Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. 7
1.1. Роль цитокининов в регуляции соотношения скорости роста побега и корня как адаптивная реакция растений. 7
1.2. История открытия, механизм действия, методы количественного определения и метаболизм цитокининов.
1.2.1. Открытие и физиологическая активность цитокининов. 8
1.2.2. Количественное определение цитокининов . 10
1.2.3. Цитокинины в роли корневых сигналов. 11
1.2.4. Метаболизм цитокининов. 14
1.2.5. Транспорт цитокининов. 23
1.2.6. Внутриклеточный сигналинг цитокининов 26
1.2.7. Представления о механизмах влияния цитокининов на соотношение массы побега и корня
1.2.7.1. Влияние цитокининов непосредственно на рост побегов и корней через регуляцию деления и дифференциации клеток . 30
1.2.7.2. Донорно-акцепторные отношения и участие цитокининов в их регуляции. 33
1.2.8. Температурные воздействия как способ изменения содержания цитокининов в растениях. 38
2. Объекты и методы исследований. 41
2.1. Объекты исследований и условия проведения опытов. 41
2.2. Экстракционная очистка абсцизовой кислоты . 42
2.3. Экстракция и разделение цитокининов. 43
2.4. Иммуноферментный анализ цитокининов и АБК 44
2.5. Иммуногистохимическое выявление цитокининов на срезах листьев. 45
3. Результаты и обсуждение 47
3.1. Роль цитокининов в регуляции соотношения корень/побег у
растений пшеницы при изменении температуры 47
3.3. Влияние тотального и локального теплового шока на соотношение массы побега и корня у HSIPT-трансгенных и нетрансформированных растений табака . 68
3.4. Влияние вторично активного транспорта на содержание цитокининов в побегах и корнях растений пшеницы в норме и после действия теплового шока. 85
Заключение 92
Выводы 97
Список литературы 98
- Количественное определение цитокининов
- Влияние цитокининов непосредственно на рост побегов и корней через регуляцию деления и дифференциации клеток
- Экстракционная очистка абсцизовой кислоты
- Влияние тотального и локального теплового шока на соотношение массы побега и корня у HSIPT-трансгенных и нетрансформированных растений табака
Количественное определение цитокининов
Скоро исполнится 60 лет с того года, когда в литературе появилась первая публикация Скуга и Миллера, посвященная цитокининам (Skoog, Miller, 1957). Их открытие связано с культивированием тканей растений in vitro. Для того, чтобы стимулировать деление клеток при их культивировании вне растения на искусственной среде, к ней добавляли самые разнообразные вытяжки растительного и животного происхождения. Так была испытана автоклавированная сперма лосося, и она оказалась способной стимулировать деление клеток. Оказалось, что ее действующим началом является производное аденина, названное впоследствии кинетином. Это аденин, содержащий циклический радикал фурфурила в шестом положении пуринового кольца. Такая же способность стимулировать деление клеток в культуре тканей растений была обнаружена у экстракта из незрелых семян кукурузы (Letham, 1963). В нем также было идентифицировано действующее начало, и опять им оказалось производное аденина. На этот раз в том же положении пуринового кольца аденина вместо фурфурильного был радикал гидроксиизопентенила. Вещество получило название зеатин. Дальнейшие исследования показали, что кинетин и зеатин стимулировали не только деление клеток, но и регенерацию побега в культуре клеток. Они оказались необходимы для формирования и поддержания делений в апикальной меристеме побега (Rupp et al., 1999; Werner et al., 2003), дифференциации клеток мезофилла листа, индуцируя образование хлоропластов и синтез хлорофилла и ферментов, необходимых для фотосинтеза (Хохлова и др., 1971; Forde, 2002; Чернядьев, 2000; Vandenbussche et al., 2007). Эксперименты in vitro показали, что соотношение цитокининов и ауксинов в культуральной жидкости определяет характер морфогенеза (Skoog, Miller, 1957). На фоне высокого соотношения цитокининов/ауксинов наблюдалась регенерация побегов, а изменение соотношения в пользу ауксинов инициировало образование корней. Обработка растений препаратом цитокининов влияла на протекание множества процессов: задерживала старение листьев (ингибировала распад хлорофилла, что является индикатором старения (Singh et al., 1992)), снимала апикальное доминирование и стимулировала рост боковых побегов (Tanaka et al., 2005), подавляла рост корневой системы (Banowetz, 1997), влияла на цветение (Thomas et al., 1995), увеличивала массу плодов, количество и массу зерен в колосьях (Zhang et al., 2010). Цитокинины влияли не только на процессы, связанные с ростом и морфогенезом растений. Обработка цитокининами сказывалась на активности процессов, играющих важную роль в адаптации растений к условиям обитания. Так цитокинины поддерживали устьица в открытом состоянии, что играет важную роль в регуляции потери воды за счет транспирации (Blackman, Davies, 1983). При этом важной особенностью цитокининов оказалась их высокая активность, т.е. способность действовать на растения в очень низких концентрациях. Широкий спектр активности цитокининов и высокая чувствительность к ним у растений, а также тот факт, что цитокинины были обнаружены практически во всех изученных растениях, послужили основанием для того, что их стали считать эндогенными растительными гормонами наряду с ранее открытыми ауксинами.
Обнаружение и количественное определение цитокининов всегда представляло большую сложность. Это было связано с тем, что они содержатся в растениях в крайне низкой концентрации, а по своим физико-химическим свойствам близки к соединением (компонентам нуклеиновых кислот), содержание которых на порядок выше. Поэтому их спектрофотометрическое определение требует интенсивной очистки, которая сопровождается потерями. Изучение цитокининов было связано с развитием метода масс-спектрометрии, основанного на определении массы заряженных частиц по их отклонению в электромагнитном поле. С помощью этого метода удалось идентифицировать цитокинины и их метаболиты после их очистки (Cowley et al., 1978), а современные методы масс-спектрометрии (МС) в сочетании с хроматографией позволяют проводить идентификацию и количественное определение цитокининов в менее очищенном образце (Prinsen et al., 1995; Novak et al., 2008).
Вместе с тем, много важных данных было получено до того, как МС-методы начали более широко применяться в физиологии растений. Их удалось получить благодаря методу биотестирования. Этот метод основан на способности цитокининов вызывать определенные изменения в тканях растений. Так для оценки количества цитокининов использовали каллусную ткань (например, Faiss et al., 1996). Добавление к каллусу, культивируемому in vitro, растительного экстракта стимулировало деление клеток и рост каллуса, что было обусловлено присутствием в экстракте цитокининов. Сравнивая уровень ростстимулирующего эффекта с действием стандарта цитокининов, можно было полуколичественно определить содержание этих гормонов в экстракте. Позднее был разработан менее трудоемкий метод биотестирования, основанный на стимуляции под влиянием цитокининов синтеза пигмента амарантина у растений щирицы (Holub et al., 1998; Romanov, et al., 2000). Вместе с тем, присутствие ингибиторов занижало результаты биотестирования. Это было связано с тем, что в растениях содержатся соединения, являющееся антагонистами цитокининов. Так АБК подавляет образование амарантина и рост каллусных клеток (Romanov et al., 2002).
Значительный прогресс в области количественного определения цитокининов был достигнут благодаря применению иммунохимических методов. Одному из первых антитела к цитокининам удалось получить Е. Вайлеру c соавторами (Eberle et al., 1986). Гормоны являются гаптенами и сами по себе они не способны стимулировать образование антител. Иммуногенность (т.е. способность стимулировать образование антител при введении животным) гормоны приобретают, если их конъюгировать с белками носителями. Такая работа была проведена и получены антитела к гормонам. Для определения с их помощью цитокининов был разработан метод иммуноферментного определения, основанный на детекции антител по активности конъюгированных с ними ферментов. В России этот метод для определения гормонов независимо от Вайлера был разработан С.Ю. Веселовым (Веселов, 1998).
Влияние цитокининов непосредственно на рост побегов и корней через регуляцию деления и дифференциации клеток
Цитокининами принято называть достаточно широкий спектр веществ, производных аденина, которые проявляют в биотестах цитокининовую активность, а также их неактивные метаболиты. Изучение метаболитов, которые образуются в растениях при введении меченных производных аденина и оценка in vitro ферментативной активности экстракта из растений показало, что первым цитокинином, который образуется в растениях, является не производное свободного основания (аденина), а нуклеотид изопентениладенина (Horgan, 1992). Это соединение является производным аденозин монофосфата, у которого в шестом положении пуринового кольца содержится пятичленный изопреноидный радикал. Фермент, катализирующий превращение аденинозин монофосфата в изопентениладенозин монофосфат, был назван изопентенилтрансферазой. Из-за низкой активности этого фермента его долго не удавалось очистить. В результате его первичная структура и кодирующий его ген долго оставались загадкой. Сначала ген, кодирующий изопентенилтрансферазу, был обнаружен у опухолестимулирующих бактерий Agrobacterium tumifaciens (Barry et al., 1985). Эти бактерии имеют Ti плазмиду, которая при инфицировании растений данными бактериями встраивается в геном растений (Medford et al., 1989).
Трансформированные клетки растений приобретают способность к активному делению, что приводит к образованию опухолей (Пирузян, Андрианов, 1995; Ullrich, Aloni, 2000). При культивировании in vitro таких клеток они активно делились без добавления гормонов. Оказалось, что это связано с тем, что при трансформации они получают от бактерий ген изопентенилтрансферазы (ipt) и приобретают способность автономно синтезировать цитокинины. Ti плазмиды нашли широкое применение как векторы для трансформации двудольных растений. Удаление из этой конструкции определенных генов лишало плазмиду способности стимулировать опухолеобразование, но при этом сохранялась способность встраивать в геном растений определенные гены, содержащиеся в данной конструкции. Таким образом, были получены ipt-трансгенный табак и трансформанты других растений (Beinsberger et al., 1991; Xu et al., 2009; Kuppu et al., 2013). Конститутивная (постоянная) экспрессия гена ipt приводила к появлению уродов без корней. Эти результаты свидетельствовали о том, что синтез цитокининов в нормальных растениях не может быть бесконтрольным. Поэтому были созданы конструкции, в которых ipt ген был поставлен под контроль различных промоторов (промотор гена белка теплового шока дрозофилы (Веселов и др., 1995)), малой субъединицы РБФК, тетрациклининдуцируемого промотора и т.д. (Faiss et al., 1997)). У таких растений синтез цитокининов индуцировался в зависимости от типа промотора тепловым шоком, светом или определенными соединениями (например, тетрациклином). Особенно удобным объектом оказались трансгенные растения, у которых синтез цитокининов индуцировался тетрациклином. С их помощью удалось показать, что накопление цитокининов в боковых почках стимулирует рост боковых побегов (Faiss et al., 1997). Тем самым было получено подтверждение способности цитокининов снимать апикальное доминирование (подавление роста боковых побегов). Ipt-трансгенные растения оказались очень полезной моделью для изучения действия цитокининов. Однако вопрос о том, способны ли сами растения синтезировать цитокинины, оставался до последнего времени открытым. Из-за того, что ген изопентенилтрансферазы долгое время не удавалось найти, сторонники идеи о том, что растения не способны сами синтезировать гормоны, получили сильный аргумент в свою пользу. Эти исследователи утверждали, что растения получают гормоны от эпифитных микроорганизмов, которые сожительствуют с ними на протяжении всего онтогенеза (Holland, 1997). Поэтому так важно было открытие японских исследователей, обнаруживших ген изопентенилтрансферазы у растений (Takei et al., 2001). Открытие у растений генов изопентенилтрансферазы позволило проследить за экспрессией этого гена в разных тканях растений. Наглядные результаты были получены с помощью трансгенных растений, трансформированных с помощью «репортерной» конструкции. Это метод находит все более широкое применение. Он основан на том, что интересующих исследователей ген (или его промоторная последовательность) сливают (fusion) с геном, кодирующим фермент или флюоресцирующий белок, который в норме не содержится в растениях. Затем по флюоресценции белка или его ферментативной активности удается гистологически выявить те клетки, где идет экспрессия интересующего исследователей гена. Поскольку репортерный ген находится в трансгенных растениях под контролем промотора искомого гена, место и время экспрессии репортерного гена соответствует характеру его экспрессии. Чаще всего в качестве репортного гена используют ген глукуронидазы (GUS) и детектируют активность этого фермента гистологически.
Такой подход позволил показать, что экспрессия генов изопентенилтрансферазы происходит в корнях (кончиках основного корня и боковых корней, зоне растяжения, обкладке сосудов). Однако экспрессия генов была также обнаружена и в побегах (в области сосудов листьев, зачатках цветков) (Miyawaki et al., 2004). Эти результаты ставят под сомнение исключительную роль корней как источника цитокининов для растений. В литературе даже появилось мнение о том, что цитокинины выполняют паракринную функцию, т.е. действуют только в тех клетках, где они синтезируются (Faiss et al., 1997). Хотя эта точка зрения нашла немало сторонников, тем не менее, есть много аргументов в пользу роли цитокининов в качестве сигналов при взаимодействии между собой отдельных органов и тканей. Эти данные уже разбирались в данном обзоре и также приведены ниже.
Экстракционная очистка абсцизовой кислоты
На рисунке 3 представлены данные по нуклеотиду зеатина. По его уровню в корнях не было выявлено различий между растениями, росшими при разной температуре. Вместе с тем, различия были обнаружены в побеге, где повышение температуры сопровождалось резким падением уровня этой формы цитокининов. Поскольку нас интересовало распределение цитокининов между побегом и корнем, важно было оценить относительное содержание нуклеотида зеатина в корнях (по сравнению с побегом). Из рисунка видно, относительное содержание нуклеотида зеатина возрастало в корнях под влиянием температуры, что сопровождалось ингибированием роста корней (рис.1).
Содержание зеатина в побегах и корнях 5-суточных растений пшеницы сорта Безенчукская 139, росших при 21 или 25 С. Различия в корнях растений, росших при разной температуре, не достоверны, а в побегах - достоверны при р 0,05.
В случае зеатина картина была иной (рис. 4). В отличие от нуклеотида, под влиянием повышения температуры содержание свободного азотистого основания резко возрастало в побеге (в 3 раза по сравнению с растениями, которые росли при 21). При этом абсолютное содержание зеатина в корнях при 21 и 25 С достоверно не различалось, а относительное (по сравнению с побегом) снижалось, т.е. изменялось в противоположном направлении по сравнению с нуклеотидом. 8 7 6 5 4 3 2 1 3
Содержание рибозида зеатина в побегах и корнях 5-суточных растений пшеницы сорта Безенчукская 139, росших при 21 или 25 С. Различия в корнях растений, росших при разной температуре, не достоверны, а в побегах - достоверны при р 0,05.
Изменение содержания рибозида зеатина под влиянием температуры (рис. 5) напоминало картину, полученную для зеатина (рис. 4), хотя реакция была более сглаженной по сравнению с зеатином: возрастание при более высокой температуре уровня в побегах (но не в 3, а только в 1,5 раза), отсутствие абсолютных различий в корнях и снижение относительного (по сравнению с побегом) уровня.
Таким образом, мы наблюдали снижение соотношения суммарной концентрации зеатина и зеатинрибозида корень/побег при снижении доли корней в массе растения. Это противоречит распространенному мнению о том, что ЦК тормозят рост корней (Van Loven et al., 1993; Werner et al., 2003; 2010), но согласуется с данными, свидетельствующими о необходимости участия цитокининов в поддержании роста корней (Higuchi et al., 2004; He et al, 2005). В этой ситуации логично задуматься о том, могут ли разные производные зеатина по-разному влиять на ростовые процессы корня? На этот вопрос в настоящее время ответить очень сложно, поскольку до сих пор нет прямых доказательств того, какие именно производные цитокининового ряда выполняют регуляторную функцию. Пролить свет на эту проблему могла бы информация о связывании цитокининов рецепторами и локализации рецепторов в разных частях растения. В настоящее время таких данных мало, но они всё же есть. Так известно, что у растений арабидопсиса имеется, по меньшей мере, три рецептора: ANK2, ANK3 и ANK4/CRE1/WOL. Исследования аффинных свойств рецепторов с использованием экспрессирующей системы Escherichia coli показали, что ANK3 и ANK4/CRE1/WOL имеют близкий коэффициент связывания с транс-зеатином, а ANK3 рецептор имеет более низкое сродство к изопентениладенину, чем ANK4/CRE1/WOL (Spichal et al., 2004; Romanov et al., 2006). При этом ANK3 экспрессируется преимущественно в побегах, а ANK4/CRE1/WOL – преимущественно в корнях. Это позволяет высказать предположение, что регуляция соотношения побег/корень может зависеть и от концентрации гормонов, и от распределения чувствительных к ним рецепторов. В этой связи представляется необходимым изучение распределения в растениях пшеницы также и цитокининов изопентениладенинового типа.
Еще одно перспективное направление исследований связано с проверкой предположения о том, что цитокинины могут влиять на рост корней не только напрямую, но и опосредованно через регуляцию роста побега. На роль цитокининов, присутствующих в побеге, в регуляции роста корней указывает тот факт, что торможение роста корней растений пшеницы при повышении температуры происходило в наших опытах на фоне неизменного абсолютного уровня зеатина и его рибозида в корнях и повышения – в побегах. Хотя роль отдельных форм цитокининов является предметом дискуссий, о чем сказано выше, наиболее распространенная точка зрения состоит в том, что именно зеатин является активной формой цитокининов, которая освобождается из запасных связанных форм, к которым относится нуклеотид зеатина (Mok, Mok, 2001). Эта точка зрения предполагает причинно следственную связь между противоположным по характеру изменением уровня зеатина и его нуклеотида в побегах при повышении температуры (содержание свободного зеатина в побеге возрастало на фоне падения уровня его нуклеотида). Можно предполагать, что повышение уровня зеатина (на фоне неизменного общего содержания суммы всех его измеренных метаболитов) могло быть следствием его освобождения из нуклеотида в результате его дефосфорилирования и дерибозилирования, что объясняет обнаруженное падение уровня нуклеотида зеатина.
Влияние тотального и локального теплового шока на соотношение массы побега и корня у HSIPT-трансгенных и нетрансформированных растений табака
Гормоны цитокинины являются объектом пристального внимания исследователей, но сведения о некоторых их свойствах противоречивы или недостаточны. Таким свойством цитокининов можно считать их влияние на рост корней. Для трансгенных растений с искусственно пониженным уровнем цитокининов было характерно подавление роста побега и стимуляция роста корней (Werner et al., 2003). На этом и подобных аргументах сформировалось представление о том, что цитокинины нужны для роста побега, но ингибируют рост корней. Вместе с тем, наблюдения за мутантными растениями с нарушениями рецепции цитокининов свидетельствуют о необходимости цитокининового сигналинга для нормального роста корней. Неоднозначность действия цитокининов может быть связана с тем, что на уровне целого растения их влияние на рост корней может быть непрямым, а обусловлено процессами в побеге, которые контролируются цитокининами. Это предположение было сформулировано в статье Beck еще в 1996 г., но до сих пор не нашло экспериментального подтверждения. Для проверки этой гипотезы мы изучили воздействие температуры на рост и содержания цитокининов. Выбор этого фактора связан с тем, что повышение температуры влияет как на синтез, так и на транспорт цитокининов.
На первом этапе наших исследований мы проанализировали влияние температуры на рост и содержание цитокининов в растениях пшеницы. Выбор этого объекта связан с тем, что Веселовой с соавторами (2006) было показано увеличение притока цитокининов из корней пшеницы под влиянием повышенной температуры. Повышение температуры снижало относительную массу корней (за счет одновременной стимуляции роста побега и подавления роста корней). При этом достоверной разницы по содержанию цитокининов в корнях не было зарегистрировано. В то же время повышение температуры приводило к 3х-кратному возрастанию содержания цитокининов в побеге. Таким образом, стимуляция накопления цитокининов в побегах сопровождалось активацией их роста и подавлением роста корней.
Важно было доказать, что связь роста корней с уровнем цитокининов в побеге не было случайным совпадением. Для этого нужно было целенаправленно модулировать содержание цитокининов в побегах и корнях. С этой целью мы использовали трансгенные растения табака, экспрессирующие бактериальный ipt-ген, поставленный под контроль промотора белка теплового шока дрозофилы, экспрессия которого запускается при температуре 40 С, индуцируя тем самым синтез цитокининов. В одном из вариантов опытов экспрессию ipt-гена индуцировали локальным тепловым шоком, прогревая только корни. Такая постановка опыта была связана с тем, что по некоторым данным литературы основная масса цитокининов синтезируется в корнях. В нашем случае было важно убедиться, что индукции ipt-гена в корнях приводит к повышению уровня цитокининов в побеге и что эти изменения в уровне цитокининов сказываются на функциональной активности листьев.
Содержание цитокининов более заметно возрастало в верхних дифференцированных листьях, куда, судя по повышенной устьичной проводимости этих листьев, направлялась основная часть транспирационного потока из корней. Индукция ipt-гена в корнях, в свою очередь, повышала устьичную проводимость. Эта закономерность была ранее описана в статье Высоцкой с соавторами (Vysotskaya et al., 2010). Новизна настоящих результатов в том, что с помощью иммуногистохимического подхода на этой модели мы впервые изучили распределение цитокининов между клетками листа. Индукция ipt-гена в корнях повышала уровень цитокининов как в клетках мезофилла, так и в устьичных клетках, что способствовало их открытию, повышению газообмена и фотосинтеза, т.е. повышенный синтез цитокининов в корнях увеличивал их приток в побег и сказался на его функциях. Важно было проверить, как изменение уровня цитокининов влияет на рост побегов и корней. С этой целью наряду с прогревом корней, мы также нагревали растения целиком, чтобы вызвать экспрессию ipt-гена во всем растении. Эти воздействия приводили к диаметрально противоположной ростовой реакции корней. При тотальном тепловой шоке рост корней тормозился, что проявлялось в уменьшении соотношения массы корня и побега. Этот ответ был связан с резкой активации роста побега. При локальной индукции синтеза цитокининов в корнях происходила относительная активация роста корней за счет менее выраженного торможения их роста по сравнению с побегом. Ростовую реакцию корней не удалось связать с корневыми цитокининами, поскольку их содержание возрастало по сравнению с контролем как при тотальном, так и локальном тепловом шоке. В какой-то мере, удалось проследить связь ростового ответа корней с изменением содержания цитокининов в побеге (коэффициент корреляции был -0,76: резкое возрастание уровня цитокининов в побеге по сравнению с контролем сопровождалось торможением роста корней). Тем не менее, при локальном ТШ, эту связь выявить не удалось, поскольку небольшое накопление цитокининов в побегах в этом случае приводило не к торможению, а относительной активации роста корней.
Мы предположили, что оценка общего содержания цитокининов в побеге недостаточно информативна, и провели анализ цитокининов отдельно в сформированных листьях и апексе побега с активно растущими листовыми зачатками. Анализ показал, что при локальной индукции синтеза цитокининов в корнях их содержание возрастало только в сформированных листьях, но не в апексе. Это легко объяснить тем, что в отличие от дифференцированного листа, в апексе плохо развиты ксилемные сосуды и сюда может не доходить поток цитокининов из корней. В результате нарушался нормальный градиент цитокининов между растущими и дифференцированными листьями, что было одной из причин зарегистрированного ингибирования роста побега. При тотальной индукции синтеза цитокининов их уровень резко возрастает именно в апексе. Благодаря известной аттрагирующей способности цитокининов, это должно обеспечить зарегистрированную активацию роста побега и подавлять отток ассимилятов в корни, ингибируя их рост. Таким образом, на росте корней сказывается не просто уровень цитокининов в побеге, но их распределение между его донорной и акцепторной частями.
