияет на активность аквапоринов в плазмалемме. Такая возможность экспериментально не проверялась. Необходимым этапом в исследовании механизмов регулирования осмотической водной проницаемости является выяснение того, обладают ли аквапорины чувствительностью к изменениям редокс-условий среды. Плазматическая мембрана, которая находится на границе раздела сред с высоким и низким восстановительным потенциалом, может быть сенсором изменений этого параметра как в апопласте, так и в цитозоле. Таким образом, многие цистеин-содержащие белки, в том числе аквапорины, могут быть мишенями для эндогенных систем редокс-регуляции.
Цель работы
Основной целью исследования являлось выяснение роли дитиол-дисульфидных переходов в мембранных белках, в том числе аквапоринах, в регулировании осмотической водной проницаемости плазмалеммы.
Задачи
1) Из корней и побегов 7-дневных проростков гороха, выращенных в темноте или на свету в оптимальных условиях или подвергнутых кратковременному охлаждению, выделить плазматические мембраны с измененным балансом окисленных и восстановленных тиоловых групп.
2) Сравнить осмотическую водную проницаемость этих мембран путем измерения кинетики осмотического сжатия везикул с применением метода остановленного потока.
3) Определить методом вестерн-блот анализа содержание аквапоринов Р1Р-типа в препаратах получаемых мембран. 4) Исследовать влияние низкой положительной температуры на фазовое состояние липидного матрикса плазмалеммы на основе оценки анизотропии флуоресценции дифенилгексатриена.
5) Провести сравнительное определение содержания тиоловых групп в мембранных препаратах при помощи флуоресцентного красителя монобромобимана.
6) Проанализировать возможность активации НАДФН-оксидазной системы плазмалеммы при действии низкой положительной температуры на проростки.
7) Оценить влияние ингибиторов протеиновых фосфатаз серин-треонинового и тирозинового типов на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы.
Определение осмотической водной проницаемости мембран
Растения, как и все живые организмы, не могут существовать без воды. Вода играет исключительную роль в жизни растений, составляя в среднем 80-90 % их массы. Растущие растения постоянно поглощают и теряют воду. Движение воды происходит непрерывным потоком из почвы через корни и стебли к листьям и затем через устьица в окружающую атмосферу (Maurel and Chrispeels, 2001). Перенос воды на дальние дистанции в растении осуществляется по сосудистым тканям: ксилеме и флоэме, по которым вода транспортируется потоком большого объема, и мембранные барьеры для такого транспорта в большинстве случаев не играют существенной роли. На близкие расстояния вода движется по апопластному (через межклеточное пространство), симпластному (через плазмадесмы, где вода идет по непрерывному цитоплазматическому пути), и трансмембранному путям (Steudle, 1994). Силой, которая движет потоком воды на любом отрезке пути, является градиент водного потенциала (A F) (1) между его противоположными концами: AT = T2,(1X где Ч? = (Mw - Hw)/Vw = Р - я (2) и [С - химический потенциал воды в стандартных условиях, щ - химический потенциал воды в данных условиях, Vw - парциальный молярный объем воды [18 см3/моль], Р - гидростатическое давление в водном растворе, избыточное по отношению к окружающему атмосферному давлению, ж - осмотическое давление (Нобел, 1973).
Движение воды в клетку или из нее, а также в разные ее компартменты, осуществляется через полупроницаемые клеточные мембраны. В отсутствии градиента водного потенциала равные потоки воды проходят через мембраны как в одном, так и в другом направлении. Однако, когда водный потенциал в клетке отличается от водного потенциала снаружи, вода уже больше не находится в состоянии равновесия, и можно ожидать движения воды в сторону области с более низким потенциалом. В этом случае объем потока воды Jw (3), протекающий через единицу площади мембраны, пропорционален разности водных потенциалов по обе стороны мембраны и коэффициенту проводимости для воды Lw, который в экспериментах часто совпадает с Lp (4): Jw=Iy А (3)и LP " (PosVw)/(R) (4), где Lp - коэффициент гидравлической проводимости [см-с -МПа"1], Pos -коэффициент осмотической водной проницаемости [см-с 1], R - универсальная газовая постоянная [8.31 Дж-моль -К"1], Т - температура [К].
Таким образом, объемный поток воды через всю площадь мембраны (рис.1) определяется формулой: Jw = Pos S-Vw [(Св - СІ,) - Op(Cp2 - Ср,) + (Р, - P2)/RT] (5), где S - площадь поверхности мембраны [см2], ор - коэффициент отражения проникающего растворенного вещества, С-а и Сц - молярность непроникающих растворов по обе стороны мембраны, Ср2 и Cpi - молярность проникающих растворов по обе стороны мембраны. В формуле (5) наиболее важным коэффициентом является Pos, так как именно коэффициент осмотической водной проницаемости характеризует транспортные свойства мембраны по отношению к воде (Verkman, 2000). Таким образом, объемный поток воды через мембрану зависит не только от величины градиента водного потенциала, но и от проницаемости самой мембраны.
Часто необходимо, чтобы большие потоки растворов проходили через клеточные мембраны как, например, это происходит в случае роста клеток растяжением или при изменении объема замыкающих клеток устьиц, а также в регулировании движения воды от клетки к клетке в зоне поясков Каспари (Steudle, 1994). В таких случаях транспорт воды через липидный бислой клеточных мембран не эффективен. Быстрые трансмембранные потоки воды возможны лишь только в присутствии в мембранах водных каналов.
Регуляция осмотической водной проницаемости мембран
Растениям часто приходится приспосабливать свой водный баланс в ответ на вызванные окружающей средой условия, такие как засуха, засоление почвы, охлаждение, изменения в освещенности, минеральное голодание и кислотность почвы. Поэтому регуляция активности аквапоринов, посредством которой можно изменять трансмембранные потоки воды, является объектом исследования последних лет. Молекулярная и функциональная характеристика аквапоринов позволила обнаружить некоторые механизмы регулирования потоков воды через мембраны. Выделяют три уровня регуляции аквапорин-опосредованной водной проницаемости: регуляция транскрипции и трансляции аквапориновых генов, регуляция везикулярного транспорта и времени жизни аквапоринов, а также регуляция их активности, т.е. gating, что означает открывание и закрывание водной поры белка. Первые способы регулирования водной проницаемости мембраны связаны с изменением содержания аквапоринов.
Изменение содержания аквапоринов осуществляется, в первую очередь, на уровне регуляции транскрипции генов. Ранние работы показали, что транскрипция генов аквапоринов чувствительна к АБК, ГА3 и различным факторам окружающей среды, таким, как пониженная температура, засуха, засоление, свет и т.д. Эти свойства были изучены во многих растениях: в арабидопсисе (Liu et al, 2003; Maathuis et al., 2003; Jang et al., 2004), рисе (Lian et al., 2004), кукурузе (Gaspar et al.,2003; Lopez et al.,2003,2004), ячмене (Katsuhara et al., 2002), редисе (Suga et al., 2003). Взаимосвязь между экспрессией аквапориновых генов и регуляцией водного транспорта на уровне ткани и клетки были рассмотрены в условиях различной оводненности растений. Так, на примере Lotus japonicus, было показано, что гидравлическая проводимость корней коррелирует с изменением содержания мРНК, кодирующей PIP1-гомологи (Henzler et al., 1999). В моторных клетках Samanea saman экспрессия Р1Р2-аквапоринов корреллировала с движениями листа и водной проницаемостью плазмалеммы изолированных протопластов (Moshelion et al., 2002). Транскрипция аквапориновых генов чувствительна к стрессовым воздействиям и изменяется в ответ на холод, засуху, аноксию, повышенную засоленность и другие факторы (Kawasaki et al., 2001; Bray, 2002; Klok et al., 2002; Seki et al., 2002; Maathuis et al., 2003; Bray,2004; Jang et al.,2004; Ueda et al.,2004).
Регуляция мембранного трафика может представлять еще один из основных механизмов для модуляции мембранной водной проводимости в ответ на различные условия окружающей среды (Moshelion et al., 2004). Иммуногистохимические исследования показали, что аквапорины животных AQP1 и AQP2 могут двигаться от внутриклеточных мембран к плазмалемме в ответ на различные стимулы (Marinelli et al., 1999; Brown, 2003). В клетках хрустальной травки было показано, что МсТ1Р1;2 выявляется не только в тонопласте, но и в мембранах эндоплазматического ретикулума (Vera-Estrella et al., 2004). Перераспределение между двумя пулами этого белка было обнаружено после гиперосмотической обработки суспезии клеток манитолом. Аквапорины кукурузы ZmPIPl;2 и ZmPIP2;5 были выявлены не только в плазматической мембране, но и во внутриклеточных мембранах (Chaumont et al.,2000). Было проведено много работ с использованием иммуногистохимического метода, показывающих перераспределение аквапоринов между вакуолярной, плазматической и перебактероидной мембранами (Daniels et al., 1994; Kammerloher et al., 1994;Robinson et al., 1996; Fleurat-Lessard et al., 1997; Chaumont et al., 1998; Kirch et al., 2000; Reisen et al.,2003).
Убиквитин-зависимая деградация белков в протеосомах также может влиять на содержание аквапоринов в мембране. Убиквитинация и последующий протеолиз были показаны для многих мембранных белков животных клеток (Hick, 1999). Такой способ регулирования содержания был продемонстрирован для AQP1 мембраны эритроцитов, когда при гиперосмотическом стрессе протеосомный протеолиз ингибировался и увеличивалось время жизни данного белка (Leitch et al., 2001).
В регуляцию активности растительных аквапоринов вовлечено много различных механизмов. Одним из них является фосфорилирование и дефосфорилирование аквапоринов. Первые данные об изменении активности аквапоринов при их фосфорилировании были получены давно, сразу же после открытия этих белков (Weaver et al., 1991; Weaver and Roberts, 1992; Johanson and Chrispeels, 1992). Как оказалось, фосфорилирование часто происходит по одному или двум сериновым остаткам в N- или С- терминальных доменах. Например, в семенах бобов фосфорилирование PvTIP3;l происходит по Ser7, у SoPIP2;l плазмалеммы листьев шпината по Ser274 и Ser277, а у CmNod26 в корнях сои по Ser262 (Weaver et al., 1991; Weaver and Roberts, 1992; Johnson and Chrispeels, 1992). Для многих ТІР-аквапоринов фосфорилирование Ser23 в N-концевом домене и Ser99 в петле В значительно увеличивало водную проницаемость. Предполагается, что это фосфорилирование осуществляют мембрансвязанные кальций-зависимые протеин киназы. Также было продемонстрировано фосфорилирование PIP-аквапоринов в кукурузе (Chaumont et al., 2000). Было показано увеличение транспортной активности PvTIP3;l, экспрессированного в ооцитах Xenopus, при добавлении цАМФ и цАМФ-зависимой протеин киназы А (Maurel et al., 1995). Уменьшение водной проницаемости наблюдали для SoPIP2;l и CmNod26 при их гетерологичной экспрессии в Xenopus, в присутствии окодаевой кислоты, ингибитора протеинфосфатаз (Johansson et al., 1998; Guenther et al., 2003). Эти исследования указывают на то, что в дефосфорилированном состоянии водная пора аквапорина закрывается.
Регуляция фосфорилирования аквапоринов в растениях происходит согласно стадиям развития и факторам окружающей среды. Например, обнаружено фосфорилирование PvTIP3;l в прорастающих семенах (Johnson and Chrispeels, 1992). В листьях шпината фосфорилирование SoPIP2;l по Ser274 возрастало при увеличении водного потенциала листа и уменьшалось при водном дефиците, возможно, чтобы предотвратить водные потери с поверхности листа (Johanson et al., 1996, 1998). Фосфорилирование PIP2 увеличивалось при осмотическом стрессе, а фосфорилирование NOD26 повышалось при засоленности и в условиях водного дефицита. Фосфорилирование тесно коррелирует с температурной зависимостью открывания и закрывания лепестков тюльпана, наводя на мысль, что эти движения носят аквапорин-опосредованный характер. Например, фосфорилирование и дефосфорилирование регулирует открывание при 20С лепестков тюльпана и их закрывание при 5С (Azad et al., 2004).
Молекулярный механизм открывания водной поры, описанный выше, позволяет объяснить изменение активности аквапорина через перемещение петли D по отношению к гидрофобному каналу после фосфорилирования (Tornroth-Horsefield et al, 2006).
Другим способом регулирования активности аквапоринов является их способность к формированию гетеротетрамеров. Как было указано выше, аквапорины образуют олигомеры, в которых каждый мономер образует свою пору. Предполагается, что водная проницаемость, опосредованная активностью аквапоринов, может быть связана с олигомерным статусом белков. Например, изоформы ZmPIPl;l и ZmPIPl;2 показали низкую аквапориновую активность, когда экспрессировались индивидуально в ооцитах шпорцевой лягушки, и, наоборот, увеличение активности, когда экспрессировались вместе. Также совместная экспрессия ZmPIPl;2 и ZmPIP2;5 приводила к увеличению водной канальной активности, однако не наблюдалось такого эффекта для ZmPIPljl и ZmPIP2;5 (Chaumont, 2005).
Показано, что на активность аквапоринов оказывают влияние значения рН и рСа как на цитоплазматической, так и на внеклеточной поверхности плазмалеммы. Регуляция Са2+ или концентрацией протонов была исследована для аквапоринов животных AQP0, AQP3, AQP6 и для аквапоринов семейства PIP растений (Zeuthen and Klaerke, 1999; Nemeth-Cahalan and Hall,2000; Nemeth-Cahalan et al., 2004). Водная проницаемость плазматической мембраны из суспензии клеток Arabidopsis уменьшалась в присутствии свободного Са и/или при низких значениях рН цитозоля (Gerbeau et al., 2002; Toumaire-Roux et al., 2003). Сайт-направленный мутагенез показал, что важную роль в регуляции активности аквапоринов протонами играют аминокислотные остатки гистидина в молекуле белка. Например, протонирование AtPIP2;2 происходит по His197 в петле D (Toumaire-Roux et al., 2003), тогда как аквапорина AQP0 быка по His40 и His122 в петлях А и С (Nemeth-Cahalan et al., 2004). Трансмембранный транспорт воды блокировался закислением цитозоля и ингибирование Pos в два раза наблюдалось при уменьшении рН от 7.5 до 7.2 (Gerbeau et al.,2002).
Влияние редокс-модификаторов SH-групп на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы клеток корней этиолированных проростков гороха
В настоящее время интенсивно исследуются обратимые переходы дитиол-дисульфид в белках, поскольку такой молекулярной перестройке отводится ведущая роль в системе регулирования физиологических процессов (Hogg, 2003; Ghezzi et al., 2005). Поэтому в последующих экспериментах нами была предпринята попытка подтвердить возможность таких переходов в белках плазмалеммы и оценить их роль в трансмембранном транспорте воды. Для этого исследовали влияние окислителя SH-групп диамида и двух восстановителей -S-S-связей трибутилфосфина и дитиотреитола на процесс осмотического сжатия везикул плазмалеммы корней. SH-реагенты вводили в среду гомогенизации при получении мембран с целью имитировать действие эндогенных редокс-регуляторов.
На рисунке 14 представлены кинетики изменения интенсивности светорассеяния при осмотическом сжатии везикул плазмалеммы, полученной при введении окислителя (кривая 1) и восстановителя трибутилфосфина (кривая 2) в среду гомогенизации. После аппроксимации экспериментальных зависимостей было обнаружено, что константа скорости осмотического сжатия везикул плазмалеммы, полученной в присутствии диамида, увеличивалась по сравнению с контролем (контрольные мембраны - плазмалемма, полученная с дитиотреитолом) и составляла 7 с"1, в то время как эффект трибутилфосфина проявлялся в том, осмотическое сжатие везикул плазмалеммы замедлялось, и константа скорости наблюдаемого процесса была равной 1.8 с"1. Сопоставляя эти данные с содержанием SH-групп мембран, было обнаружено, что между этими параметрами снова наблюдается отрицательная корреляция (Табл. 2). Таким образом, получено экспериментальное подтверждение, что плазмалемма адекватно реагирует на наличие в среде окислителя и восстановителя SH-групп, изменяя баланс между SH- и -S-S-связями. Следствием изменения этого баланса Время, с
14. Кинетика изменения интенсивности светорассеяния при осмотическом сжатии везикул плазмалеммы корней 7-дневных этиолированных проростков гороха, полученных в присутствии в среде гомогенизации диамида ЗмМ (1) и трибутилфосфина 2мМ (2). является модификация аквапорин-опосредованной осмотической водной проводимости - увеличение при возрастании количества -S-S-связей и, наоборот, снижение при увеличении количества SH-rpynn.
Поскольку PIP-аквапорины в мембране существуют в виде тетрамеров, мономеры которых взаимодействуют через дисульфидные мостики (Qi et al., 1995; Kukulski et al., 2005), можно полагать, что под влиянием диамида и трибутилфосфина в мембранах изменилось равновесие между количеством мономерной и олигомерной формами аквапоринов. Для проверки этой возможности в денатурирующих условиях при наличии и отсутствии дитиотреитола в буфере для образца был проведен электрофоретический анализ (рис. 15 а) и последующая иммунодетекция аквапоринов в мембранах, полученных с трибутилфосфином (рис.15 б, дорожки 1 и 2) и диамидом (рис.15 б, дорожки 3 и 4). При денатурации мембранных белков перед электрофоретическим разделением в отсутствии дитиотреитола интенсивность окрашивания полос, молекулярная масса которых соответствует мономерам (30 кД), заметно слабее по сравнению с димерной формой (56кД). Картина была практически одинаковой в обоих препаратах мембран (рис.15 б, дорожки 2 и 4), т.е. олигомерная форма аквапоринов оказывалась доминирующей. При включении дитиотреитола в денатурирующий буфер, судя по иммуноокрашиванию, доля олигомеров уменьшалась, а доля мономеров заметно возрастала.
Электрофорез проводили в отсутствие (2, 4) или в присутствии (1, 3) 100 мМ дитиотреитола в ДЦС-буфере для образца. Положение мономерной и димерной форм указано стрелками; на дорожку наносили по 15 мкг белка. изменение соотношения мономер-димер стало результатом восстановления дитиотреитолом тех -S-S-связей, которые экспонировались при денатурации белка. Это те связи, которые участвуют во взаимодействии между мономерами аквапоринов. Вместе с тем, поскольку в нативных мембранах они были недоступны ни для диамида, ни для трибутилфосфина, можно полагать, что за более высокую осмотическую проводимость, обнаруженную в мембранах, обработанных диамидом, отвечают не эти -S-S-связи, а связи, локализованные в другой зоне молекулы аквапорина (Kukulski et al, 2005).
Поскольку, согласно представленным результатам внесение в среду окислителя тиоловых групп приводит к увеличению, а восстановителей - к уменьшению осмотической водной проницаемости плазмалеммы корней, можно предположить, что существует эндогенный механизм регулирования трансмембранной водной проводимости, работа которого обеспечивается редокс-переходом мембранных белков. Изменения осмотической водной проницаемости при дитиол-дисульфидном переходе не связаны с олигомеризацией аквапоринов, а могут быть обусловлены, как мы полагаем, дитиол-дисульфидными переходами или в мономере аквапорина, или в соседних с ним белках плазмалеммы.
Влияние выращивания растений при низкой положительной температуре на осмотическую водную проницаемость плазмалеммы корней гороха и содержание PIP-аквапоринов
На клеточном уровне одной из основных причин нарушения водопоглощающей и водопроводящей функции корня у неустойчивых к низким температурам растений считают более выраженное, по сравнению с устойчивыми растениями, уменьшение вязкости липидного матрикса мембран вследствие количественного преобладания в бислое липидов с насыщенными жирными кислотами. При таком характере изменений фазового состояния липидов снижается скорость диффузии молекул воды через бислой и общий объем трансмембранного водного потока. Величина потока может быстро компенсироваться за счет возрастания интенсивности транспорта воды через аквапорины в результате их активации. Таким образом, значительный вклад в поддержание функциональной стабильности корня при понижении температуры могут вносить механизмы, регулирующие как липидный состав мембран, так и активность водных каналов. Развивающийся при снижении температуры окислительный стресс может инициировать дитиол-дисульфидный переход мембранных белков (Lee et al, 2004). Известно, что редокс-состояние клеточных белков смещается в сторону преобладания содержащих -S-S-связи при снижении температуры выращивания. Этот переход рассматривается как одна из защитных реакций в ответе растения на действие низкой температуры (Levitt, 1980).
Следующим этапом исследования стало изучение возможности включения SH-редокс-регуляции аквапорин-опосредованной водной проводимости плазмалеммы корней проростков гороха в условиях низкой положительной температуры. Такой подход был обоснован тем, что в этих условиях высока вероятность ограничения транспорта воды через липидный матрикс плазмалеммы и столь же велика вероятность активации ее переноса через аквапорины. Использованное нами низкотемпературное воздействие на проростки гороха не является повреждающим, так как такая культура, как горох, достаточно холодоустойчива. С целью изменения редокс-состояния мембранных белков в условиях in vivo было выбрано охлаждение проростков гороха в течение 20 часов при температуре 8 С.
На рис. 17 представлены кинетики осмотического сжатия везикул плазмалеммы, изолированной из корней контрольных и охлажденных проростков. Константа скорости этого процесса, характеризующая осмотическую водную проницаемость мембран, во втором варианте возросла примерно в 1.6 раза. Увеличение осмотической водной проницаемости плазмалеммы, изолированной из корней, подвергнутых низкотемпературному воздействию проростков, может указывать на следующие варианты развития событий: при перемещении проростков в условия пониженной температуры происходит увеличение содержания аквапоринов или их активности, а также изменение состава мембранных липидов в сторону преобладания ненасыщенных жирных кислот.
Вестерн-блот анализ белков плазмалеммы того и другого варианта не выявил различий в содержании аквапоринов PIP-типа, о чем свидетельствует одинаковая интенсивность иммуноокрашивания полос молекулярная масса которых соответствует их мономерной ( 30 кД) и димерной ( 56 кД) формам (рис. 18). Таким образом, повышение обогащенности мембран аквапоринами не могло быть причиной более высокой осмотической проводимости плазмалеммы у корней охлажденных проростков.
Для анализа того, произошли ли за время эксперимента качественные перестройки в липидном матриксе, было проанализировано фазовое состояние липидов с помощью флуоресцентного зонда дифенилгексатриена. На рисунке 19 представлена темепературная зависимость анизотропии флуоресценции дифенилгексатриена, встроенного в везикулы плазмалеммы из корней контрольных (кривая 1) и охлажденных (кривая 2) проростков. Видно, что на обеих кривых значения анизотропии плавно снижаются по шкале температур среды измерения. Такой характер изменений указывает, что в физиологическом диапазоне температур липидный бислой обнаруживает некоторое промежуточное фазовое состояние, что является характерным для биологических мембран. Кроме того, можно видеть, что величина анизотропии, характеризующая соотношение между твердо- и жидкофазными углеводородными зонами в липидном матриксе, практически одинакова для обоих вариантов. Таким образом, суточное пребывание проростков при низкой положительной температуре не вызвало изменений баланса липидов с насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами. Однако это не исключает возможности подобных изменений в результате более продолжительного воздействия на проростки низкой температуры (Бобылев и др., 1992). Поскольку фазовое состояние липидного матрикса является одним из факторов, определяющих кинетику транспорта воды через клеточные мембраны (Landeet a 1., 1995), можно заключить, что водная проницаемость липидного матрикса в обоих вариантах мембран одинакова.
Такие изменения в петле С могут сопровождаться переходом молекулы аквапоринов в активную конформацию. Тот факт, что в мембранах обнаружено резкое снижение количества SH-rpynn мог служить подтверждением вероятности такого способа активации аквапоринов в плазмалемме корней охлажденных проростков. В связи с этим, можно было ожидать, что максимально полное восстановление мембранных SH-rpynn приведет к снижению осмотической водной проводимости до величин, соизмеримых с контрольным вариантом. В предпринятых экспериментах из среды гомогенизации был исключен дитиотреитол, как достаточно мягкий протектор восстановленных SH-rpynn, и введен трибутилфосфин, обладающий мощной редокс-активностью. Как оказалось, эта добавка практически не повлияла ни на содержание SH-групп в мембранах, ни на уровень их осмотической водной проводимости (данные не представлены).
Таким образом, не отрицая возможности регулирования этого параметра путем изменения редокс-состояния определенных цистеиновых остатков в молекуле аквапоринов, мы не получили подтверждения этому в условиях выращивания проростков при пониженной температуре, что предполагает функционирование в этих условиях иного способа регулирования.
Одной из ранних ответных реакций растений на низкую температуру является генерация активных форм кислорода, в том числе перекиси водорода, которая в настоящее время рассматривается как вторичный посредник в трансдукции стрессовых сигналов (Mittler, 2002).
