Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Метаболические состояния митохондрии и физиологические состояния живой ткани 9
1.2. Соотношение гликолиза и штохондриального дыхания при различных функциональных состояниях клеток и тканей 27
1.3. Изменение функциональных свойств изолированных тканей и органов 35
ГЛАВА II
ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ 49
2.1. Объект исследования 49
2.2. Методика определения интенсивности дыхания 50
2.3. Измерение люминесценции флавопротеинов и пиридин-нуклеотдов 50
2.4. Определение проницаемости мембран корневых клеток 52
2.5. Методика измерения мембранного потенциала 52
2.6. Определение тепловыделения корней 52
ГЛАВА III.
ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ В ПРОЦЕССЕ АДАПТИВНОГО СТАРЕНИЯ 54
3.1. Изменение барьерной функции мембран клеток корней I пшеницы в ходе многочасовой инкубации 54
3.1.1. Изменение мембранного потенциала и проницаемости мембран клеток корней для ионов 54
3.1.2. Зависимость мембранного потенциала и проницаемости мембран корневых клеток для ионов К+ от синтеза белка в ходе адаптивного старения 66
3.2. Изменение метаболических состояний митохондрий в клетках корней пшеницы в процессе адаптивного старения 77
3.2.1. Действие дыхательных ядов на потребление кислорода корнями в зависимости от времени их промывания .77
3.2.2. Изменение редокс-состояний флавопротеинов и пири-диннуклеотидов клеток корней в процессе адаптивного старения 89
3.3. Взаимоотношение между гликолизом и митохондриальным дыханием в различные периоды многочасовой инкубации отсеченных корней пшеницы
ГЛАВА ІV
ДЕЙСТВИЕ ДЖАТЕЛЬШХ ЯДОВ И МЕМБРАНОТРОШЮГО СОЕДИНЕНИЯ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТШНШ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ 121
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 136
ВЫВОДЫ 143
ЛИТЕРАТУРА *45
- Метаболические состояния митохондрии и физиологические состояния живой ткани
- Методика определения интенсивности дыхания
- Изменение барьерной функции мембран клеток корней I пшеницы в ходе многочасовой инкубации
- ДЕЙСТВИЕ ДЖАТЕЛЬШХ ЯДОВ И МЕМБРАНОТРОШЮГО СОЕДИНЕНИЯ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТШНШ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ
Метаболические состояния митохондрии и физиологические состояния живой ткани
Существенным достижением биоэнергетики явилась описанная Чансом (chance,Williams, 1956) способность нативных изолированных митохондрий поддерживать стационарные состояния. Эти устойчивые режимы активности были названы им метаболическими состояниями. Приведение митохондрий в то или иное состояние, по Чан-су, зависит от наличия трех основных факторов: I) субстратов окисления, 3) акцептора фосфата и 3) кислорода. Взаимодействие всех этих составляющих приводит к проявлению нескольких возможных стационарных состояний, описываемых характерными изменениями скоростей потребления кислорода и спектрофотометрически по соотношению окисленно-восстановленных форм дыхательных переносчиков.
Состояние I. митохондрии лишены экзогенных субстратов оісисления и акцепторов фосфата. Скорость дыхания мала.
Состояние 2. В системе имеется акцептор фосфата и нет субстратов окисления. Скорость дыхания мала.
Состояние 3. "Активное". Митохондрии обеспечены субстратами окисления и акцептором фосфата (АДФ). Происходит резкая стимуляция дыхания, которая ограничивается только скоростью проникновения субстратов в митохондрии и мощностью ферментов фосфорилирующего окисления.
Состояние 4. "Контролируемое", или "отрегулированное". В системе происходит исчерпание добавляемого акцептора фосфата. Скорость поглощения 02 резко падает по сравнению с состоянием 3.
Отношение скоростей дыхания в состоянии 3 и 4 носит название дыхательного, или акцепторного контроля.
Состояние 5. Митохондрии находятся в условиях избытка субстратов окисления и акцептора фосфата. Однако, в противоположность первым четырем состояниям в среде инкубации отсутствует кислород. Перенос электронов по цепи дыхательных переносчиков не происходит, так же как и процесс фосфорилирова-ния. Состояние 5 реализуется также в случае блокирования ци-тохромоксидазы, когда содержание кислорода достаточно высоко, но перенос на него электронов из дыхательной цепи отсутствует.
Спектрофотометрирование митохондрий в каждом из пяти состояний дает следувдие результаты: в состоянии 2 все дыхательные переносчики находятся в окисленной форме, в состоянии 5, напротив, дыхательные переносчики восстановлены, в состояниях I, 3 и 4 наблвдается частичное восстановление переносчиков.
Самостоятельным и уникальным развитием этого направления являются исследования М.Н. Кондрашовой, в которых определенные параметры метаболических состояний изолированных митохондрий используются для оценки свойств и реактивности животных тканей в разных функциональных состояниях. По мнению автора, это возможно благодаря тому, что митохондрии являются достаточно целостными осколками живой материи, сохраняющими ее основные свойства: сократимость, транспорт ионов, накопление энергии и даже наследственность ( Кондрашова, 1968 а).
Методика определения интенсивности дыхания
Объектом Исследования ЯВЛЯЛаСЬ Яровая ПШеНИЦа ( Triticum vuigare muticum L. ) сорта "МосковскаяяЗб", районированная в ТАССР. Для экспериментов использовали интактные и отсеченные корни 4-6 дневных проростков, так как они являются удобной моделью для проведения экспериментов в лабораторных условиях.
Семена замачивали в водопроводной воде и затем высевали на стекло, покрытое влажной марлей и помещенное в кювету с раствором СаС12 ( 2,5«ЯГ4 М). Такая методика выращивания позволяет избежать анаэробиоза, так как корни стелются по поверхности марли, закрепляются в ней, не испытывают недостатка во влаге. Кроме того, при подготовке к опыту растения с корнями легко извлекаются из марли без повреждений.
Корни сразу после отсечения помещались в используемые растворы и инкубировались 1-7 часов с умеренным встряхивали-ем. Измерения проводили каждый час ( в некоторых случаях через 2).
Повторноеть опытов 3-Ю кратная. Повторность вариантов 3-4 кратная. Все полученные результаты обработаны статистически по Вознесенскому (1969). Расчитывали стандартную ошибку средних значений. Расчеты проводили на микроэвм "Электроника ДЗ-28". О достоверности разницы между вариантами судили по критерию Стьюдента при уровне значимости 0,05.
В работе использовали специфические ингибиторы митохонд-риального дыхания: антимицин А (2»10 М) фирмы " Serva " (ФРГ), КСм (З ІО""3 М), малонат (2,5-Ю"4 М), и ротенон - 50 (Г (2«10 М) фирмы " serva "; мембранотрошюе соединение - аминазин (10 М) ; разобщитель окислительного фосфорилиро-вания -2, 4- динитрофенол ( 5 10"" и 10" М); ингибитор синтеза белка - циклогексимид (12 мг/л) фирмы " Serva "; ингилобиторы гликолиза: монойодацетат (2» ЯР и 10 М) фирмы "serva " и фторид натрия (5«I0 М ); соль KgS 04 {2 КГ М). Остальные реактивы отечественного производства. Растворы всех используемых соединений были приготовлены на контрольном растворе (2,5 ПГ4 М CaCl 2 ).
Изменение барьерной функции мембран клеток корней I пшеницы в ходе многочасовой инкубации
При изучении физиологии растительной клетки, несомненно, важным представляется исследование состояния поверхностной плазматической мембраны, поскольку она выполняет ряд ее основных физиологических функций. Среди них особое место принадлежит барьерной функции, обеспечивающей ионную избирательность и первый защитный барьер клетки на действие неблагоприятных факторов. В связи с этим особую роль приобретает изучение именно этой функции плазмалеммы по таким ее показателям, как мембранный потенциал, проницаемость для ионов К ( поскольку К ", как известно, является одним из важных функциональных элементов клетки, в частности, одним из основных по-тенциалопределяющих ионов), а также по характеру ответной реакции клетки на действие мембранотропных соединений. В качестве мембранотропного соединения нами был использован представитель ряда фенотиазинов - аминазин ( хлорпромазин). Учитывая особенности объекта исследования ( изолированных корней, подвергающихся многочасовому адаптивному старению в растворе СаС12 ) представлялось необходимым изучение влияния отсечения корней от целых проростков на эти параметры и их динамики в различные периоды адаптивного старения.
3.1.1. Изменение мембранного потенциала и проницаемости мембран клеток корней для ионов К . Отделение корней от интактных проростков оказывает повреждающее воздействие на их клетки. В частности, отсечение-корней сопровождается падением клеточного мембранного потенциала (рисі) и потерей клетками эндогенного калия (рис.2 ), что согласуется С литературными даННЫМИ (blertz, Higinbotham, 1976; Gronewald et al., 1979; Chastain et al.,1981;Gronewald e.a. 1982). В начальный двухчасовой период промывания корни практически не поглощают К , как вышедший эндогенный, так и из экзогенной соли KgS 04 ( рис.2,3). В некоторых случаях наблюдается даже выход внутриклеточного калия в солевой раствор (1,3 + 0,1 мкэкв/ г сырой массы за 2 часа ). Лаг-период в поглощении ионов калия отсеченными корнями кукурузы ( однако несколько мень-ший( описывается также Леонардом и Хансоном ( Leonard, Hanson , 1972 а).
Согласно литературным данным, изменение проницаемости клеточных мембран имеет место и при других неблагоприятных воздействиях на клетку. Оно отмечено при нарушении водного обмена клеток ( Simon , 1977, цит.: Чиркова, 1983, с.51), действии различных метаболических ядов ( Гордон и др., 1973; Артамонов,
Артамонова, 1975)., Охлаждении, Повышенной кислотности ( Christiansen et al. 1970), засухе ( Маркаров, 1976), при переходе клеток к опухолевому росту (Артамонов, Артамонова, 1975), при гипоксии и аноксии ( Гринева, 1961; Garrard .Humphrey, 1967; Christiansen et al. , 1970 ).
По вопросу о механизме изменения мембранной проницаемости нет единой точки зрения. Одни авторы связывают это с необратимым повреждением мембран ( Hiatt, Lowe, 1967, цит.: Чиркова, 1983, с. 51), другие считают, что изменение проницаемости при этом не всегда является следствием нарушения целостности мембран ( Гринева, 1961 ; Christiansen et al. , 1970).
Действие джательшх ядов и мембранотрошюго соединения в зависимости от физиологического состшнш корней пшеницы
Анализируя ранее описанные результаты по действию на клетки корней митохондриальных ядов и мембранотропного соединения, можно сделать вывод, что в целом ответная реакция корней на воздействия в начальный и конечный периоды промывания различна. Так, в течение первых двух часов ( деэнергизованное физиологическое состояние корней) используемые нами ингибиторы и мемб-ранотропное соединение действуют специфически ( рис.5,10-12). В то же время через 5 часов инкубации корней ( энергизованное состояние) наблюдается однотипная реакция ( стимуляция потребления О2) на добавление веществ, различных по характеру действия: дыхательного яда антимицина А, разобщителя окислительного фосфорилирования 2,4 - динитрофенола и мембранотропа аминазина ( рис. 5,8,10). Это привело к мысли о неспецифическом характере ответной реакции корней в этот период. Причина этого явления, по нашему мнению, заключается в следующем.
Принято считать, что любое воздействие на клетку в конечном счете приводит к энергетическому дефициту в митохондриях ( Кондрашова, 1971 б). Действительно, в наших экспериментах 2,4 - динитрофенол и антимицин А, добавленные через 5 часов промывания, деполяризуют мембрану корней ( табл.4) и вызывают выход эндогенного калия ( табл.3, рис.8,10). Как уже отмечалось, это приводит, по-видимому, к резкой активизации транспортной Н+ - АТФазы корней. Начало какого-либо процесса в клетке, который требует затраты макроэргической связи с фосфором, как известно, влечет за собой образование акцептора фосфата - ДЦФ. Как было показано ( раздел 3.2), митохондрии клеток корней к 4-5 часу, по всей вероятности, переходят в отрегулированное метаболическое состояние ( или близкое к этому состоянию). Основным фактором , обеспечивающим затормаживание транспорта электронов в этом состоянии, является фонд внутримитохондриальных богатых энергией соединений ( энергетическая форма регуЛЯЦИИ) ( Chance, Williams, 1956 ; Коццрашова, 1969). Метаболическое состояние 4 характеризуется почти полным отсутствием свободных акцепторов фосфата; ткань реагирует усилением дыхания на очень малое увеличение концентрации акцепторов фосфата (Кондрашова, 1969), Поэтому высвобождающийся ДЦФ в результате реакций, расщепляющих АТФ, по-видимому, и является основной причиной снижения энергетической регуляции и активизации транспорта электронов цепью накопления энергии ( стимуляции дыхания), то есть перехода митохондрий в активное метаболическое состояние. При этом регулятором скорости дыхания, как известно, становится сукцинатдегидрогеназа, реагирующая на действие тормозящих веществ.
Это подтверждается нами экспериментально. Так, стимуляция интенсивности дыхания, наблюдаемая при добавлении аминазина и 2,4 - динитрофенола через 5 часов адаптивного старения, снимается цианидом - ингибитором переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий ( рис. 18,19) С что еще раз свидетельствует о том, что резкое активирование дыхания в этих условиях обусловлено работой основной редокс-цепи митохондрий., а не развитием и включением альтернативных путей окисления).
