Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Электронтранспортная цепь митохондрий растений и окислительное фосфорилирование 8
1.2. Первый сегмент дыхательной цепи митохондрий 20
1.2.1. Строение и работа I сегмента митохондриальной дыхательной цепи 20
1.2.2. Ингибиторы I сегмента митохондриальной дыхательной цепи 23
1.3. Второй сегмент электронтранспортной цепи митохондрий 30
1.3.1. Строение и функционирование II сегмента дыхательной цепи митохондрий 30
1.3.2. Малонат как ингибитор сукцинатдегидрогеназы 33
1.3.3. Метаболизм малоновой кислоты в растениях 41
1.4. Альтернативные пути транспорта электронов митохондрий растений 46
1.4.1. Внешняя НАД(Ф)Н-дегидрогеназа и особенности окисления цитозольного НАД(Ф)Н митохондриями растений 46
1.4.2. Матриксная нечувствительная к ротенону НАД(Ф)Н-дегидрогеназа 53
1.4.3. Цианидрезистентная оксидаза 58
Глава 2. Объект и методы исследования 61
2.1. Объект исследования 61
2.2. Методы исследования 61
2.2.1. Определение интенсивности потребления кислорода 61
2.2.2. Определение теплопродукции отсечённых корней (темновая калориметрия) 62
2.2.3. Определение рН и содержания ионов К+в инкубационном растворе 62
2.2.4. Метод электронной микроскопии 62
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 65
3.1. Структурно-функциональная характеристика клеток отсечённых корней пшеницы при многочасовой инкубации 65
3.2. Ультраструктурные особенности митохондрий клеток отсечённых корней пшеницы при многочасовой инкубации в растворе ротенона 70
3.3. Структурно-функциональные изменения клеток корней пшеницы при блокировании II сегмента дыхательной цепи малонатом 87
3.4. Функционирование клеток отсечённых корней пшеницы при совместном ингибировании I и II комплексов дыхательной цепи митохондрий 103
Заключение 115
Выводы 117
Литература 11
- Ингибиторы I сегмента митохондриальной дыхательной цепи
- Внешняя НАД(Ф)Н-дегидрогеназа и особенности окисления цитозольного НАД(Ф)Н митохондриями растений
- Ультраструктурные особенности митохондрий клеток отсечённых корней пшеницы при многочасовой инкубации в растворе ротенона
- Функционирование клеток отсечённых корней пшеницы при совместном ингибировании I и II комплексов дыхательной цепи митохондрий
Введение к работе
Постановка проблемы и её актуальность. Известно, что электронтранспортная цепь (ЭТЦ) митохондрий растений содержит четыре стандартных ферментативных комплекса (I - IV), присутствующие в митохондриях всех организмов, и ещё пять дополнительных (альтернативных) ферментов. Одним из этих ферментов является цианид-резистентная оксидаза, на которую передаются электроны от убихинона. Остальные четыре переносчика представляют собой дегидрогеназы, транспортирующие электроны на убихинон. Две из них - НАДН- и НАДФН-дегидрогеназы, нечувствительные к ротенону (МНРД), расположенные на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны, окисляющие матриксный НАД(Ф)Н [172, ПО]. Две другие - внешние НАДН- и НАДФН-дегидрогеназы, локализованные на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, использующие цитоплазматический НАД(Ф)Н [134, 171].
В настоящее время хорошо изучена только цианид-устойчивая оксидаза. Её физиологическую роль связывают с защитой клеток растений от активных форм кислорода, когда степень восстановленности пула убихинона высока [117]. Также значение цианид-резистентной оксидазы основывается на том, что она может выступать в качестве фермента, который по механизму сверхпотока удаляет избыток углеводов, которые клетка не в состоянии полезно использовать (например, на синтез АТФ), или запасти [112, 111]. Между тем физиологическое значение четырёх альтернативных дегидрогеназ изучено очень слабо, несмотря на большое количество исследований, выполненных преимущественно на изолированных митохондриях [173, 108, 185]. Согласно гипотезе Moller и Palmer (1982) [172], матриксные нечувствительные к ротенону дегидрогеназы функционируют по механизму сверхпотока, без синтеза АТФ, при блокировании активности I сегмента ЭТЦ.
Активность двух внешних дегидрогеназ, как считает Moller, (2002) [171], возрастает при действии различных стрессоров, когда увеличивается концентрация
5
ионов Са2+ в цитозоле. Также предполагается, что включение внешней НАДФН-
дегидрогеназы способствует увеличению скорости цитозольного
пентозофосфатного пути, поскольку интенсивность функционирования этого процесса определяется концентрацией НАДФН в цитоплазме [136]. Однако отсутствие специфических ингибиторов внешней НАД(Ф)Н-дегидрогеназы и МНРД существенно затрудняет изучение данных ферментов. Практически нет работ по исследованию роли внешней НАД(Ф)Н-дегидрогеназы и МНРД в окислительном фосфорилировании, а также отсутствуют сведения о взаимосвязи ультраструктуры клеток с функционированием указанных дегидрогеназ. Между тем применение ингибиторов I и II сегментов дыхательной цепи должно привести к активации альтернативных путей переноса электронов, что не может не отразиться на изменении ультраструктуры митохондрий.
В качестве ингибитора I сегмента ЭТЦ обычно используют ротенон. Действие ротенона и других ингибиторов I сегмента изучено достаточно хорошо только на изолированных митохондриях и субмитохондриальных частицах [23, 208, 198]. В немногочисленных работах, в которых действие данного ингибитора изучалось на целых растительных тканях [6, 19, 106], исследования ультраструктурных изменений в клетках не проводились. В других работах, выполненных на клетках и тканях животных, уделялось внимание изучению ультраструктуры клеток [119, 28, 84]. Однако вышеуказанные эксперименты проводились либо в течение очень короткого промежутка времени, либо при длительном инкубировании, где материал для изучения ультраструктуры клеток отбирался с большими временными интервалами, что не позволило авторам выявить изменения как в структуре митохондрий, так и в целых клетках.
Для блокирования II сегмента ЭТЦ, как правило, используют конкурентный ингибитор малонат. Действие малоновой кислоты на физиологические параметры клеток растений также достаточно хорошо изучено [29, 98, 45, 20]. Однако ультраструктурные изменения митохондрий и в клетках в целом не изучались.
В связи с этим, особый интерес представляет изучение ультраструктурной организации митохондрий при блокировании I и II сегментов дыхательной цепи и динамики структурно-функциональных изменений, происходящих в клетках при данных воздействиях.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение структурно-функциональных изменений в корнях пшеницы при ингибировании I и II сегментов дыхательной цепи митохондрий. В связи с этим в задачи исследования входило:
Изучить изменения интенсивности поглощения кислорода, К+/Н+-обмена клеток отсечённых корней пшеницы в ходе 6-часовой инкубации с ротеноном и малонатом.
Выявить изменения ультраструктуры митохондрий при ингибировании I и II сегментов ЭТЦ.
Проследить за ультраструктурными изменениями в клетках корней, вызванными блокированием дыхательной цепи митохондрий ротеноном и
малонатом.
4. Изучить адаптационные возможности клеток отсечённых корней
пшеницы при одновременном блокировании I и II сегментов ЭТЦ митохондрий.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование структурно-функциональных изменений в клетках корней пшеницы при многочасовом воздействии ротенона и малоната. Показано, что действие ингибиторов I и II сегментов ЭТЦ митохондрий на дыхательную активность и К+/Н+-обмен имеет двухфазный характер: подавление интенсивности дыхания, сопряженное с потерей клетками ионов калия в первые 1-3 часа сменяется стимуляцией дыхания, сопряженной с поглощением вышедшего из клеток К+ к 6 часу. В условиях блокирования митохондриального транспорта электронов выявлен широкий спектр морфологических изменений митохондрий. В клетках появлялись органеллы тороидальной формы, способствующие, вероятно, окислению цитоплазматического НАД(Ф)Н через внешний митохондриальный путь, а также митохондрии с электронно-прозрачным матриксом и увеличенными размерами. Были обнаружены множественные контакты митохондрий с каналами
7 эндоплазматического ретикулума, липидными каплями и пластидами, что отражает функционирование компенсаторно-репарационных процессов, способствующих началу адаптации клеток корней к воздействию ротенона и малоната.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют существенно углубить понимание вопроса регуляции митохопдриального дыхания на уровне растительных тканей и характера взаимоотношений структуры и функции митохондрий и других органелл, а также о компенсаторной роли альтернативных путей транспорта электронов митохондриальной дыхательной цепи. Экспериментальные данные и методические приёмы, изложенные в работе, могут быть использованы в биологических учреждениях, занимающихся изучением энергетического обмена и ультраструктуры клеток, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по физиологии, биохимии и цитологии растений в ВУЗах.
Ингибиторы I сегмента митохондриальной дыхательной цепи
Группой английских исследователей в лаборатории Джона Уокера в 1994 году было выявлено, что в каталитический комплекс входят три Р-субъединицы и три а-субъединицы, которые расположены, чередуясь подобно долькам апельсина, образуя каталитический ансамбль азРз- Три протомера (в состав каждого протомера входит а и Р субъединицы) отличаются друг от друга и конформационно, и по связанным с ними нуклеотидам, что подтверждает наличие механизма синтеза АТФ по принципу связывание-обмен. В первом протомере происходит присоединение АДФ и Фн (L-состояние), во втором - прочное связывание АДФ с Фн (Т-состояние), в третьем - высвобождение вновь синтезированной АТФ (О-состояние). Свободная энергия, выделяющаяся при транспорте протонов, требуется для поддержания этих трёх состояний. При этом у-субъединица, как стержень, вставлена внутрь каталитического комплекса. Между а- и Р-субъединицами обнаружены высокогидрофобные взаимодействия, что обеспечивает возможность вращения у-субъединицы внутри полости, образуемой в каталитическом центре фермента (рис. 2) [202, 180, 63]. В лаборатории Токийского института в 1997 году Масасуке Ешида с коллегами удалось визуально зарегистрировать вращение у-субъединицы, к которой был прикреплён актиновый филамент под действием АТФ со скоростью 4 оборота в секунду. Поскольку размеры актинового филамента значительно превышали размеры ферментативного комплекса, реальная скорость вращения у-субъединицы должна быть гораздо выше [155].
Первый сегмент (НАДН-убихинон-оксидоредуктаза или комплекс I) митохондрий растений обладает теми же свойствами, что и комплекс I Neurospora crassa и сердца быка. Это основной фермент, который задействован в окислении матриксного НАДН, потому что у него низкая константа Михаэлиса-Ментена (Km) для НАДН, a Km для НАДФН - очень высокая [175].
Комплекс I бактерий обладает молекулярной массой 530 кДа, состоит из 14 различных субъединиц и представляет собой малую структурную форму комплекса I эукариот. Митохондриальный комплекс I эукариот в дополнение к 14 прокариотическим субъединицам содержит 29 других белков, которые увеличивают молекулярную массу первого сегмента до 1мДа. Комплекс I эукариот состоит из двух доменов, один из которых находится в мембране, очень гидрофобен и содержит субъединицы, гомологичные гидрофобным полипептидам прокариот, кодирующиеся в митохондрионе. Другой домен является периферическим, выступает в матрикс и состоит из субъединиц, кодирующихся в ядре [198, 183, 192]. Редокс-группы фермента локализованы в периферическом домене, который и работает как НАДН-дегидрогеназа. Мембранный участок производит восстановление убихинона и, возможно, осуществляет транслокацию протонов [183]. Считается, что эти домены возникли в процессе эволюции независимо друг от друга [207].
По результатам электронно-микроскопических изображений изолированного препарата I сегмента Neurospora crassa, данный комплекс напоминает «ботинок» (структуру L-формы), погружённый в мембрану (рис. 3). Тот факт, что бактериальный комплекс I так же представляет собой L- структуру, показывает, что данная форма сохранилась в процессе эволюции и необходима для функционирования I сегмента [183, 9]. Когда в клетках Neurospora crassa синтез митохондриальных белков заингибирован хлорамфениколом, формируется малая форма комплекса I, которая нормально функционирует [114]. Малая форма НАДН-убихинон-оксидоредуктазы имеет подобное сродство к НАДН, как и комплекс I, но отличается по сайту связывания для убихинона, который имеет меньшую совместимость и нечувствителен к ингибиторам I сегмента [207].
Согласно современным представлениям, в транспорте электронов в комплексе I митохондрий сердца быка задействован ФМН, 4 железо-серных кластера (N1-N4) и интегральный хинон (Q) (рис. 3). Отношение Н+/2ё соответствует 4. Два Н+ транслоцируются хиноном, а другие два Н+ переносятся пока неизвестным механизмом (пунктирная линия) [192]. Кластеры N-1, N-3 и N-4 формируют изопотенциальную группу с центральной точкой потенциалов -250тV. Кластер N-2 имеет более положительный потенциал - от -50 до -150 mV. Таким образом, матриксный НАДН связывается с 50-кДа субъединицей, которая направляет два электрона на подобную субъединицу, связанную с ФМН. От ФМНН2 электроны транспортируются на (2Fe-2S) кластер N-1, который так же связан с 50-кДа субъединицей, а затем на (4Fe-4S) кластеры N-3 и N-4, которые связаны с 75-кДа субъединицей. Далее электроны транспортируются на кластер N-2, который направляет их на убихинон, что приводит к образованию протеин-связанного убисемихинона [207, 125].
Предполагается, что между кластерами N-1, N-3 и N-4 и высокопотенциальным N-2 есть связующее звено в виде внутреннего убихинона. Доказательство этого предположения исходит из открытия малой формы комплекса І у Neurospora crassa, где содержится участок восстановления убихинона, отличающийся от такового участка в комплексе I [114]. Таким образом, участок связывания убихинона малого комплекса может сохраняться как сайт для внутреннего убихинона комплекса I. Хинон, скорее всего, выступает в качестве электронного медиатора между низкопотенциальными кластерами N- 1, N - 3, N - 4 и высокопотенциальным кластером N-2 и, следовательно, может работать как убихиноновый цикл. Скорее всего, внутренний сайт окисления убихинона находится в гидрофобной фракции комплекса I [207].
Внешняя НАД(Ф)Н-дегидрогеназа и особенности окисления цитозольного НАД(Ф)Н митохондриями растений
В настоящее время принято считать, что в электронтранспортной цепи митохондрий растений имеется два участка окисления экзогенного пула пиридиннуклеотидов - внешняя НАД(Ф)Н-дегидрогеназа, локализованная на внешней стороне внутренней мембраны и ротенон-антимицин А-нечувствительная НАДН-дегидрогеназа, расположенная на внешней мембране митохондрий, которая характерна и для органелл животных клеток [135, 110, 175].
Наличие внешней НАД(Ф)Н-дегидрогеназы является отличительной особенностью митохондрий растительных клеток, грибов и многих микроорганизмов, поскольку животные органеллы лишены данной дегидрогеназы и используют для этой цели челночные механизмы.
Ленинджер обнаружил, что НАДН, добавленный в суспензию с митохондриями животных, не окисляется, в то время как митохондрии растений способны окислять добавленный НАДН с высокой скоростью. Использование феррицианида и изотопов для оценки целостности внутренней мембраны митохондрий растений показало, что способность к окислению экзогенного НАДН не вызвана повреждением этой мембраны. Одним из наиболее ярких примеров окисления внешнего НАДН выявлен в термогенном спадиксе ароидных, в частности, у Arum maculatum, где скорость окисления НАДН достигает 7цМ/мин на мг белка. Есть основания полагать, что окисление внешнего НАДН в митохондриях растений Arum связано с альтернативной оксидазой [136].
Поскольку внешняя НАД(Ф)Н-дегидрогеназа транспортирует электроны на убихинон в обход от первого пункта сопряжения, окисление цитозольного НАД(Ф)Н не ингибируется ротеноном, чувствительно к антимицину А и имеет соотношение АДФ/О, подобное сукцинату. Так как той энергии, которая освобождается при окислении цитоплазматического НАД(Ф)Н (73 кДж/2электрона) на участке между пиридиннуклеотидами и убихиноном недостаточно для транслокации протонов и поэтому она рассеивается в виде тепла [172, 136, 191].
В настоящее время предполагается существование двух независимых дегидрогеназ, локализованных на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, активность которых регулируется микромолярными концентрациями Са2+ и ингибируется хелаторами кальция, такими как ЭДТА и ЭГТА [134]. Одна из дегидрогеназ специфична для НАДН, другая - для НАДФН. Данное предположение сделано на основании того, что, во-первых, оптимум рН для НАДФН ниже, чем для НАДН, а, во-вторых, ответная реакция окисления внешнего НАДФН и НАДН на хелаторы довольно различные [136]. Кроме того, скорость окисления НАДФН в несколько раз ниже скорости окисления НАДН [109]. Следует отметить, что в отличие от интактных митохондрий, у которых окисление экзогенного НАД(Ф)Н стимулируется катионами и подавляется хелаторами, эти вещества не оказывают или имеют слабое влияние на активность выделенного фермента. Возможно, что стимуляция катионами и снижение величины рН окисления митохондриями растений экзогенного НАД(Ф)Н обусловлено в значительной степени экранированием отрицательного поверхностного заряда мембраны [110]. Очень мало известно о полипептидной композиции этих внешних дегидрогеназ. В немногочисленных работах были предприняты попытки выделить и очистить препараты дегидрогеназ из соцветий цветной капусты и спадиксов Arum maculatum. Было обнаружено, что данные ферменты содержат флавопротеин (возможно, ФАД) и лишены железо-серного центра, а возможно, данный компонент был потерян при очистке препаратов [136, 110]. В последние годы был сделан прорыв в понимании молекулярной биологии окисления внешнего НАД(Ф)Н. Так, при исследовании дыхательной активности митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae был обнаружен ген Ndhlp, при удалении которого дыхание изолированных митохондрий, использовавших НАДН в качестве субстрата, уменьшалось в 4 раза [195]. В митохондриях Neurospora crassa идентифицировали ген NDE1, кодирующий белок, который содержит Са -связывающий участок и соответствует внешней НАДФН-дегидрогеназе [171].
Так же очень мало известно о регуляции активности внешней НАД(Ф)Н-дегидрогеназы. По мнению Moller (1997, 2002) [174, 171], окисление внешнего НАД(Ф)Н осуществляется в основном при стрессовых условиях, когда благодаря возрастающей концентрации свободного Са в цитоплазме происходит активация внешних дегидрогеназ.
Известен только один ингибитор внешней НАДН-дегидрогеназы - платанетин. Это 3,5,7,8-тетрагидрокси,6-изопренилфлавон, изолированный из почечных чешуи платана. 50% ингибирование достигается при микромолярной концентрации указанного соединения [134]. Однако, как сообщается в работе Roberts с сотр. (1996) [185], данный ингибитор не является специфическим, поскольку блокирует и ротенон-нечувствительное окисление матриксного НАД(Ф)Н.
Предполагается, что прямое окисление цитозольного НАД(Ф)Н строго модулируется субстратами окисления (малат, пируват и т.д.) [136]. В работе Small, McAlister-Henn (1998) [195] показано, что в дрожжевых клетках Saccharomyces cerevisiae цитозольный изофермент малатдегидрогеназы (при функционировании которого происходит восстановление НАД+ до НАДН в цитоплазме) выполняет комплементарную или дополнительную роль в отношении окисления экзогенного НАДН. Так же было обнаружено, что малонат в присутствии сукцината способен «переключать» митохондрии на использование экзогенного НАДН, хотя сам по себе сукцинат тормозит окисление цитоплазматического НАДФН [109].
Не исключена вероятность того, что активность внешней НАДФН-дегидрогеназы регулируется полиаминами. В работе Rugolo с сотр. (1991) [138] на митохондриях иерусалимского артишока {Helianthus tuberosus) было обнаружено, что такие полиамины как спермин и спермидин уменьшали Km внешней дегидрогеназы для свободных ионов Са и, таким образом, увеличивая её активность. В связи с тем, что полиамины ингибируют фосфолипазу С и усиливают инозитол-фосфатный синтез, авторы предположили, что спермин и спермидин могут быть важными цитоплазматическими факторами, воздействующими на митохондриальное окисление экзогенного НАДН in vivo.
По-видимому, функционирование внешних дегидрогеназ оказывает довольно большое влияние на метаболизм клеток, несмотря на то, что митохондрии растений предпочитают окислять преимущественно эндогенный НАДН матрикса. Показано, что процесс окисления НАДФН митохондриями может увеличивать скорость цитозольного пентозофосфатного пути, поскольку самый эффективный контроль этого процесса зависит от концентрации НАДФН в цитоплазме. Окисление НАДФН может влиять на скорость метаболизма цитрата посредством конверсии цитрата в а-кетоглутарат в присутствии цитозольной НАДФ-изоцитрат-дегидрогеназы и аконитазы. При этих условиях окисление НАДФН митохондриями может играть значительную роль в процессе клеточного роста, поскольку обеспечение субстратами (пентозо-фосфат, эритрозо-фосфат, а-кетоглутарат и др.) для биосинтетических целей более важно, чем обеспечение НАДФН [136].
Ультраструктурные особенности митохондрий клеток отсечённых корней пшеницы при многочасовой инкубации в растворе ротенона
В физиологии растений отсеченные корни проростков различных растений являются одним из популярных объектов биологических исследований. Ценность использования корней в качестве модельной системы заключается в том, что, во-первых, при отсечении в значительной степени сохраняется структурно-функциональная целостность клеток и тканей, а, во-вторых, корни представляют собой одну из наиболее активных частей растения, где сосредоточено почти все разнообразие метаболических реакций, свойственных гетеротрофным тканям [32, 77]. Ещё одним преимуществом использования корней в качестве модельной системы перед другими частями растения заключается в том, что зоны деления и растяжения пространственно разделены, а в клетках междоузлий, листьев, колеоптилей деление происходит одновременно с растяжением [71]. Необходимо отметить, что эта модельная система (отсеченные корни, подвергнутые многочасовой инкубации) обладает рядом особенностей, которые подробно рассмотрены в работах Л.Х. Гордона (1992) [21] и В.М. Пахомовой (1984, 2001) [78, 77]. В этих исследованиях описывается изменение физиологического состояния отсеченных корней от деэнергизованного в первые часы инкубации до энергизованного к 5-6 часу.
Отсечение корней от интактных проростков и их инкубация в контрольном растворе, как правило, сопровождались небольшим выходом ионов калия в первые часы эксперимента (рис. 11, 21, 28). При этом наблюдалось увеличение интенсивности потребления кислорода клетками корней. С увеличением времени инкубации происходило поглощение клетками вышедших ионов калия, а уровень дыхательного газообмена возвращался к исходным значениям (рис. 10, 20).
Наблюдаемые нами изменения физиологических параметров в клетках отсечённых корней, по-видимому, отражают течение адаптационных процессов и хорошо согласуются с работами Л.Х. Гордона (1992) [21] и В.М. Пахомовой (1984, 2001) [78, 77]. Согласно этим данным, отсечение корней от проростка и перенесение их в инкубационный раствор сопровождается неспецифическими изменениями ряда физиологических показателей. Так, выход ионов калия в инкубационный раствор, вызванный отсечением корней от проростков, видимо, связан с увеличением проницаемости плазмалеммы для этого иона и передвижением его по градиенту концентрации. Увеличение проницаемости плазматической мембраны для ионов является индикатором перехода клеток в возбуждённое состояние и одновременно первым признаком влияния стрессирующего фактора. В первые 2 часа после отсечения корней в клетках повышается содержание свободных жирных кислот, которые являются индукторами проницаемости мембран. Происходит снижение степени насыщенности жирнокислотных остатков фосфолипидов мембран, посредством чего достигается уменьшение жёсткости мембран [21,41].
К окончанию эксперимента происходит нормализация физиологических функций клеток корней, что является признаком перехода клеток в состояние относительного покоя. К этому времени в корнях исчезают свободные жирные кислоты, повышается жёсткость мембран (увеличивается соотношение насыщенности/ненасыщенности жирнокислотных остатков фосфолипидов) и снижение (до минимума) ионов К+ в среде инкубации благодаря элиминации (возможно, с закрыванием) пассивных каналов утечки К+ и активному закачиванию К+. Всё это даёт возможность восстановить клеткам физиологические показатели, нарушенные отсечением, вследствие чего интенсивность поглощения кислорода возвращалась к исходным значениям [21].
Электронно-микроскопические исследования показали, что в течение 6 часов инкубации ультраструктура клеток корней контрольных вариантов не отличалась от нативных растений. Основная часть митохондрий имела ортодоксальный вид (округлая форма, средняя плотность матрикса и многочисленные слабовыраженные кристы) (рис. 8, 9). Эндоплазматический ретикулум был представлен отдельными каналами, к мембранам которых прикреплены многочисленные рибосомы (шероховатый эндоплазматический ретикулум); в цитоплазме встречались диктиосомы аппарата Гольджи и пластиды. Строение ядра характерно для интерфазы: гетерохроматин располагался равномерно по всему объёму (рис. 9 а). В цитоплазме в большом количестве встречались как свободные рибосомы, так и полисомы в виде розеток. Следовательно, ни сам процесс отсечения корней от проростков, ни их дальнейшая 6-часовая инкубация в растворе хлорида кальция, существенным образом не отражались на ультраструктуре клеток.
Исходя из вышесказанного, следует заключить, что изменения физиолого-биохимических показателей являются неспецифической ответной реакцией клеток на отсечение корней, которые не отражаются на ультраструктуре митохондрий и клеток в целом в процессе многочасовой инкубации.
Функционирование клеток отсечённых корней пшеницы при совместном ингибировании I и II комплексов дыхательной цепи митохондрий
Как и в предыдущих опытах, в клетках контрольных вариантов на протяжении всего эксперимента митохондрии были ортодоксального типа (рис. 15 а; 16 а). Через 5 и 10 минут действия ингибитора небольшое количество митохондрий приобретало слегка конденсированный вид (рис. 15 б). Через 20 минут в клетках опытных растений содержались как ортодоксальные, так и слегка просветлённые митохондрии с уменьшенным количеством крист (рис. 17 а). Большинство органелл имело тороидальную форму (рис. 16 б), в цитоплазме клеток появлялись светлые липидные капли, многие из которых контактировали с каналами эндоплазматического ретикулума (ЭР) (рис. 17 б). Кроме того, наблюдались множественные контакты митохондрий с пластидами (рис. 18 б).
Наличие митохондрий тороидальной формы в клетках растений отмечали и другие исследователи [30, 15], которые предполагали, что такая структура связана с адаптацией клеток к действию стрессоров. Однако причина появления тороидальных митохондрий авторами данных работ не объяснялась. Согласно нашему предположению, наличие митохондрий тороидальной формы связано с активацией одного из альтернативных путей транспорта электронов - внешней НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, которая локализована на внешней стороне внутренней мембраны и использует цитоплазматический НАД(Ф)Н. Форма тороида способствует увеличению площади внешней поверхности митохондрий при их неизменном объёме, а следовательно, возрастанию числа молекул НАД(Ф)Н, способных диффундировать из цитоплазмы в межмембранное пространство митохондрий. Окисление внешнего НАД(Ф)Н, как показано на митохондриях Endomyces magnusii, осуществляется с высокой скоростью [38]. При этом электроны поступают в дыхательную цепь, на уровне убихинона, минуя первый пункт сопряжения [108]. Восстановление НАД(Ф)Н в цитоплазме происходит либо в процессе гликолиза, либо пентозофосфатного пути.
В свою очередь активность цитоплазматического гликолиза, как показано в работе Dinesku-Romalo с сотр. (1978) [133], могла усиливаться в результате 82 воздействия ротенона. Также считается, что митохондрии при снижении дыхательной активности (вследствие ингибирования ЭТЦ или цикла Кребса) выделяют в цитоплазму два фактора, стимулирующих гликолитический процесс. Первый содержит все коферменты гликолиза (АДФ, АМФ, НАД). Его стимулирующее действие на гликолиз связано с увеличением концентрации АТФ, доступной для гексокиназных и фосфофруктокиназных реакций. В состав второго фактора входит липопротеид киназин, активирующий фосфоглицераткиназу гликолиза как аллостерический эффектор. Предполагается, что первый фактор действует до того момента, пока концентрация коферментов гликолиза достигнет уровня, насыщающего гликолитическую систему. Дальнейшая стимуляция гликолиза митохондриями происходит за счет выделения киназина. Уровень внутримитохондриальной АТФ считается решающим фактором, определяющим проницаемость мембран митохондрий. При высоком уровне АТФ киназин и АТФ удерживаются благодаря взаимодействию с митохондриальным актомиозином и не проникают в цитоплазму. При снижении внутримитохондриального соотношения АТФ/АДФ взаимодействие актомиозина (конформационные изменения этого белка обуславливают конформационные изменения митохондрий типа набухание -сокращение) и АТФ ослабевают, в результате нуклеотиды освобождаются из митохондрий и переходят в цитоплазму, тем самым, активируя гликолиз [77, 70].
Возможно, подобная активация гликолитического процесса происходила через 20 минут действия ротенона, о чём свидетельствует наличие просветлённых митохондрий в это время (рис. 17 а). Однако, поскольку активность ЭТЦ в результате ингибирования I сегмента заторможена, а гликолиз, либо пентозофосфатный путь активированы, вероятно, возникал излишек продуктов анаэробного распада, который, направлялся на синтез липидов.
Наличие в цитоплазме липидных капель, скорее всего, является следствием синтеза липидов de novo, о чём свидетельствуют их контакты с каналами ЭР (рис. 17 б), где, как известно, осуществляется синтез жирных кислот [152, 177, 141]. Также в цитоплазме встречались каналы ЭР, которые одновременно контактировали с липидными каплями и с пластидами (рис. 18 а). Учитывая то, что в пластидах, в том числе и в нефотосинтезирующих, имеются ферменты гликолиза, пентозофосфатного цикла [141] и липогенеза [184], можно предположить, что и метаболиты пластид участвуют в биосинтезе жирных кислот.
В дальнейшем липиды могут использоваться в качестве эффективного источника энергии, что подтверждается сближением липидных капель с митохондриями (рис. 13 а). Подобные контакты митохондрий с липидными каплями характерны для репарационных процессов и характерны, например, для посттравматической регенерации животной ткани [66].
Кроме этого, в цитоплазме наблюдали контакты митохондрий с пластидами, большая часть которых содержала крахмальные зёрна (рис. 18 б), что, вероятно, связано с поступлением метаболитов в митохондрии из пластид для дополнительного снабжения цикла Кребса.
Через 30 минут и в последующее время инкубации в клетках встречались как ортодоксальные, так и конденсированные митохондрии (рис 19 б). Количество тороидальных митохондрий на просматриваемых срезах значительно уменьшалось, что, по-видимому, является следствием включения таких альтернативных путей переноса электронов, как сукцинатдегидрогеназа и матриксная, не чувствительная к ротенону НАД(Ф)Н - дегидрогеназа. Данное предположение согласуется с исследованиями [17, 208, 210], в которых указывается, что ротенон активирует работу указанных дегидрогеназ.
