Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Минеральное питание и рост растений 8
1.1.1. Минеральное питание растений 8
1.1.2. Дефицит минерального питания и рост растений 10
1.2. Водный обмен и дефицит минерального питания растений 16
1.2.1. Водный обмен растений 16
1.2.2. Дефицит минерального питания и показатели водного обмена 21
1.3. Гормональная регуляция роста и водного обмена растений 24
1.3.1. АБК и регуляция процессов в побегах и корнях 24
1.3.2. АБК и дефицит минерального питания 29
1.3.3. Цитокинины ирегуляция процессов в побегах и корнях 30
1.3.4. Цитокинины и дефицит минерального питания 35
1.3.5. Ауксины, рост корней и дефицит минерального питания 36
2. Объект и методы исследования 39
2.1. Условия выращивания растений и проведение экспериментов 39
2.1.1. Условия выращивания растений 39
2.1.2. Проведение экспериментов по изучению влияния дефицита минерального питания на различные процессы жизнедеятельности растений 39
2.2. Методы исследования 40
2.2.1. Измерение роста растений 40
2.2.2. Определение растяжимости клеточных стенок 40
2.2.3. Определение содержания азота 41
2.2А.Измерение скорости транспирации, оводненности тканей и относительного содержания воды 41
2.2.5. Определение потока ксилемного сока, измерение осмотического потенциала, вычисление гидравлической проводимости 42
2.2.6. Измерение устьичной проводимости и скорости фотосинтеза 42
2.2.7. Экзогенная обработка растений синтетическим цитокинином бензиламинопурином (БАП) и флуридоном 42
2.2.8. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов 43
2.2.9. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 45
2.2.10. Статистическая обработка данных 46
3. Результаты и их обсуждение 47
3.1. Влияние дефицита минерального питания на рост побегов, корней и соотношение побег/корень 47
3.2. Влияние недостатка минеральных веществ на водный обмен растений 60
3.3. Содержание гормонов в побегах и корнях растений пшеницы и их транспорт на фоне дефицита минерального питания 71
3.3.1. Роль АБК в регуляции роста побега и корня в условиях дефицита минерального питания 72
3.3.2. Роль цитокининов в регуляции роста побега и корня в условиях дефицита минерального питания 78
3.3.3. Роль ауксинов в регуляции роста побега и корня в условиях дефицита минерального питания 89
Выводы 96
Список использованной литературы 97
- Водный обмен и дефицит минерального питания растений
- Цитокинины ирегуляция процессов в побегах и корнях
- Проведение экспериментов по изучению влияния дефицита минерального питания на различные процессы жизнедеятельности растений
- Содержание гормонов в побегах и корнях растений пшеницы и их транспорт на фоне дефицита минерального питания
Водный обмен и дефицит минерального питания растений
Поглощение воды из внешней среды является обязательным условием существования любого живого организма. Вода — важнейший растворитель и среда для биохимических реакций, главный компонент в транспортной системе высших растений (Полевой, 1989).
Основной движущей силой продвижения воды в растении является градиент водного потенциала. Основными компонентами водного потенциала (ВГТ) являются осмотический и гидростатический (матричный и гравитационный составляющие чаще всего не принимаются в расчет) (Жолкевич, 2001; Веселов и др., 2003; Зялалов, 2004). Осмотический потенциал (ОП) определяется концентрацией растворенного вещества. С увеличением его концентрации ОП становится более отрицательным. Гидростатический компонент водного потенциала в клетке представлен тургорным противодавлением (Т) клеточной оболочки, возникающим при ее эластичном растяжении. Связь между показателями, из которых складывается водный потенциал клетки, описывает уравнение: ВП = ОП + Т (Анисимов, Раткович, 1992; Jones, 1992; Медведев, 2004).
Если концентрация осмотиков внутри клетки станет равной осмотическому потенциалу среды вне клетки, тургор, в соответствии с уравнением, должен стать равным нулю. Чтобы этого не происходило, клеткой должна постоянно поддерживаться разница ОП внутри и вне ее. Это происходит за счет работы ионных каналов, активно закачивающих осмотически активные вещества в клетку против градиента их концентрации.
Осмотически активными веществами могут быть как органические соединения (Франко, Мело, 2000), так и неорганические ионы, прежде всего, ионы калия (Злотникова, Вахмистров, 1982; Зялалов, 2004). Было показано, что калий увлекается транспирационным потоком, однако значительная его часть не достигает листьев, а ретранспортируется обратно в корень (Зялалов, 1979; Armstrong, Kirkby, 1979; Jeschke, 1984; Зялалов и др., 1994). Т.е. в растении существует механизм сопряжения водного тока с циркуляцией калия. Кроме того, были получены данные об участии фитогормонов (ИУК и АБК) в регуляции циркуляции калия, а через нее и транспорта воды (Ionenko, Zyalalov, 1994).
А как же поступает в клетку сама вода? Давно известно, что липидный бислой хорошо проницаем для воды (Steudle, 1989). Вместе с тем, было показано, что в мембране растительной клетки присутствуют специальные каналы для воды аквапорины, которые могут инактивироваться в присутствии ионов ртути. Так, обработка HgC ингибировала водную проницаемость мембран (Kaldenhoff et ai., 1998), гидравлическую проводимость корней пшеницы (Carvajal et al., 1996; Barrowclough et al., 2000) и водную проницаемость плазматических мембран хары (Henzler, Steudle, 1995). Изучению аквапоринов посвящены многие работы отечественных и зарубежных исследователей (Chrispeels, Maurel, 1994; Hertel, Steudle, 1997; Schaffher, 1998; Tyerman et al., 1999; Трофимова и др., 2001; Волобуева и др., 2004). Активность водных каналов регулируется метаболически, например, путем фосфорилирования аквапоринов (Johansson et al., 1996), и может подвергаться влиянию факторов окружающей среды (Steudle, Henzler, 1995). По данным литературы недостаток минеральных веществ приводил к снижению гидравлической проводимости корней пшеницы предположительно через изменение активности аквапоринов (Carvajal et al., 1996). С другой стороны может меняться не только активность аквапоринов, но и обогащенность ими клеточных мембран. Так, у растений гороха водный дефицит приводил к увеличению экспрессии водных каналов (Guerrero et al., 1990), а переход хрустальной травки с Сз-типа фотосинтеза на САМ совпадал со снижением содержания аквапоринов в клеточных мембранах (Божко и др., 2004). Засоление вызывало уменьшение проницаемости для воды как клеток корня, так и целых корней кукурузы (Azaizeh et al., 1992). В настоящее время известно, что это может быть связано с изменением экспрессии аквапориновых генов (Katsuhara et al., 2003).
Жизнедеятельность наземного растения основана на восходящем токе воды, который складывается из процессов поступления воды в корневую систему, проведения по сосудистой системе и испарения ее с поверхности надземных органов, прежде всего листьев (Жолкевич, 2001). Движение воды происходит по градиенту водного потенциала в системе почва-растение-атмосфера и имеет два концевых двигателя — нижний (корневое давление) и верхний (транспирация) (Зялалов, 1984; Жолкевич, 2001). Корневое давление включает в себя осмотический и неосмотический (метаболический) компонент (Жолкевич, 1989; Дустмаматов и др., 2004). При функционировании осмотической составляющей корень работает подобно осмометру (только при наличии положительного градиента осмотического давления между ксилемным соком и наружным раствором). Функционирование метаболической составляющей связано с ритмическими микроколебаниями гидростатического давления отдельных паренхимных клеток или всего симпласта в целом (Жолкевич, 1989).
Вода проходит от поверхности корня до сосудов ксилемы через клетки коры, эндодерму и перицикл (радиальный транспорт). Межклеточный транспорт воды может осуществляться тремя путями: 1) по апопласту — свободному пространству тканей, включающему в себя межклеточные промежутки, каналы между микрофибриллами целлюлозы клеточных стенок, сосуды ксилемы; 2) по симпласту, включающему в себя протопласты всех клеток - цитоплазм атический симпласт, вместе с тем, существует гипотеза о том, что вакуоли соединены между собой через плазмодесмы, образуя единый вакуолярный канал, принадлежащий многим клеткам - вакуолярный симпласт (Гамалей, 1998; Великанов и др., 2001; Волобуева и др., 2001); 3) по трансклеточному, вакуолярному, пути — трансмембранному пути, из клетки в клетку, по вакуолям, с выходом через плазмалемму в межклеточное пространство (Курсанов, 1976; Анисимов, Раткович, 1992; Steudle, Frensch, 1996; Steudle, 2000). В литературе используется также термин «от клетки к клетке» (cell to cell), под которым подразумевается объединенный путь -трансклеточный + симпластный (Steudle, Frensch, 1996; Steudle, 2000).
Апопластный, симпластный и трансклеточный пути могут использоваться с различной интенсивностью (Passioura, 1988; Kramer, Boyer, 1995; Steudle, Frensch, 1996; Steudle, Peterson, 1998). Преобладание того или иного пути транспорта воды зависит от вида растения, стадии его развития, а также от движущей силы абсорбции воды - гидростатического или осмотического градиентов (Steudle, Frensch, 1996; Steudle, Peterson, 1998). В присутствии гидростатического градиента (когда растение активно транспирирует) поток воды движется в основном по апопласту, потому что этот путь имеет наименьшее сопротивление (Crowdy, Tanton, 1970; Weatherley, 1975). Когда водный поток небольшой, апопластный транспорт незначителен (Steudle, Peterson, 1998; Quintero et al., 1999) и большая часть водного потока идет по симпластному и/или трансмембранному пути (Maurel, Chrispeels, 2001).
Особое значение имеет эндодерма корня, сформированная одним слоем клеток, каждая из которых содержит в клеточной стенке поясок Каспари — водонепроницаемый слой суберина и лигнина. Эндодерма является преградой для апопластного транспорта, которую вода пересекает по пути «от клетки к клетке» (Marschner, 1995; Steudle, 2000). Однако на ранних этапах суберинизации клеточных стенок пояски Каспари обладают некоторой проницаемостью для воды (Steudle, 2000). В результате в активно транспирирующем растении гидравлическая проводимость корней высока. Когда транспирация отсутствует, поток воды движется по осмотическим законам, при этом он пересекает множество мембран, и суммарная гидравлическая проводимость корня гораздо ниже, чем в случае наличия гидростатического градиента (Steudle, 2000).
Цитокинины ирегуляция процессов в побегах и корнях
Цитокинины — группа растительных гормонов, регулирующих многие аспекты роста и развития растений. Их функция проявляется на всех этапах онтогенеза, начиная от развития оплодотворенной яйцеклетки и кончая процессами старения и смерти растительного организма (Кулаева, 1973). Благодаря своей способности вызывать деление клеток (цитокинез) цитокинины и получили свое название (Skoog, Arm, 1970). Позднее было продемонстрировано, что клеточные деления вначале индуцирует ауксин, а затем — цитокинин (Дмитриева, Липский, 1973). В последнее время выяснено, что цитокинины необходимы для перехода Gj/S и G2/M (Троян и др., 1989; Романов, 2000). Влияние цитокининов на митотическую (Муромцев и др., 1987) активность растений подтверждается экспериментами с трансгенными растениями арабидопсиса со сниженным содержанием этих гормонов (Werner et al., 2003). Цитокинины участвуют в таких процессах, как деление и растяжение клеток (Kuraishi, Okumura, 1956; Курсанов и др., 1964; Naito et al., 1978; Rayle et al., 1982; Фофанова и Хохлова, 1983; Кулаева и др., 1984; Taiz, Zeiger, 1998; Роньжина, 2003), влияют на фотосинтез (Чернядьев, 1993), развитие хлоропластов (Кулаева, 1973; Parthier, 1979; Kuznetsov et al., 1994; Benkova et al., 1999; Кулаева, Кузнецов, 2002), способствуют накоплению хлорофилла и каротиноидов (Kuznetsov et al., 1994), которые необходимы для сборки фотосистемы II (Markgraf, Oelmueller, 1991), участвуют в задержке старения (Кулаева, 1973; Letham, 1978), мобилизации питательных веществ, распределении ассимилятов (Борзенкова, Зорина, 1990; Morris, 1995), дифференциации клеток, а также индукции формирования побега в культуре тканей (Skoog, Arm, 1970; Kende, 1971; Letham, 1978; Thorsteinsson, Eliasson, 1990), способствуют образованию проводящей системы растений (Гамалей, 1972; Aloni, 1995). Было показано, что цитокинины играют главную роль в регуляции множества процессов, связанных с поступлением питательных веществ в растущие ткани (Roitsch, EhneP, 2000; Соколова и др., 2002). Вероятно, названные процессы, как и все перечисленные физиологические эффекты, связаны с действием цитокининов на молекулярном уровне. Цитокинины влияют на биосинтез нуклеиновых кислот и белков (Кулаева, 1982), в том числе и некоторых ферментов: нитратредуктазы (Кузнецов и др., 1986), рибулозобифосфаткарбоксилазы (Павар и др., 1983). Образуя специфический комплекс с белковым рецептором (Chen et al, 1985), цитокинины, по-видимому, усиливают активность РНК-пол имераз и матричную активность хроматина (транскрипционный уровень), стимулируют формирование полисом (посттранскрипционный уровень) (Шакирова и др., 1982) и таким образом влияют на клеточный метаболизм (Кулаева, 1973; Кулаева, 1982; Teramoto et al., 1994; Schmulling et al., 1997; Gaudino, Pikaard, 1997). Цитокинины также могут реализовать регуляторную функцию на уровне мембран (Кулаева, 1982; Полевой, 1982; Али-Заде и др., 1986; Kuiper et al., 1991; Grabski, Schindler, 1996).
Экзогенно введенные цитокинины увеличивают степень открытия устьиц и скорость транспирации как у однодольных, так и двудольных растений, а также вызывают открытие устьиц, закрывшихся под влиянием локального полива (Blackman, Davies, 1985; Incoll, Jewer, 1987). Однако при экзогенной обработке не всегда удается добиться той же действующей концентрации цитокининов, которая создается естественным путем в растении. Поэтому представляют интерес эксперименты с введением цитокининов в ксилему растений. При этом было показано, что введение цитокининов приводило к увеличению скорости транспирации (Badenoch- Jones et al., 1996). Следовательно, можно предположить, что цитокинины могут влиять на уровень транспирации, если они присутствуют в ксилемном соке в достаточной концентрации. С другой стороны, в литературе есть данные о том, что при различных стрессовых условиях снижение поступления цитокининов из корней может привести к уменьшению устьичной проводимости и торможению роста листа и что это может происходить вне зависимости от концентрации цитокининов в листе (Jackson, 1993; Emery, Atkins, 2002).
Природные цитокинины являются производными изопентениладенина (Полевой, 1989). К ним относятся зеатин, дегидрозеатин и их рибозиды, риботиды и глюкозиды, являющиеся запасными формами. Содержание свободных цитокининов и их форм регулируется в растении скоростью синтеза de novo, скоростью импорта, образованием и распадом конъюгатов цитокининов (в основном глюкозидов) и скоростью экспорта и катаболизма (Мок, Мок, 2001).
Проведение экспериментов по изучению влияния дефицита минерального питания на различные процессы жизнедеятельности растений
Дефицит минерального питания создавался разбавлением оптимального для роста растений питательного раствора в 10 раз. В предшествующих экспериментах было показано, что оптимальной для роста растений является 10%-ная среда Хогланда-Арнона 1 (Кудоярова и др., 1993). В возрасте 7 суток у всех растений удаляли зерновку, одну часть переносили на 1%-ную среду (опытные растения), другая часть растений выращивалась на 10%-ном растворе Хогланда-Арнона в течение всего эксперимента (контрольные растения). Ежедневно в 10, 14и 18ч проводилась смена растворов на свежие. При отборе образцов разных частей побега учитывали данные предварительных экспериментов с нанесением меток тушью, которые показали, что растущая зона листа расположена внутри колеоптиля. Для оценки роста побегов и корней измеряли скорость роста в длину, определяли сырую и сухую массу органов, вычисляли соотношение побег/корень по сырой и сухой массе. Через равные промежутки времени с помощью линейки измеряли длину 1-го и 2-го листа и корней. По приросту за данный промежуток времени вычисляли скорость роста листьев и корней в длину. Сырой вес определяли сразу после отделения листа от растения. Для определения сухого веса высушивали при 85С в течение 24 часов (Pardossi et al., 1992). Для измерения растяжимости листа дополнительный груз массой 2 г подвешивали к коромыслу датчика роста со стороны сердечника. Коэффициент растяжимости (є) рассчитывали по формуле (Thomas et al, 1999): e=(Xi-Xo)/(Lgr До) (сек1 Па 1), где - Хо (м/сек)- скорость роста без груза, Хі (м/сек)- стабильная скорость роста после добавления груза, Lgr (м) - длина зоны растяжения листа, Да (Па) -изменение тянущего усилия, рассчитанное по формуле
Транспирацик, измеряли весовым методом - по потере веса сосуда с 70 мл питательно раствора и 5 проростками в течение 10 минут. Для предотвращения испарения водь, с поверхности питательной, раствора сосуд Аспирации выражали в ммоль/Л предварительно измерив площадь листьев растений пшеницы. Оводненность определяли для дифференцированной и растущей частей побега, а также „л, корней. Для оценки оводненности тканей у одних и тех же образцов определяли сыру» и суху» массу; содержание водь, вычисляли по формуле: Относительное содержание воды (ОСВ) в листьях определяли согласно методике, описанной Pardossi е, al. (1992). ОСВ рассчитывали по формуле: ОСВ = (сырой веской вес)/(тургорный веской вес) х 100% т определения тургорного веса побеги помещали в закрытые _ые сосуды с дистиллированной водой при 20С на 1« часов в условиях рассеянного света. Для измерения скорости потока корневого экссудата острым лезвием удаляли побег на расстоянии примерно 1 см от основания корня и к оставшейся части растения с помощью силиконовой трубочки присоединяли стеклянный капилляр. Через 1,5 ч ксилемный сок, набравшийся в капилляры из корней нескольких контрольных или опытных растений, переносили в предварительно взвешенные пробирки. После повторного взвешивания по разности весов пробирок определяли массу экссудата. В этих же образцах ксилемного сока определяли осмотическое давление. Гидравлическую проводимость корня рассчитывали по формуле Lp=V/(7tx - щ), где Lp — гидравлическая проводимость; V - поток воды из корней; ях — осмотическое давление пасоки; щ— осмотическое давление питательной среды (Лялин, Лукоянова, 1993). Осмоляльность питательного раствора, ксилемного экссудата и клеточного сока тканей растений измеряли с помощью цифрового микроосмометра (CAMLAB Limited, UK). Клеточный сок отжимали при помощи шприца после замораживания в жидком азоте и оттаивания собранных образцов. 2.2.6. Измерение устьичной проводимости и
Содержание гормонов в побегах и корнях растений пшеницы и их транспорт на фоне дефицита минерального питания
Из обзора литературы мы можем видеть, что роль гормонов в адаптации растений к разным уровням минерального питания изучали многие исследователи (Сабинин, 1955; Goldbach et al., 1975; Sattelmacher, Marschner, 1978; Chapin et al., 1988; Кудоярова и др., 1993; Palmer et al., 1996; Лузина, 2000; Yong et al., 2000; Zdunek, Lips, 2001 и др.). Так, хорошо известно влияние азота на продукцию цитокининов в растениях (Kuiper et al., 1988; Thorsteinsson, Eliasson, 1990; Sakakibara et al., 1998). Дефицит азота и других элементов минерального питания сопровождается снижением содержания цитокининов (Kuiper et al, 1988; Кудоярова, Усманов, 1991; Wagner, Beck, 1994; Forde, 2002). Также рядом исследователей было обнаружено накопление АБК (Chapin, 1990; Palmer et al., 1996; Кудоярова и др., 1993 и др.) и изменение концентрации ИУК при дефиците минерального питания (Казарян и др., 1989; Teplova et al, 1998). Предполагается, что изменение концентрации этих гормонов играет важную роль в регуляции адаптивных реакций, направленных на приспособление растений к изменению уровня минерального питания. Известно, что цитокинины активируют рост побега и тормозят рост корней в длину (Кулаева и др., 1984; Beck, 1996; Werner et al., 2003J. Это дало основание предполагать, что снижение содержания цитокининов при дефиците воды и ионов в почве может способствовать относительной активации роста корней. (Sharp, LeNoble, 2002). В последние годы опубликовано ряд работ, которые опровергают общепринятое предположение о ростингибирующей роли накопления АБК при дефиците воды (Trewavas, Jones, 1991). По мнению авторов, накопление АБК необходимо для роста корней при низком водном потенциале (Sharp, LeNoble, 2002; Sharp et all, 2004), а также для поддержания роста побегов томата (Sharp et all 2000) и Arabidopsis (LeNoble et all, 2004) при оптимальных условиях произрастания. Они показали, что накопление АБК при водном стрессе, в конечном счете, может быть связано с активацией антиоксидантной системы, что очень важно для защиты структуры мембран при любом значительном изменении окружающей среды. Кроме того, АБК отводится важная роль в регуляции устьичной проводимости при дефиците минерального питания (Chapin, 1990).
Однако в большинстве этих работ не проводилось одновременное комплексное исследование морфофизиологических показателей, показателей водного обмена и содержания гормонов с тем, чтобы выявить критические звенья в цепи регуляторных событий. В одних работах больше внимания уделяли определению содержания гормонов, в других - показателям водного обмена и др., из-за чего данные экспериментов очень трудно сопоставлять и анализировать. В нашей работе представилась в какой-то мере уникальная возможность сопоставить динамику содержания гормонов и их транспортных потоков с ростовой реакцией побега и корня, а также с показателями водного обмена, скоростью фотосинтеза. Результаты получены при одних и тех же условиях на растениях пшеницы одного возраста. Такой подход может способствовать лучшему пониманию механизмов регуляции ростового ответа растений, направленный на оптимизацию использования ресурсов при дефиците минеральных солей. В последнее время эта задача стала особенно актуальной в связи с появлением работ, в которых активно обсуждается приоритет гидравлических сигналов в регуляции роста корней (Carvajal et al., 1996; Clarkson et al., 2000).
В наших экспериментах через сутки после перенесения растений на разбавленную питательную среду Хогланда-Арнона содержание АБК в дифференцированной части листа было выше, чем в контроле (рис.6). В растущей части листа также была заметна тенденция к повышенному содержанию гормона на фоне дефицита минерального питания. При этом содержание АБК в зоне роста листа было выше, чем в его дифференцированной части как в контроле, так и на фоне дефицита питания. Это противоречит традиционному представлению об АБК, как о соединении, которое связано со старением листьев (Полевой, 1989). В настоящее время признано, что АБК необходима для поддержания роста растений, и ее содержание может быть выше в молодых листьях, чем в старых (Пустовойтова, 1996; Sharp et all, 2000). В корнях проростков, наоборот, содержание АБК было выше в контрольных растениях. Измерение концентрации АБК в кончиках корней (растущая часть корня) дало противоположный результат, т.е. мы обнаружили накопление этого гормона в апикальной зоне корня (до зоны дифференциации) у растений на дефицитной по минеральному питанию среде по сравнению с контролем (262,01 ± 32,73 и 448,05 ± 43,52 нг/г сухой массы). Таким образом, происходило концентрирование АБК в кончике корня на фоне общего снижения содержания гормона в этом органе. Как уже отмечалось выше, такое же перераспределение АБК было обнаружено в корнях кукурузы при водном стрессе (Sharp, 2004), что способствовало поддержанию роста корня в длину в условиях дефицита воды и ограниченного поступления ассимилятов и других веществ из побега в корень. В то же время накопление АБК в кончиках корней кукурузы при отсутствии дефицита воды приводило к снижению скорости удлинения корня. Это говорит о том, что изменение условий окружающей среды может модифицировать ростовую реакцию корня в ответ на накопление данного гормона. В наших экспериментах разбавление питательного раствора также приводило к активации роста корней в длину (табл.3), а накопление АБК в апикальной части корней могло быть важным звеном регуляторных событий, приводящих к включению механизмов, обеспечивающих ростовую реакцию корня в ответ на снижение содержания минеральных солей в питательном растворе. Для того, чтобы полученные нами данные об участии эндогенной АБК в регуляции ростового ответа растений на дефицит минеральных солей в питательной среде были еще более убедительными, мы провели ряд экспериментов с применением флуридона - ингибитора синтеза АБК (Saab et aL, 1990; Ober, Sharp, 1994; Spollen et al., 2000). Результаты представлены в таблице 9, из которой видно, что нарушение синтеза гормона, подавляло накопление сырой массы побегов и корней растений независимо от содержания минеральных солей в питательном растворе.
