Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Проницаемость плазмалеммы клеток для ионов и потребление кислорода 10
1.1.1. Вклад пассивной ионной проницаемости плазматической мембраны в регуляцию энергетических затрат клетки 10
1.1.2. Роль АТФ-азных систем плазматических мембран в регуляции энергетического обмена клеток 20
1.2. Локализация АТФ-азных систем и ультраструктурные изменения в клетках при различных воздействиях 28
Глава 2. Объект и методы исследования 54
2.1. Объект исследования 54
2.2. Методы исследования 55
2.2.1. Определение интенсивности дыхания 55
2.2.2. Определение рН и содержания ионов калия в растворе инкубации 55
2.2.3. Методика электрофизиологических исследований 56
2.2.4. Определение образования супероксидного анион-радикала 57
2.2.5. Метод электронной микроскопии 57
2.2.6. Методика улырацитохимического выявления локализации АТФ-азной активности 58
Глава 3, Результаты исследования и их обсуждение 66
3.1. Структурно-функциональная характеристика клеток отсеченных корней пшеницы при многочасовой инкубации 66
3.2. Изменение ионной проницаемости, биоэлектрических характеристик плазмалеммы, локализации АТФ-азной активности, продукции супероксида, ультраструктуры и дыхания клеток корней пшеницы при действии хлорпромазина 76
3.3. Влияние грамицидина S на проницаемость плазмалеммы для ионов, мембранный потенциал, мембранное сопротивление, локализацию АТФ-азной активности, продукцию супероксида, дыхание и ультраструктуру клеток корней пшеницы 88
3.4. Влияние ДЦКД на проницаемость плазмалеммы, мембранный потенциал, мембранное сопротивление, продукцию супероксида, локализацию АТФ-азной активности, дыхание и ультраструктуру клеток корней пшеницы 93
3.5. Изменение ионной проницаемости, биоэлектрических характеристик, продукции супероксида, локализации АТФ-азной активности, дыхания и ультраструтуры клеток корней при действии валиномицина 99
3.6. Действие валиномицина на формирование адаптивных процессов отсеченных корней пшеницы 103
3.7. Действие валиномицина на мембранный потенциал, дыхание и К+-проницаемость клеток преинкубированных корней 111
Заключение 118
Выводы 125
Литература 127
- Локализация АТФ-азных систем и ультраструктурные изменения в клетках при различных воздействиях
- Определение рН и содержания ионов калия в растворе инкубации
- Изменение ионной проницаемости, биоэлектрических характеристик плазмалеммы, локализации АТФ-азной активности, продукции супероксида, ультраструктуры и дыхания клеток корней пшеницы при действии хлорпромазина
- Влияние ДЦКД на проницаемость плазмалеммы, мембранный потенциал, мембранное сопротивление, продукцию супероксида, локализацию АТФ-азной активности, дыхание и ультраструктуру клеток корней пшеницы
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. Среди множества клеточных мембран имеется одна, роль которой особенно важна - это плазматическая мембрана, образующая поверхность клетки (Поликар, 1972; 1975).
Вся внешняя регуляция жизни клетки проходит через воздействие регуляторных сигналов на наружную плазматическую мембрану, занимающую ключевое положение в иерархии систем управления (Конев, 1987). При этом значительная часть клеточного ответа непосредственно связана со структурно-функциональным состоянием мембраны и им же определяется (Болдырев, 2001). Важно, что в ответную реакцию клеток вовлекается большое число функциональных блоков мембраны, и в таком случае физиологическая регуляция приобретает особое значение в критические моменты жизни клетки, например при стрессовых воздействиях или при переключении от состояния покоя к активности.
В связи с этим, особый интерес представляет работа ИАТарчевского (Тарчевский, 2002), где рассматриваются конкретные механизмы функционирования сигнальных систем у растений и их взаимодействие.
Плазматическая мембрана со встроенными в нее функциональными элементами играет ведущую роль в поддержании клеточного гомеостаза, без которого невозможна жизнь. Одной из составляющих частей клеточного гомеостаза является ионный (функциональный), который тесно связан с энергетическим и пластическим (Новосельцев, 1991). Именно сдвигам ионного гомеостаза придается основное значение в запуске ответных реакций клетки на различные воздействия. Плазматическая мембрана не только регулирует вход и выход веществ через клеточную мембрану, но и осуществляет обмен информацией и энергией между внешней средой и клеткой (Кагава, 1985).
В основе формирования функционального ответа клеток на внешние воздействия лежит взаимосвязь энергетического обмена с ионным транспортом. Можно полагать, что одним из звеньев в регуляции внутриклеточного обмена и соответствующих энергетических затрат является смещение ионного гомеостаза клеток через изменения структурно-функциональных свойств плазмалеммы. Степень возмущения ионного гомеостаза клеток определяется изменениями соотношения пассивных и активных транспортных процессов (Лев, 1975). В связи с этим, особый интерес представляют исследования структурно- функциональных изменений, происходящих в интактных клетках при различных воздействиях. Исследования, проводимые на интактных растительных тканях, позволяют выявить функционирование регуляторных механизмов поддержания ионного гомеостаза и энергетические возможности клеток при направленном изменении структурно-функциональных свойств плазмалеммы.
Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось выявление сопряженности изменений энергстическоги- ибмщш ' ЛМШЩЗІции АТФ-азноЙ активности и ультраструктурвой РгаН»ШциДн^(^ корней
і —*
пшеницы при модификации ионной проницаемости плазмалеммы и блокировании активного ионного транспорта.
Исходя из указанной цели, были поставлены следующие задачи:
исследовать изменения локализации АТФ-азной активности и
дыхательного газообмена при многочасовой инкубации отсеченных корней в
воде;
исследовать изменения проницаемости плазмалеммы для ионов калия, биоэлектрических характеристик плазмалеммы, локализации АТФ-азной активности, а также ультраструктурные перестройки и дыхание клеток корней пшеницы на ранних этапах ответных реакций (2 часа) при действии:
а) мембранотропного соединения широкого спектра действия -
хлорпромазина (ХП);
б) неспецифического каналогена - грамицидина S (Гр);
в) ингибитора Н -АТФ-азы -дициклогексилкарбодиимида (ДЦКД);
г) специфического' К+-ионофора - валиномицина (Вал);
выявить особенности действия Вал на проницаемость плазмалеммы
для ионов калия, локализацию АТФ-азной активности, ультраструктуру и
дыхательный газообмен клеток при многочасовой инкубации отсеченных
корней, оценить компенсаторные возможности клеток при специфическом
увеличении калиевой проницаемости.
Научная новизна работы. Впервые сочетание физиолога-биохимических методов, электронной микроскопии и ультрацитохимии позволило выявить взаимосвязи изменений локализации АТФ-азной активности, дыхания, ультраструктуры, МП клеток, содержания К* и рН среды инкубации корней. Это дало возможность оценить участие отдельных клеточных структур в поддержании ионного гомеостаза клеток при направленном изменении ионной проницаемости плазмалеммы.
Впервые показано, что локализация АТФ-азной активности зависит от
степени изменения ионной проницаемости плазмалеммы. Получены данные о
действии модификаторов ионной проницаемости плазмалеммы на локализацию
АТФ-азной активности в клетках корней пшеницы. При действии
специфического К+-ионофора - валиномицина - локализованная на плазмалемме
АТФ-азная активность увеличивается, что обеспечивает восстановление
нарушенного ионного гомеостаза. Это компенсаторное регулируемое
активирование Н+-АТФ-азы плазмалеммы сопровождается усилением
энергетических затрат (увеличение потребления кислорода).
Ультраструктурные перестройки митохондриального аппарата
свидетельствуют о непосредственном участии митохондрий в аккумуляции ионов.
Впервые показано, что при увеличении ионной проницаемости
плазмалеммы под действием неспецифического мембраноактивного
соединения ХП АТФ-азная активность на плазмалемме отсутствует и
выявляется на тонопласте. Ультраструктурные перестройки
митохондриального аппарата не наблюдаются, и происходит снижение потребления кислорода.
Практическая значимость работы. В связи с использованием соединений, обладающих мембранотропным действием, в различных областях жизнедеятельности человека представляется актуальным исследование ранних реакций в ходе формирования ответов клеток на их воздействие. Полученный экспериментальный материал свидетельствует о целесообразности комплексного исследования ответных реакций растительных клеток на воздействие мембраноактивных соединений.
Новые данные об изменениях ультраструктуры клеток корней и локализации АТФ-азной активности под влиянием мембраноактивных соединений могут быть использованы для оценки функционального состояния клеток при других воздействиях.
Материалы исследования углубляют существующие представления о структурно-функциональных взаимоотношениях в клетках растений при модуляции ионной проницаемости плазмалеммы мембранотропными соединениями и могут служить методологической основой при изучении реактивности и адаптации на уровне растительной ткани.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены на: конференции молодых ученых «Механизмы регуляции функционирования биологических систем и методы их изучения» (Казань, 1985); итоговых научных конференциях КИББ КНЦ РАН (Казань, 2000,2001); Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (С-Петербург, 2000); Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии в XXI веке» (Сыктывкар, 2001); 5 Conference on Oxygen free radicals and oxidative stress in plants (Nice, 2001); V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений -основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); XIII Conference ISBC «Energetics of adaptation and development. From molecular mechanisms to clinical practice» (WDrzburg I Veitsh6chheim, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, включает 14 таблиц и 26 рисунков. Список цитируемой литературы включает 331 источник , из них 229 отечественных.
Локализация АТФ-азных систем и ультраструктурные изменения в клетках при различных воздействиях
Бурному развитию гистохимии ферментов способствовало открытие реакции, предложенной в 1939 г. одновременно Гомори и Такамацу для выявления щелочной фосфатазы. Именно этот «свинцовый» метод находится у истоков ультрацитохимии ферментов [44].
Поскольку ферментные белки по реакциям связывания красителей практически не отличаются друг от друга, в основе цитохимии ферментов лежит выявление продукта ферментативной реакции, действии их на субстрат.
Специфическое выявление ферментного белка может быть проведено лишь с помощью сложных иммуноцитохимических методов. При этом следует обращать внимание на то, что иммуноцитохимические методы не могут дать сведений о том, в каком состоянии находится фермент - в активном или неактивном [106].
Основной задачей ультрацитохимии ферментов является не описание цепей внутриклеточных реакций, а в первую очередь точная локализация ферментативной активности, а следовательно, ферментного белка в клетках и тканях. Под активностью фермента в ультрацитохимии понимают ферментативное превращение какого-либо субстрата. Решающую роль играет точная локализация образовавшегося продукта реакции. В биохимии понятие активности обязательно связано с определенными экспериментальными условиями. Эти условия должны быть подобраны так, чтобы ферментативная реакция протекала при насыщении субстратом, т.е. чтобы скорость превращения не зависела от концентрации субстрата [111]. Реакции, проводимые на ткани с целью топохимического выявления ферментов, предусматривают их иммобилизацию.
Нерастворимый продукт реакции иногда сразу образуется. В том случае, если этот продукт отмечается достаточно высокой плотностью, он может служить маркером места нахождения фермента. В противном случае приходится путем особой последующей обработки переводить продукт реакции в электронной-лотное соединение. В «свинцовом» методе, инкубационная среда содержит преципитирующий металлический реагент, посредством которого продукт ферментативного расщепления тотчас же переводится в выпадающую в осадок соль металла: Субстрат — —» продукт расщепления v » осадок.
В 70-х годах прошлого столетия была проведена серия работ по выявлению активности различных фосфатаз (в том числе и АТФ-аз) ультрацитохимическими методами на различных растительных объектах [17; 131; 132; 175; 176]. Показано, в частности, что в корнях 5-дневных проростков люпина наибольшая активность кислой фосфатазы наблюдалась в срезах живых корней. В клетках корней зоны растяжения и зоны корневых волосков фосфатаза обнаруживалась в клеточных стенках и межклеточниках. Внутри клеток кислая фосфатаза связана с мембранными структурами, особенно на поверхности эндо-плазматического ретикулума, а также в диктиосомах аппарата Гольджи [176]. Отмечается, что при дифференциации клеток в корне происходит изменение локализации кислой фосфатазы. В более молодых клетках фермент сосредоточен в лизосомах, каналах эндоплазматического ретикулума и диктиосомах. В клетках корневых волосков фосфатаза расположена диффузно. Можно также привести результаты исследований Л.В.Можаевой [131] об обнаружении кислой фосфатазы во всех клетках волосковой зоны корня. Она наиболее высока в клетках проводящих тканей центрального цилиндра. В клетках коры активность фосфатазы была сравнительно невысокой и выявлялась, главным образом, вблизи клеточных стенок. Она сильнее проявлялась в клетках наружной части корня и внутренней части, прилегающей к эндодерме.
Исследование фосфатазной активности под влиянием иона молибдена было проведено в работе [34]. Ультрацитохимическим анализом обнаружено, что молибдат повышает активность кислой АТФ-азы в проводящих пучках стебля гороха. Особо отмечается, что избирательное действие молибдата на активность фермента зависит от рН среды.
Были также проведены исследования по определению внутриклеточной активности щелочной фосфатазы. Привлекают внимание данные о гидролизе АТФ корнем [175]. Оказалось, что за 1 сутки экзогенная АТФ полностью разлагается корнями. При этом происходит торможение АТФ-азы, если в среду добавляли неорганический фосфат или молибдат. За гидролиз экзогенной АТФ ответственна АТФ-аза, локализованная на поверхности плазмалеммы эпидер-мальных клеток и являющаяся структурным компонентом плазмалеммы.
Ультрацитохимическим методом [199] определена активность и локализация щелочной фосфатазы в побегах ели в течение года. Повышенная активность фосфатазы обнаружена в конце ложа в сформировавшейся новой почке. Осенью и зимой активность несколько снижена. Во время летнего и весеннего роста побега наиболее активная фосфатаза выявлялась особенно в клетках первичной коры. В период покоя фосфатаза всегда локализована в ядрах, а во время интенсивного роста - в клеточных стенках.
Наиболее широко применяемые методы ультрацитохимического выявления АТФ-аз основаны на принципе Гомори (Gomori, 1952), заключающемся в осаждении анионов фосфата катионами свинца [44. С. 106-108]. Соответствующая реакция приводит к образованию гранулярного, мелкозернистого продукта с высокой электронной плотностью. Рентгеноспектральный анализ электронно-плотного осадка, образующегося в результате ультрацитохимической реакции, был проведен Van Steveninck [326]. Из 2 типов осадка (гранулярного, глобуляр ного) свинец присутствовал в гранулярном осадке, а в глобулярном, скорее всего, осмий, причем осмиофильность, по мнению автора, была вызвана Са2+. Первоначальный вариант инкубационных сред разработали Wachstien, Meisel [329]. Основные реагенты должны иметь оптимальную концентрацию для повышения надежности и специфичности выявления фермента, и с этой же целью необходимо строго учитывать взаимоотношения между преципитирующим агентом, субстратом и ферментом, а также возможность неферментативного гидролиза АТФ, Следует отметить, что нуклеозидтрифосфаты склонны к спонтанному гидролизу при повышении температуры инкубационной среды, причем состав буферного раствора также имеет большое значение [177; 212]. Так, в трис-малеатном буфере неферментативный гидролиз проявляется вдвое медленнее, чем в имидазол-глицилглициловом буфере. Фосфатный буфер, который часто используется в методике электронной микроскопии, применять нежелательно, поскольку возможна неферментативная спонтанная преципитация ионов свинца инкубационной среды. Показано, что при наличии биологического материала, содержащего АТФ-азную активность, ферментативный гидролиз АТФ протекает быстрее, чем неферментативный [26; 217; 252].
Определение рН и содержания ионов калия в растворе инкубации
О выходе калия из клеток отсеченных корней судили по изменению содержания его в растворе после инкубации корней. Измерения проводили на пламенном фотометре Phlapho-41 (Германия). Расчет производили по формуле: К- количество ионов калия, мкэкв/г, Х- показания прибора в опыте, Y- стандартный раствор. Содержание калия в среде инкубации выражали в мкэкв на 1 г сырого веса корней за соответствующее время. Измерение pH раствора инкубации проводили на рН-метре ОР-211/1 («Radelkis», Венгрия). Для измерения биоэлектричеких параметров мембран использовали микроэлектродную технику. Стеклянные микроэлектроды с помощью микроманипулятора КМ-2 вводили в клетки ризодермиса в области зоны роста (1.5-2 см от кончика корня). Микроэлектроды изготавливали из стекла «пирекс» на микрокузнице МЭ-4. Для улучшения заполнения микроэлектрода электролитом использовали стеклянные капилляры с несколькими внутренними микрокапиллярами. Электрод сравнения представлял собой тефлоновую трубку, заполненную 2% агар-агаром, приготовленном на 3 М растворе КС1. Микроэлектрод и электрод сравнения соединяли с измерительной аппаратурой при помощи хлорсе-ребряных неполяризуемых электродов через агар-агаровые мостики. Для измерения электрического входного сопротивления клеток корней (R ) применяли одноэлектродный метод фиксации тока (current clamp). После введения микроэлектрода в клетку и выхода мембранного потенциала (МП) на стационарный уровень подавался одиночный импульс гиперполяризующего тока силой 1 нА и длительностью 100 мс. Длительность импульса была подобрана такой, чтобы полностью зарядить как электродный, так и клеточный импедансы и выйти на асимптотическое значение напряжения. Импедансная кривая для визуального контроля выводилась на цифровой запоминающий осциллограф С9-8. Разделение клеточного и электродного импедансов и расчет измеряемых параметров (RBX и Твх ) производились с помощью компьютера. Анализируя результаты измерений электрического входного сопротивления клеток корня, необходимо учитывать наличие межклеточной электрической связи по плазмодесмам, которая вносит вклад в измеряемую величину RBX. Электронное оборудование для фиксации тока было реализовано на базе электрофизиологической лаборатории «Experimetria» (Венгрия). Компенсацию паразитных емкостей и сопротивления микроэлектрода до введения его в клетку производили при помощи осциллографа С1-69. Подробно методика измерения биоэлектричеких параметров мембран описана в работе [123]. Электрофизиологические исследования проводились совместно со с.н.с. лаборатории биофизики клеточных мембран А.Н. Ценцевицким.
Одним из важных свойств супероксидного анион-радикала (в отличие от других кислородных радикалов и синглетного кислорода) является его относительно высокое время жизни в водных растворах, которое составляет величину порядка нескольких миллисекунд. В связи с этим, вероятно, этот радикал способен удаляться на значительные расстояния от мест его образования. Существует множество методов изучения радикалов кислорода, и один из них - по превращению неокрашенного эпинефрина в окрашенный адренохром при взаимодействии с супероксидным анион-радикалом [234]. Навеску отсеченных корней (150 мг) помещали в бюксы с 3 мл соответствующего раствора и инкубировали в течение 2 часов при температуре +30С. После инкубации в раствор добавляли 500 мкл эпинефрина (рН 6.8) в конечной концентрации 1 мМ. Об образовании супероксидного радикала судили по превращению эпинефрина в течение 15 минут в адренохром, который учитывали с помощью фотоэлектроколориметра при 480 нм. Данные представлены в концентрации адренохрома. После определения интенсивности дыхания корни из сосудиков фиксировали для изучения изменений ультраструктуры клеток с помощью электронного микроскопа. Брали кусочки ткани длиной 1-2 мм, отступая 1см от кончика корня, т.е. из зоны растяжения. Образцы фиксировали 2,5% раствором глутаро- вого альдегида («Serva», ФРГ) в фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 2 часов. Постфиксировали 1% раствором О5О4 («Serva», ФРГ) в том же буфере с добавлением сахарозы (25 мг/мл) в течение 2 часов. Далее образцы дегидратировали в спиртах восходящей концентрации (30 , 40, 50, 60, 70, 96), ацетоне и окиси пропилена. Заливочной средой служил Эпон-812 («5егуа»,ФРГ). Полимери-зовали в течение трех суток, увеличивая температуру от 37С до 60С. Срезы, полученные на ультрамикротоме LKB-111 (Швеция), контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата 20 минут при 60С [317], а затем 10 минут водным раствором цитрата свинца [327]. Препараты просматривали на электронном микроскопе ЭМ-200 (Украина), JEM-100 СХ (Япония), Hitachi-118 (Япония). Анализировали ультраструктуру клеток центрального цилиндра на поперечном срезе корня. Коррекцию дрейфа увеличений микроскопов производили, используя стандартные дифракционные решетки. С целью получения удовлетворительных результатов для нашего объекта (клеток корней пшеницы), поскольку в доступной литературе не обнаружены данные по их изучению, нами были проведены пробные фиксации: с выделенными органеллами (клеточная стенка, плазмалемма); с кусочками ткани в различных буферах (фосфатный, какодилатный, трис-малеатный); с различным временем префиксации образцов, инкубации и постфиксации; с различной температурой среды инкубации; с предварительным и непосредственным приготовлением инкубационной среды; с разным составом и порядком растворения компонентов инкубационной среды; с различной концентрацией компонентов инкубационной среды. Проведенное исследование позволило модифицировать методику Wachstien, Meisel [329] в применении к клеткам корней пшеницы. Для нашего объекта исследования оптимальные условия выявления специфического осадка, получающегося при ферментативном расщеплении субстрата и последующем его осаждении были следующие: 1) состав полной инкубационной среды: 2 мМ АТФ-натриевая соль, 80 мМ трис-малеат (рН 7,2, доводится 0,2 М NaOH), 0,25 М сахароза; 6,3 мМ MgS04; 2 мМ Pb (N03)2 (рис. 1); 2) порядок растворения компонентов инкубационной среды: АТФ — MgSO — Pb (N03)2. Нитрат свинца добавлять в среду необходимо последним из-за кон куренции между ферментом и ионом свинца за субстрат. В качестве контрольных вариантов на специфичность получаемого осадка фосфата свинца использовали инкубационные среды с исключением Mg2+- Ті активатора ферментативной реакции; РЬ -преципитиругощего агента; без АТФ-субстрата ферментативной реакции; ингибитора диэтилстильбистрола 0,2 мМ (ОЭС). При приготовлении среды инкубации, содержащей D3C, до последовательного растворения всех остальных компонентов в буферный раствор первым вносился ингибитор, учитывая особенности его растворения (рис. 2, 3, 4,5);
Изменение ионной проницаемости, биоэлектрических характеристик плазмалеммы, локализации АТФ-азной активности, продукции супероксида, ультраструктуры и дыхания клеток корней пшеницы при действии хлорпромазина
Клеточный ответ и регуляция физиологических процессов во многом определяются структурно-функциональными свойствами плазматической мембраны. Изменение транспортных процессов на плазмалемме относится к числу ранних реакций на внешние воздействия. Большинство альтерирующих факторов вызывает снижение градиента ЬҐ на плазмалемме, ее деполяризацию, открывание К+- каналов [89].
Передачу внешнего сигнала при стрессорном воздействии соответствующим клеточным эффекторным системам могут осуществлять: изменение концентрации ионов кальция в цитозоле растительных клеток [207], потенциал действия как дистанционный сигнал [179; 183], низкомолекулярные белки [95] и др.. Смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия является одним из первых неспецифических звеньев в развитии общей стресс-реакции и может служить (тем) биологически важным изменением внутренней среды клетки, которое запускает другие механизмы защиты [15; 178; 218].
Одним из подходов в исследовании роли плазмалеммы в регулировании функциональных ответов клеток является использование соединений, модулирующих ее проницаемость для ионов, с различной степенью специфичности. Исследование ранних реакций ответа клеток на действие соединений, обладающих мембранотропными свойствами, представляет значительный интерес в связи с широким использованием их в различных областях жизнедеятельности человека.
Сильным мембранотропным эффектом обладают производные фенотиа-зина, в частности, хлорпромазин (ХП). Как видно из данных, представленных в таблице 1, потеря К клетками отсеченных корней, инкубированных 2 ч с ХП, была значительно больше, чем в контроле (инкубирование в дистиллированной Н20).
В соответствии с точкой зрения, разделяемой многими исследователями, ХП связывается с полярными группами фосфолипидов мембран, является конкурентом кальция и вытесняет его, нарушая соотношения этого иона с одновалентными ионами [85]. Проникая в мембрану или образуя комплексы с ее компонентами, ХП влияет на структуру мембраны, изменяет ее консистенцию и соотношение зарядов, что ведет к сдвигам проницаемости мембраны [117]. Изменения структуры мембраны могут быть обусловлены также взаимодействием ХП с мембранными белками и конформационными перестройками белковых молекул [8; 57]. Наряду со значительной потерей клетками К+ в присутствии ХП наблюдалось увеличение рН среды инкубации отсеченных корней (табл. 1), что свидетельствует об усилении ионных потоков и увеличении проницаемости плазмалеммы. Кроме того, ХП вызывал значительное снижение биоэлектрических характеристик - МП и RBX (табл. 2).
Величина МП клеток определяется (при прочих равных условиях) соотношением электрогенных каналов и каналов утечки, a RBX - мембранным сопротивлением и межклеточной проницаемостью [113]. Снижение МП клеток корней под влиянием ХП связано со снижением отношения электрогенных каналов к числу каналов утечки за счет значительного увеличения последних. ХП изменяет состояние липидного компонента плазматической мембраны, которое в значительной степени определяет ее ионную проницаемость, сопротивление и редокс-потенциал.
Наряду с изменениями ионной проницаемости плазмалеммы, образование активных метаболитов кислорода (АМК) рассматривается в качестве ранних ответных реакций клеток на стрессорные воздействия [46; 76; 87; 89]. АМК (малые редокс-молекулы) играют важную роль в реакции сверхчувствительности клеток, они могут быть вторичными посредниками во внутриклеточной сигнализации и в передаче сигнала межклеточного взаимодействия, а также индукторами синтеза гормонов «тревоги», способных экспрессировать гены [145; 174; 306]. В ответ на стрессовые факторы различной природы в клетках животных и растений происходит образование супероксида и перекиси водорода, а также индукция экстраклеточной пероксидазной активности [21; 230; 282; 302; 310]. Интенсивность этих процессов в клетках зависит от физиологического состояния (организма), скорости и направленности биохимических процессов и от функционирования антиоксидантных систем. Значительный вклад в продукцию супероксида клетками вносят энзиматические системы клеточной поверхности. В животных клетках НАДФН-оксидазный комплекс плазматической мембраны создает и поддерживает определенный пул Н202, предшественником которой является супероксид. В плазматических мембранах некоторых клеток животных предполагается функционирование сенсоров, связанных с антиокси-дантной защитой и состоящих из двух независимых белковых систем — НАДФН-оксидазного комплекса и К+- канала, регулируемого Н2О2 [195; 196; 197; 198]. В генерацию супероксида растительными клетками вовлечены ре-докс-система плазмалеммы, использующая в качестве восстановителя НАДН или НАДФН и пероксидаза клеточной поверхности [237; 286; 307]. Предполагается, что активация образования супероксида ред оке-системой плазмалеммы имеет функциональное значение, в частности, для процессов детоксикации некоторых ксенобиотиков, осуществляющихся через N-окисление [51].
В наших экспериментах в присутствии ХП содержание супероксида, генерируемого клетками отсеченных корней, возросло (таблЛ) (что, вероятно, связано с нарушениями структурной целостности плазмалеммы и активированием пероксидазы клеточной поверхности при увеличении рН среды инкубации в этих условиях). Состояние липидного компонента плазматической мембраны в значительной степени определяет ее ионную проницаемость и поверхностный электрический заряд, от которого зависит уровень окисления SH-групп мембранных белков, а также функционирование редокс-систем, генерирующих супероксид и перекись водорода [32]. Поскольку ХП вызывает усиление пероксидации липидных и белковых компонентов плазмалеммы, не исключено снижение активности антипероксидных систем и увеличение уровня окисления SH-групп мембранных белков, способных обезвреживать радикальные формы кислорода и другие окисленные соединения. Действие ХП на генерацию супероксида клетками корней обусловлено не только изменениями структуры плазмалеммы и соотношения зарядов на мембране, но, по-видимому, связано с вытеснением ионов кальция и их поступлением в цитоплазму, Уровень свободного кальция в клетках влияет на образование АМК [45]. Показано увеличение регистрируемого (количества) супероксида при усилении поступления Са2+ внутрь клеток [48; 185].
Значительное увеличение выхода К+ из клеток и рН среды инкубации отсеченных корней, а также снижение биоэлектрических характеристик клеток в присутствии ХП свидетельствуют об увеличении ионной проницаемости плаз-мал еммы и усилении ионных потоков. Эти эффекты ХП обусловлены действием его на структуру плазмалеммы и ее функциональные компоненты, связанные с мембранным транспортом. Известно, что ХП подавляет активность мембранных АТФ-аз [140], а также ингибирует кальмодулинзависимые ферменты, в частности, фосфодиэстеразу цАМФ, Ca2+/Mg2+-ATO-a3y [4]. Об ингибирова-нии мембранных АТФ-аз в наших экспериментах свидетельствуют данные электронной цитохимии. На фоне ХП АТФ-азная активность на плазмалемме отсутствовала (рис. 14 а, б), что, вероятно, связано не только с ингибированием мембранных АТФ-аз (протонной и кальциевой), но и с нарушением структурной целостности плазмалеммы, вытеснением ионов кальция, которые, так же, как ІҐ, поступают в цитоплазму. Показано, что ХП в концентрации 100 мкМ приводил к 4-6 кратному увеличению содержания кальция в клетках и усиле-нию входящих Са -токов [90; 283]. Известно, что ионы кальция способны запускать многие клеточные процессы и играют особую роль в интеграции клеточных функций. Поддержание уровня свободного кальция в цитозоле осуществляется за счет функционирования мембраносвязанных Са2+-АТФ-аз и Са2+-канапов плазмалеммы и внутриклеточных мембран [258]. Са2+-АТФ-аза плазмалеммы, которая занимает основное место в выбросе кальция, может осуществлять и Са /Н -обмен [238; 315].
Влияние ДЦКД на проницаемость плазмалеммы, мембранный потенциал, мембранное сопротивление, продукцию супероксида, локализацию АТФ-азной активности, дыхание и ультраструктуру клеток корней пшеницы
Действие блокатора протонных АТФ-аз ДЦКД на выход К+ в среду инкубации отсеченных корней было слабее, чем ХП и Гр, а рН среды оставался на уровне контроля (табл. 7), что, по-видимому, свидетельствует о незначительном поступлении протонов внутрь клеток.
ДЦКД способен связываться с различными белками, в том числе с гидрофобным белком, формирующим РҐ-канал ГГ-АТФ-азы. ДЦКД быстро останавливал выделение ЬҐ корнями проростков подсолнечника, а поглощение К+ ин-гибировалось не полностью [293]. Показано также, что работа Н+-АТФ-азы плазматических мембран в качестве РГ-насоса потенциалзависима [266; 301; 312; 328].
В наших экспериментах ДЦКД вызывал снижение МП и RBX клеток корней (табл. 8), которое было менее значительным, чем в случае ХП и Гр. Кроме того, ДЦКД обладает колхицинподобным действием на цитоскелет [170] и как «сшивающий» агент ограничивает подвижность белков [90]. По-видимому, с этим действием его на транспортный канал шіазмадесм связано снижение R клеток при инкубировании корней с ДЦКД.
Содержание супероксида, генерируемого клетками корней в присутствии ДЦКД, было значительно снижено (табл. 7). Известно, что ДЦКД может связываться с различными белками, образуя внутри- и межмолекулярные сшивки, что приводит к ингибированию функционирования белковых компонентов. Весьма вероятно, что ДЦКД ингибирует пероксидазу клеточной поверхности. Кроме того, в его присутствии в среде инкубации корней растворимые формы пероксидазы, по-видимому, не вымываются в апопластное пространство. Не исключено, что ДЦКД подавляет продукцию супероксида редокс-системой плазмалеммы, где предполагается наличие хинонных компонентов, как антагонист хинонов, которые способны к обратимым одноэлектронным реакциям окисления-восстановления [62; 149]. Редокс-система плазмалеммы, вовлечена в продуцирование супероксида клетками корней [289].
По некоторым данным [324], в отличие от другого ингибитора Ї-Ґ-АТФазы плазматических мембран (диэтилстильбестрола, ванадата), ДЦКД имеет не одно, а несколько мест связывания с ферментом. Ингибирующий эффект ДЦКД на ИҐ-АТФ-азу плазматических мембран в большей степени относится к транспортной, чем гидролитической функции фермента [320]. В наших ультрацитохимических экспериментах АТФ-азная активность обнаруживалась на плазмалемме клеток корней и интенсивность ее проявления на фоне ДЦКД была больше, чем в контроле (рис. 17 б, в). По-видимому, это связано с тем, что ДЦКД в концентрации 100 мкМ полностью угнетает активный транспорт І-Ґ и лишь частично - гидролиз АТФ при участии КҐ-АТФ-азьі плазматических мембран, и вызванное присоединением ДЦКД изменение конформации фермента сопряжено, в первую очередь, с ограничением его подвижности и сильнее сказывается на выбросе протонов [90; 130]. Не исключено, что ДЦКД блокирует не только протонную, но и кальциевую АТФ-азу. Показано, в частности, необра-тимое ингибирование ДЦКД Са -АТФ-азы саркоплазматического ретикулума [19; 309].
Снижение потребления кислорода отсеченными корнями в присутствии ДЦКД было незначительным (табл. 9) и было вызвано, вероятно, его действием на структурное состояние мембран и ингибированием гҐ-АТФ-азьі плазмалем-мы. Как антагонист хинонов ДЦКД может подавлять функционирование тех звеньев электронтранспортных цепей, в состав которых включены хиноны, в том числе редокс-системы плазмалеммы [149].
После 2-х часовой инкубации отсеченных корней с ДЦКД изменялась ультраструктура митохондрий: их размер увеличвался, матрикс просветлялся, кристы исчезали (рис. 17 а). Аналогичная картина наблюдалась на культуре клеток СПЭВ в присутствии ДЦКД [170], а также при действии на отсеченные корни антимицина А — ингибитора митохондриальной дыхательной цепи [60]. Подобные изменения ультраструктури могут быть связаны с деэнергизацией митохондрий и аккумулированием ими ионов. В опытах на изолированных митохондриях [249] ДЦКД вызывал выход ионов кальция, сопровождающийся увеличением расхода энергии, стимуляцией потребления кислорода и набуханием митохондрий. Кроме того, наблюдалось быстрое окисление пиридиннук-леотидов, падение МП. Предполагается, что потеря кальция обусловлена кон-формационным переходом, вызванным кооперативной связью ДЦКД с мембраной. Место связывания локализовано в субъединице энергосвязанной трансгид-рогеназы. Трансгидрогеназа играет ключевую роль в редокс-состоянии НАДФ+, от которого зависит сохранение и выход Са2+. В определенных условиях мито-хондрии могут выполнять роль Са -буфера, способного оперировать большими количествами кальция и способствовать сохранению внутриклеточного го-меостаза Са при различных воздействиях [125; 173]. Обращает на себя внимание изменение конфигурации митохондрий - они имеют неправильную форму. Это может быть связано с действием ДЦКД на цитоскелет клеток подобно действию колхицина и ротенона. Овальная форма митохондрий, по-видимому, определяется в значительной мере структурным состоянием цитоскелета, тесно связанным с плазматической мембраной и примембранными слоями [200]. Изменения ультраструктуры и формы митохондрий могут быть связаны и с непосредственным действием ДЦКД при проникновении его внутрь клеток, чего нельзя исключить, поскольку ДЦКД является электронейтральным электро-фильным соединением, хорошо растворимым в липидах [53]. В случае проникновения ДЦКД в клетки митохондрии становятся деэнергизованными и, веро-ятно, аккумулируют Са , избыток которого в клетках создается вследствие блокирования ДЦКД Са2+-АТФ-аз плазмалеммы и тонопласта. Подтверждением этого являются результаты электронной цитохимии - отсутствие АТФ-азной активности на тонопласте при инкубировании отсеченных корней с ДЦКД (рис. 18).
