Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Дыхательный газообмен и ультраструктура клеток при ингибировании митохондриального окисления 9
1.2. Дыхательный газообмен и ультраструктура клеток при действии мембранотропных соединений 16
ГЛАВА 2
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 22
2.1. Объект исследования 22
2.2. Метод определения интенсивности дыхания 23
2.3. Определение проницаемости мембранных образований клетки 23
2 .4. Метод определения мембранного потенциала 24
2.5. Метод электронной микроскопии 24
ГЛАВА 3
ДЕЙСТВИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО
ДЫХАНИЯ НА ГАЗООБМЕН И УЛЬТРАСТРУКТУРУ КЛЕТОК КОРНЕЙ
ПШЕНИЦЫ 26
3.1. Характеристика функционального состояния клеток корней пшеницы контрольного варианта во времени. 26
3.2. Изменения дыхания и ультраструктурные перестройки клеток при блокировании среднего участка дыхательной цепи митохондрий антимицином А 34
3.3. Изменения дыхания и ультраструктурные перестройки клеток при блокировании терминального участка дыхательной цепи митохондрий цианидом 62
ГЛАВА 4
ПОЯВЛЕНИЕ КОЛЬЦЕВЫХ (ТОРОИДАЛШЫХ) МИТОХОБДРИЙ В ПРОЦЕССЕ ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ НА ДЕЙСТВИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЯДОВ 71
ГЛАВА 5
ДЕЙСТВИЕ МЕМБРАНОТРОПНОГО) ОЭЕДИНЕНИЯ (АМИНАЗИНА) НА ГАЗООБМЕН И УЛЬТРАСТРУКТУРУ КЛЕТОЕ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ 79
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ 107
ЛИТЕРАТУРА НО
- Дыхательный газообмен и ультраструктура клеток при ингибировании митохондриального окисления
- Метод определения интенсивности дыхания
- Характеристика функционального состояния клеток корней пшеницы контрольного варианта во времени.
- ПОЯВЛЕНИЕ КОЛЬЦЕВЫХ (ТОРОИДАЛШЫХ) МИТОХОБДРИЙ В ПРОЦЕССЕ ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ НА ДЕЙСТВИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЯДОВ
- ДЕЙСТВИЕ МЕМБРАНОТРОПНОГО) ОЭЕДИНЕНИЯ (АМИНАЗИНА) НА ГАЗООБМЕН И УЛЬТРАСТРУКТУРУ КЛЕТОЕ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ
Введение к работе
- 5 -тального значения. Необходимы, отмечается далее, совместные эксперименты физиологов с электронными микроскопистами, в которых структурная организация органелл изучалась бы на фоне интенсивно: протекающих или заторможенных реакций метаболизма. Такого рода исследования можно проводить, используя ин-гибиторный анализ, позволяющий выключать на определенный отрезок времени отдельные звенья метаболических процессов и одновременно наблюдать развитие компенсаторно-приспособительных реакций. В настоящее время не вызывает сомнений глубокая общность процессов жизнедеятельности на клеточном уровне у всех эукариотов - независимо от их места на эволюционной лестнице. Интересно, что обнаруживается также однотипность структурных, физиологических, биохимических изменений, вызванных различными повреждающими воздействиями как в животных, так и в растительных клетках. Это дает уникальную возможность использовать корни растений в качестве модели для изучения компенсаторно-приспособительных ответных реакций клеток на повреждающие воздействия. Преимущества данной модели заключаются в следующем: замедленность реакции по сравнению с клетками животных; возможность проводить исследования на целой ткани с наименьшими повреждениями; большая повторность опытов; возможность проводить структурно-функциональные исследования в динамике.
За последние годы накоплен значительный экспериментальный материал по изменению ультраструктуры клеток (растительных и животных), который в большинстве своем неоднороден и противоречив. Одной из причин этого является однократность наблюдений, причем, как правило, на последних стадиях процес- са адаптации, повреждения. В связи с этим, представляется важным выяснение динамики компенсаторно-приспособительного процесса при различного рода воздействиях на клетку. "... Динамической цитологии может принадлежать почетное место в кругу экспериментальных биологических дисциплин" (Курсанов, 1974). Необходимо исследовать динамику морфо-функциональных изменений, начиная с самых ранних этапов, так как "... во всех случаях динамика ответной реакции, последовательность и соотношение различных фаз реакции остаются неизменными" (Машанский и др.,1981). В физиологии растений таких работ практически нет, за исключением нескольких морфологических исследований (Цибковская, 1979; Удовенко и др., I960; Удовенко, Цибковская, 1983).
В связи с вышеизложенным была поставлена определенная цель и задачи.
Цель и задачи исследования. Основная цель наших исследований заключалась в изучении динамики ответных реакций клеток корней пшеницы и степени специфичности этих реакций: при воздействии различными типами ядов: специфических ингибиторов ми-тохондриального окисления ( антимицина А и цианида ) и мембра-нотропного соединения ( аминазина ). Были поставлены следующие задачи: исследовать морфо- функциональное состояние отсеченных корней пшеницы ( газообмен, проницаемость мембран для ионов К+, мембранный потенциал, ультраструктуру ) в течение б-ти часов; выявить изменения в дыхательном газообмене и проницаемости мембран для ионов К+ клеток корней пшеницы при действии двух типов ядов; проследить за ультраструктурными перестройками в клетках корней пшеницы в ответ на действие двух различ- ных типов ядов; 4) выявить специфические черты в ответных реакциях клеток на разные повреждающие воздействия.
Научная новизна. Использованный нами структурно-функциональный подход в изучении ответных реакций клеток корней пшеницы на воздействие различных типов ядов позволил впервые проследить за динамикой компенсаторно-приспособительных процессов на ультраструктурном уровне.
Показано, что специфические ингибиторы электронтранспор-тной цепи ( антимицин А и цианид ) и мембранотропное соединение ( аминазин ) вызывают одинаковые первоначальные изменения ультраструктуры клеток; одновременно наблюдается ингибирова- ние потребления кислорода. В последующий период времени инги-бирование дыхания сменяется стимуляцией, которая связана, по-видимому, с увеличением энергозатрат для репарационных процессов.
Впервые обнаружено, что при блокировании митохондриаль-ного окисления в клетках появляются митохондрии тороидальной формы. Образование таких митохондрий рассматривается как адаптивный признак.
На основании собственного экспериментального материала и данных литературы выдвинуто положение о том, что специфичность действия того или иного повреждающего фактора выражается не наличием или отсутствием каких-либо конкретных изменений, а их количественным соотношением.
Практическая ценность работы. Полученный экспериментальный материал свидетельствует о целесообразности исследования предложенных нами теоретических и методических разработок в исследованиях компенсаторно-приспособительных реакций при действии неблагоприятных факторов.
Перспективным является динамический структурно-функциональный подход в изучении внутриклеточной регенерации и выявлении возможности ее ускорения.
Одним из тестов, характеризующих соотношение патология/ регенерация, является появление тороидальной формы митохондрий, которое, кроме того, может служить одним из признаков начала, адаптационных процессов в клетке.
Основные положения, вынесенные на защиту.
Начальные изменения в ультраструктуре клеток при действии двух различных типов ядов (ингибиторы электронтран-спортной цепи митохондрий и мембранотроп) являются неспецифическими.
В ответных реакциях клетки на повреждающее воздействие значительное место принадлежит эндоплазматическому ре-тикулуму и митохондриям. Появление тороидальной формы митохондрий - признак адаптации.
Ответные реакции клеток на действие ингибиторов ми-тохондриального окисления и мембранотропа представляют собой совокупность двух одновременно идущих процессов : повреждение и включение защитных, компенсаторных механизмов.
Ц-. Специфичность действия того или иного повреждающего фактора выражается не наличием или отсутствием каких-либо конкретных изменений, а их количественным соотношением.
Дыхательный газообмен и ультраструктура клеток при ингибировании митохондриального окисления
Одним из основных методических приемов, используемых при изучении энергетического обмена животных и растительных клеток, является применение специфических ингибиторов. В настоящее время известен целый ряд соединений, которые оказывают действие на определенные участки дыхательной цепи митохондрий.
На рисунке I представлена схема электронтранспортной цепи митохондрий растительной клетки и показаны точки приложения ингибиторов. Среди ингибиторов митохондриального окисления наиболее широкое применение получили антимицин А и цианид, прерывающие поток электронов в средней и терминальной областях цепи переноса электронов.
Антимицин А - специфический ингибитор третьего сегмента электронтранспортной цепи митохондрий (Котельникова,1967; Скулачев, 1969, 1972) между цитохромами ви Ст (рис.1). Антимицин связывается с митохондриями необратимо, что является важным свойством ингибитора. В настоящее время нет определенных сведений относительно механизма действия антимицина. Предполагалось, что точка приложения этого яда - негеминовое железо в области цитохрома в (Котельникова, Звягильская, 1973). Однако большинство исследователей склоняется к мнению, что антимицин является аллостерическим ингибитором переноса электронов по дыхательной цепи (Bryla et al. , 1969, 1971; Кондрашова, Г97І; Berden, Slater , 1972; Котельникова, Звягильская, 1973).
Метод определения интенсивности дыхания
Объектом исследования являлась яровая пшеница сортов "Московская-35" и "Харьковская-46", районированных в TACGP. Для экспериментов использовали корни 5-7 дневных проростков пшеницы, так как они являются удобной моделью для проведения экспериментов в лабораторных условиях.
Семена замачивали в водопроводной воде и затем высевали на стекло, покрытое влажной марлей и помещенное в кювету с раствором СаС12 (2,5 10 "%). Такая методика выращивания позволяет избежать анаэробиоза, так как корни стелются по поверхности марли, закрепляются в ней, не испытывают недостатка во влаге. Кроме того, при подготовке к опыту растения с корнями легко извлекаются из марли без повреждений.
Опыты с митохондриальными ядами проводились на пшенице сорта "Харьковская-46", а с аминазином - на пшенице сорта "Московская-35".
Повторность опытов 3-Ю кратная. Повторность вариантов 3-4 кратная. Все полученные результаты обработаны статистически по Вознесенскому (1969). Расчеты проводились на ЭВМ "Наири-3".
class3 ДЕЙСТВИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО
ДЫХАНИЯ НА ГАЗООБМЕН И УЛЬТРАСТРУКТУРУ КЛЕТОК КОРНЕЙ
ПШЕНИЦЫ class3
Характеристика функционального состояния клеток корней пшеницы контрольного варианта во времени
В наших опытах в качестве контроля служили корни, которые инкубировались в растворе СаС12 в течение длительного времени (до б-ти часов). Электронномикроскопические наблюдения клеток контрольного варианта в динамике показали, что клетки корней пшеницы, выращенные в течение 5-7 дней на растворе СаСІг , содержат митохондрии овальной или округлой формы со средней плотностью матрикса и плотно упакованными многочисленными кристами, что соответствует ортодоксальному типу митохондрий (рис.2). Профили эндоплазматического ретикулума в виде каналов, к мембранам которых прикреплены рибосомы, расположены, в основном, параллельно клеточной стенке (рис.26). Комплекс Гольджи представлен диктиосомами (рис.3). В цитоплазме находится большое количество свободных рибосом и полисом. Ядро с равномерно расположенным хроматином имеет овальную или сферическую форму (рис.2а).
Процесс отсечения корней от проростков не оказывал существенного влияния на морфологию составляющих их клеток. Небольшие изменения в ходе б-ти часового опыта касались лишь исключительно эндоплазматического ретикулума и митохондрий.
Через Г час после отсечения корней наблюдалось разбухание терминальных участков каналов эндоплазматического ретикулума (рис.3). Через 2 часа инкубации картина строения этого органоида возвращалась к исходному состоянию.
Появление кольцевых (тороидалшых) митохобдрий в процессе ответной реакции на действие митохондриальных ядов
Большинство митохондрий после целого ряда изменений, происходящих с ними в течение всего 6-ти часового опыта, приобретало обычную овальную форму (рис.27). Вместе с тем после действия автимицина и цианида, когда дыхание корней, подавленное на 50$ в первые часы воздействия, выходило на стимуляцию (рис.8), в клетках появлялись митохондрии, имеющие на срезе вид колец (рис.22 ,2 8,29). Ультра структура кольцевых митохондрий не отличалась от митохондрий обычной формы. В случае с антимицином они имели средней плотности матрикс и многочисленные кристы (рис.22). В случае же с цианидом матрикс митохондрий был сильно просветлен, а количество крист уменьшено (рис.28,29). Интересно отметить, что при действии цианида кольцевых профилей митохондрий встречается намного больше, чем при действии антимицина.
Подобные профили митохондрий описаны в сперматозоидах рыб (Mattel , 1981) и голотурии Cucumaria miniata (Fontaine, Lambert , 1976), при гаметогенезе у растений ( Ches-noy et al. , 1974; Tourte , 1975; Medina et al. , 1981; Lig-rone et al. , 1982), в меристематических клетках Allium сера при обработке колхицином ( Mesquita, 1966), в кортексе междоузлий харовых водорослей при действии целого ряда ингибиторов ( в том числе антимицина А и кот ) ( Poissner , 1983). Одни авторы считают, что в трехмерном пространстве это чашевидные митохондрии (Tourte , 1975; Medina et al. , 1981), другие - кольцевые (Mattel , 1981), третьи просто описывают кольцевые профили, не говоря о форме митохондрий (Mesquita,1966; Chesnoy et al. , 1974). Мы склонны считать, что в нашем случае митохондрии имеют форму тора ("бублика").
Наиболее убедительным свидетельством в пользу тороидальной формы митохондрий, на наш взгляд, является наличие на срезах профилей, показанных на рисунке 29а . Такие профили могут быть получены либо при сечении тора (не обязательно правильного), либо при.сечении чаши с двумя лепестками (рис.30). Однако нет никаких причин, по которым бы чаша не могла иметь три и более лепестков. В таком случае на срезах должны бы были наблюдаться профили с тремя и более перетяжками, чего не наблюдается. Поэтому, скорее всего, наличие таких профилей связано не со специфическими вариациями формы чаши, а с тороидальной топологией митохондрий. В пользу тора говорит и то, что кольцевые профили могут достигать очень больших размеров, превышающих в некоторых случаях в несколько раз размеры овальных митохондрий (рис.22а,28). При таких линейных размерах объем чашевидной митохондрии (как будет показано ниже) должен намного превосходить объем обычной овальной митохондрии. На построение таких митохондрий потребовалось бы очень много энергии, а в период, предшествующий образованию подобных митохондрий, мы наблюдали сильное подавление дыхания.
Появление кольцевых (тороидалшых) митохобдрий в процессе ответной реакции на действие митохондриальных ядов
В первые часы воздействия низкой концентрацией аминазина (5 ЮМ) на клетки корней пшеницы отмечалась слабая стимуляция дыхания, усиливающаяся к 5-6-ому часу опыта (рис.33). В цитоплазме клеток наблюдалась незначительная пролиферация эндоплазматического ретикулума. Видимых изменений аппарата Гольджи нет. Большинство митохондрий на протяжении всего опыта имеет просветленный матрикс, некоторые из них набухают и округляются, кристы во всех митохондриях присутствуют (рис.34). Просветление митохондрий, по-видимому, связано с нарушением ионного гомеостаза, о чем можно судить по выходу ионов К+ в инкубационный раствор (рис.35). Следует обратить особое внимание на выход калия после 2-х часов действия аминазина. Ионов в раствор выходит почти в 1,5 раза меньше, чем в контроле. Возможно,этим обусловлена и стимуляция потребления кислорода корнями, так как помимо активации окислительной системы эндоплазматического ретикулума может происходить возрастание энергетических затрат на поддержание ионного гомеостаза клетки. Увеличение пассивной проницаемости мембран для ионов К+ при действии аминазина, вероятно, компенсируется активной обратной закачкой их, которая через 2 часа может даже превысить контрольный уровень.
