Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Функциональная анатомия корня кукурузы 10
1.2. Корень как тест-объект 17
1.3. Физиологическая роль Ni у высших растений 19
1.4. Поглощение Ni растениями 25
1.5. Распределение Ni по органам растений. Механизмы и роль гипераккумуляции 28
1.6. Распределение Ni по тканям растений 34
1.7. Транспорт Ni по растению 36
1.8. Внутриклеточная локализация Ni 41
1.9. Влияние Ni на активность различных ферментов 44
1.10. Влияние Ni на минеральное питание 49
1.11. Действие Ni на водный режим 52
1.12. Влияние Ni на фотосинтез 53
1.13. ВлияниеМ на рост и морфогенез 56
Глава 2. Материал и методы исследования 60
2.1. Выращивание и обработка растений, оценка токсичности металлов 60
2.2. Разработка гистохимического метода 63
2.3. Изучение распределения Ni по тканям и органам проростков кукурузы 65
2.4. Изучение распределения Ni в декапитированных корнях 66
2.5. Количественное определение содержания Ni и Са в проростках кукурузы 66
2.6. Клеточный анализ токсического действия Ni на рост корня и выявление структурных изменений в меристематических тканях корня 67
2.7. Статистическая обработка результатов 69
Глава 3. Результаты 70
3.1. Влияние Ni на рост проростков кукурузы
3.1.1. Действие Ni на рост проростков и образование боковых корней 70
3.1.2. Влияние Са на ростингибирующее действие Ni 71
3.1.3. Влияние Sr на ростингибирующее действие Ni 72
3.1.4. Действие Ni на рост проростков на питательном растворе 73
3.1.5. Токсическое действие Ni на прорастание зерновок кукурузы 74
3.2. Распределение Ni по тканям и органам проростков кукурузы
3.2.1. Локализация Ni в корнях и побегах в отсутствие Са 74
3.2.2. Распределение Ni при нетоксичной концентрации 76
3.2.3. Распределением в декапитированныхкорнях: выявление роли эндодермы в транспорте Ni 77
3.2.4. Локализация Ni в корнях и побегах в присутствии Са (ЗмМ) 78
3.2.5. Локализация Ni в корнях и побегах в присутствии Sr (ЗмМ) 80
3.2.6. Локализация Ni в проростках при инкубации на питательном растворе 80
3.2.7. Содержание Ni в корнях и побегах проростков кукурузы 83
3.2.8. Содержание Ni в корнях и побегах проростков кукурузы, выращенных на питательном растворе 84
3.2.9. Содержание Са в корнях и побегах проростков кукурузы 85
3.2.10. Распределение Ni в прорастающих зерновках кукурузы 86
3.3. Клеточный анализ токсического действия Ni на рост корня и выявление структурных изменений в меристематических тканях корня
3.3.1. Влияние Ni на деление и растяжение клеток 87
3.3.2. Влияние Ni на деление и рост клеток колумеллы корневого чехлика 88
3.3.3. Влияние Ni на структуру меристемы 88
3.3.4. Снижение токсического действия Ni на деление и рост клеток в присутствии Са 89
Глава 4. Обсуждение 90
Выводы 103
Список литературы 104
Приложение 123
- Распределение Ni по органам растений. Механизмы и роль гипераккумуляции
- Клеточный анализ токсического действия Ni на рост корня и выявление структурных изменений в меристематических тканях корня
- Локализация Ni в проростках при инкубации на питательном растворе
- Клеточный анализ токсического действия Ni на рост корня и выявление структурных изменений в меристематических тканях корня
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами становится все более актуальной. Одним из распространённых тяжёлых металлов является никель (Ni). В среднем общее содержание Ni в почве колеблется от 2 до 750 мг / кг почвы, достигая максимальных значений в серпентиновых почвах (Бингам, 1993). Поступление Ni в биосферу вследствие техногенного рассеяния осуществляется различными путями: с выбросами при высокотемпературных процессах (металлургия, обжиг цементного сырья, сжигание топлива), с осадками бытовых сточных вод, при выносе тяжёлых металлов из отвалов рудников или металлургических предприятий, при постоянном внесении высоких доз удобрений и пестицидов, содержащих примеси тяжёлых металлов (Добровольский, 1997; Орлов и др., 2002; Ягодин, 2002). В организм человека и животных большая часть Ni поступает из растительной пищи.
По существующей в настоящее время классификации все растения подразделяют на три группы: 1) аккумуляторы, накапливающие металлы в основном в надземных органах как при высоких, так и при низких концентрациях металлов в почве; 2) индикаторы, концентрация металлов в которых отражает уровень их содержания в окружающей среде; 3) исключатели, у которых поступление металлов в побеги ограничено, несмотря на их высокую концентрацию в среде и накопление в корнях (Baker, 1981; Antosiewicz, 1992). Растения-аккумуляторы используются для фиторемедиации - «зеленой» технологии очистки почвы и воды от тяжелых металлов (Raskin, Ensley, 2000; Meagher, 2000; Kramer, 2005; do Nascimento, Xing, 2006). Разрабатываются методики получения и применения трансгенных растений-аккумуляторов, обладающих повышенной способностью накапливать тяжелые металлы и устойчивостью к ним (Clemens et al., 2002; Kramer, 2005). Однако механизмы, определяющие способность аккумуляторов накапливать металлы, еще далеко не ясны.
В середине 70-х годов было установлено, что Ni является ультрамикроэлементом и входит в состав металлофермента уреазы, ответственного за гидролитическое расщепление мочевины (Dixon et al., 1975; Fishbein et al., 1976).
Показано, что в среднем для нормального роста растения необходимо примерно 0.01-5 мкг Ni / г сухой массы (Welch, 1981).
Однако, как и любой другой тяжелый металл, при повышенных концентрациях Ni подавляет различные физиологические процессы - поглощение и транспорт минеральных элементов (Piccini, Malavolta, 1992; Барсукова, Гамзикова, 1999), транспирацию (Bishnoi et al., 1993; Molas, 1997), фотосинтез (Sheoran et al., 1990; Krupa, Baszynski, 1995), и снижает активность ряда ферментов (Kevresan et al., 1998; Schickler et al., 1999). При высоких концентрациях Ni ингибировал рост и развитие растений (Samantaray et al., 1997/98; Ewais, 1997) как в результате нарушения метаболизма, так и вследствие более избирательного действия на деление клеток (Knasmuller et al., 1998; Sresty, Madhava Rao, 1999).
Физиологическая роль Ni, а также его токсичность (в высоких концентрациях) определяют важность изучения закономерностей его накопления, транспорта и распределения у разных видов растений, в том числе и сельскохозяйственных.
Не смотря на то, что достаточно много работ посвящено исследованию накопления Ni в органах растений (Reeves et al., 1999; Андреева и др., 2001), остается практически не изученным распределение Ni на тканевом уровне. Для растений-гипераккумуляторов показано его накопление в эпидермисе и проводящих тканях побегов (Heath et al., 1997; Kupper et al., 2001; Bidwell et al., 2004). Однако для растений других групп закономерности распределения Ni по тканям остаются неизученными, что во многом определяется недостаточной разработанностью гистохимических методов выявления Ni.
Для понимания общих закономерностей токсичности тяжелых металлов представляет большой интерес выяснить специфику накопления и токсического действия Ni по сравнению с другими тяжелыми металлами, различающимися по сродству к функциональным группам биополимеров.
Для оценки токсичности ряда соединений, в том числе и тяжелых металлов, используется корневой тест, основанный на анализе характера ингибирования роста корня (Wilkins, 1978; Liu et al., 1995; Wang, 1987; Ivanov, 1994). В то же время механизм ростингибирующего действия металлов остается малоизученным.
Для выявления механизмов токсического действия Ni на рост представляется необходимым изучить связь между локализацией Ni и степенью проявления его токсического действия на рост, что являлось одной из задач настоящей работы. Кроме того, для понимания механизма ростингибирующего действия Ni важно выяснить, насколько избирательно он подавляет деление и растяжение клеток корня, так как именно этими двумя процессами определяется его рост.
Ряд факторов может оказывать влияние на поглощение, распределение металлов, а следовательно - и на их токсическое действие. Важную роль в этом играют ионы Са, в присутствии которых иигибирующее действие тяжелых металлов на рост в большинстве случаев снижается (Gabbrielli, Pandolfini, 1984; Алексеев, Вялушкина, 2002). Однако не ясно, связано ли влияние Са с его функцией вторичного мессенджера или же основную роль играет конкуренция с ионами металлов за общие места связывания при их поступлении в клетки и транспорте по тканям.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования было изучить основные закономерности распределения Ni по органам и тканям проростков кукурузы, выявить связь между локализацией металла и его токсическим действием на рост, а также изучить влияние кальция на распределение и токсическое действие Ni.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: изучить токсическое действие Ni на рост проростков кукурузы, выявить его влияние на деление и растяжение клеток; модифицировать гистохимический метод для выявления Ni; с помощью гистохимического анализа и количественного анализа изучить распределение Ni по тканям и органам проростков кукурузы в зависимости от его концентрации в растворе и времени экспозиции; установить, как ингибирование роста проростков под действием Ni связано с особенностями его локализации в тканях и органах; изучить влияние Са на распределение и токсическое действие Ni; изучить влияние Ni на прорастание зерновок кукурузы в связи с особенностями его распределения по тканям прорастающих зерновок.
Научная новизна работы. В данной работе предложен усовершенствованный метод гистохимического определения Ni, основанный на применении диметилглиоксима. С помощью этого метода установлены закономерности распределения Ni в живых тканях корня и побега проростков кукурузы и выявлены особенности транспорта этого металла. Показано, что Ni поступает через эндодерму в ткани центрального цилиндра по симпласту даже при его нетоксичной концентрации в растворе. Это позволило сделать вывод о том, что эндодерма не является универсальным барьером для поступления тяжелых металлов в ткани центрального цилиндра корня. Установлена причина ингибирования ветвления корня Ni. Показано влияние Са на накопление, распределение и токсическое действие Ni. Снижение содержания Ni в апикальном участке корня в присутствии как Са, так и Sr (использованного в качестве аналога Са) свидетельствует о том, что «защитное» действие Са определяется главным образом конкуренцией ионов Ni и Са при поглощении и транспорте. Исследован механизм ростингибирующего действия Ni, оценено его влияние на деление и растяжение клеток. Изучено влияние Ni на прорастание зерновок кукурузы в связи с особенностями его распределения по тканям прорастающих зерновок.
Теоретическая и практическая значимость работы. Предложенный гистохимический метод может быть использован для изучения поступления и распределения Ni в растениях, а также может применяться при проведении экологического мониторинга.
Изучение особенностей распределения и токсического действия никеля имеет немаловажное значение, так как никель существенно отличается от ряда других тяжелых металлов по сродству к функциональным группам биополимеров. Впервые полученные данные о тканевом распределении никеля в корнях и побегах растения-исключателя имеют существенное значение для понимания особенностей токсического действия тяжелых металлов на растения с различными стратегиями выживания.
Показана возможность использования Sr для выяснения влияния Са на транспорт и распределение тяжелых металлов.
Основные положения, выносимые на защиту; ростингибирующее действие Ni обусловлено главным образом его действием на деление клеток и, в меньшей степени, - на их растяжение; накопление Ni в тканях и участках корня зависит от его концентрации в растворе, времени экспозиции и от присутствия Са в среде; Ni аккумулируется преимущественно в протопластах клеток; эндодерма не играет барьерной роли в транспорте Ni в центральный цилиндр корня, являясь тем не менее одним из основных мест его аккумуляции; накопление Ni в протопластах клеток перицикла является основной причиной ингибирования ветвления корня; ограниченное поступление Ni в побеги, несмотря на его накопление в тканях центрального цилиндра корня, определяет его незначительное ингибирующее действие на их рост; «защитное» действие Са обусловлено не его физиологической ролью, а конкуренцией с ионами Ni при поглощении и транспорте; накопление Ni в протопластах клеток зародыша после наклевывания зерновок определяет его большее токсическое действие на прорастание по сравнению с наклевыванием.
Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на I Молодёжной конференции ИФР РАН (Москва, 2003), на Межвузовской студенческой конференции МПГУ (Москва, 2003), на V Съезде Общества Физиологов Растений России (Пенза, 2003), на VIII Молодёжной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004), на Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений севера» (Петрозаводск, 2004), на III Молодежном научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екатеринбург, 2004), на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на IV Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005), на конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005), на I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-
Петербург, 2006), на конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006), на семинарах лаборатории физиологии корня ИФР РАН (Москва, 2003 - 2006), а также на семинаре лаборатории экологии и физиологии растений Свободного университета (Амстердам, 2006).
Структура и объём диссертации.
Работа изложена на 207 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов. Иллюстративный материал находится в приложении. Список литературы включает 208 источников, из них 162 иностранных авторов. Работа содержит 14 таблиц и 119 рисунков, из них 8 таблиц и 116 рисунков находятся в приложении.
Распределение Ni по органам растений. Механизмы и роль гипераккумуляции
Разные виды растений обладают неодинаковой способностью накапливать металлы. Причём это касается не только количества, но и соотношения их содержания в различных органах растений. Аккумуляция больших количеств металлов некоторыми видами во многом определяется морфофизиологическими особенностями растений. Как уже было упомянуто выше, по существующей в настоящее время классификации все растения подразделяют на три группы: 1) аккумуляторы, накапливающие металлы в основном в надземных органах как при высоких, так и при низких концентрациях металлов в почве; 2) индикаторы, концентрация металлов в которых отражает уровень их содержания в окружающей среде; 3) исключатели, у которых поступление металлов в побеги ограничено, несмотря на их высокую концентрацию в среде и накопление в корнях (Baker, 1981; Antosiewicz, 1992). При этом содержание металла в надземных органах аккумуляторов и корневой системе исключателей может существенно превышать его содержание в почве.
Среди растений-аккумуляторов Ni выделяют особую группу гипераккумуляторов, к которой относят виды, накапливающие в побегах более 1000 мг металла на килограмм сухой массы. Впервые этот термин употребил Brooks (Brooks et al., 1977). К настоящему времени установлено около 300 видов-гипераккумуляторов Ni, большинство из которых относится к семействам Asterасеае (27), Brassicaceae (82), Вихасеае (17), Euphorbiaceae (83), Flacourtiaceae (19), Rubiaceae (12), Violaceae (9) и произрастает на серпентиновых почвах в тропической и субтропической зонах (Куба, Новая Каледония, Индонезия, Филиппины, Бразилия, Австралия (Квинсленд), Южная Африка (Зимбабве), Средиземноморье) (Raskin, Ensley, 2000) (Табл. 1). Так, например, на Кубе найдено 130 гипераккумуляторов, принадлежащих главным образом к родам Buxus, Phyllanthus, Leucocroton, Euphorbia, Pentacalia, Senecio, Psychotria, Ouratea, Tetralix (Reeves et al., 1999). Интересно, что популяции с разных типов почв могут отличаться по способности накапливать Ni и по устойчивости к нему (Assuncao et al., 20036). В России серпентиновые почвы встречаются, например, на Полярном Урале, однако серпентинитовая флора там довольно бедна - из видов-гипераккумуляторов Ni там произрастают Alyssum obovatum и Thlaspi cohleariforme {Brassicaceae) (Катаева, 2006).
До сих пор нет единого мнения относительно механизма гипераккумуляции. Например, согласно представлениям Boyd и Martens, гипераккумуляторы обладают наиболее эффективной системой поглощения ионов, функции которой ещё не исследованы ("the inadvertent uptake hypothesis") (Boyd, Martens, 1998; Алексеева и др., 2001). Существует также несколько гипотез, объясняющих значение феномена гипераккумуляции. В соответствии с гипотезой «удаления» ("tolerance or disposal of metal from the plant"), гипераккумуляция рассматривается как один из механизмов устойчивости к высокому уровню содержания металлов в среде, при котором поглощаемый металл переносится в физиологически малоактивные компартменты клетки или в органы, которых растение может впоследствии лишиться (Boyd, Martens, 1998; Алексеева и др., 2001). Так, например, старые листья гипераккумулятора Psychotria douarrei накапливали существенно больше Ni, чем молодые (Davis et al., 2001а).
По гипотезе засухоустойчивости ("the drought resistance hypothesis"), накопление Ni в надземных органах может способствовать устойчивости растений к недостатку влаги, уменьшая кутикулярную транспирацию (см. ниже) (Severne, 1974; Boyd, Martens, 1998; Алексеева и др., 2001).
Согласно гипотезе "элементной аллелопатии" ("interference with neighbouring plants"), отмирание органов (например, листьев) с высоким содержанием тяжёлых металлов приводит к обогащению ими поверхности почвы и, как следствие, к ингибированию роста соседствующих неустойчивых к ним видов-конкурентов (Boyd, Martens, 1998; Алексеева и др., 2001).
Наибольшего развития получила так называемая гипотеза «защиты» ("metal-based plant defense against herbivores and/or pathogens" или "the defense hypothesis"), сторонники которой утверждают, что повышенный уровень содержания металлов в тканях (главным образом покровных) предотвращает проникновение и развитие в растении патогенных микроорганизмов. Кроме того, согласно этой гипотезе, аккумуляторы получают преимущество перед неаккумуляторами в том, что у них снижается необходимость тратить большие количества азота и углерода на создание органических соединений (таннинов, фенольных соединений), необходимых растениям для защиты от поедания животными (в основном, насекомыми) (Boyd, Martens, 1998; Sagner et al., 1998; Davis, Boyd, 2000; Davis et al., 2001a; Алексеева и др., 2001).
Гипотеза «защиты» получила подтверждение в ряде работ. Так, патогенный штамм Xanthomonas campestris pv. campestris не развивался в растениях Streptanthus polygaloides, аккумулировавших Ni, а рост паразитического гриба Erysiphe polygoni и некротрофного гриба Alternaria brassicola ингибировался (Boyd et al., 1994). Результаты других экспериментов показали, что личинки Pieris гарае не окукливались и погибали, если их кормили листьями Streptanthus polygaloides.
Клеточный анализ токсического действия Ni на рост корня и выявление структурных изменений в меристематических тканях корня
Для определения локализации Ni в растениях, инкубировавшихся на растворах №(ЫОз)г (в различных вариантах) в течение 24, 48 часов, 5 (в отдельных вариантах) и 7 суток, с помощью безопасной бритвы были приготовлены серии поперечных срезов корня, колеоптиля и мезокотиля (на разном расстоянии от зерновки) и первой пары листьев (на разном расстоянии от основания). Кроме того, был проведен анализ распределения Ni в различных участках корня: апикальном (1-ый сантиметр от кончика корня), среднем (между апикальным и базальным) и базалыюм (первые 2-3 см от зерновки в зависимости от длины корня). Помимо этого, были сделаны продольные срезы корня. Для выявления распределения Ni по тканям прорастающих зерновок с помощью безопасной бритвы готовили серии поперечных и продольных срезов зерновок. Анализ проводили через 24,48 и 72 ч после начала инкубации.
Для выявления внутриклеточной локализации Ni был проведен гистохимический анализ распределения Ni в плазмолизированных клетках. Для этого проростки, инкубировавшиеся в течение 7 суток на Л питательного раствора Хогланда в присутствии №(Ж)з)г (75 мкМ), выдерживали в течение 1 часа в на растворе сахарозы (0,7 М). Затем корни ополаскивали дистиллированной водой и приготавливали поперечные срезы.
Серии срезов помещали на предметное стекло, на которое наносили 3-4 капли раствора аналитического реагента, накрывали покровным стеклом и через несколько минут рассматривали под микроскопом Amplival (Carl Zeiss, Германия) при разных увеличениях. Локализацию Ni определяли по малиновому окрашиванию тканей корня и побега. Микрофотографии получены с временных препаратов с помощью видеокамеры JVC ТК-С1480Е (Таиланд).
Распределение Ni по участкам корня было также изучено на интактных корнях проростков, инкубировавшихся в течение 7 суток на растворах с различными концентрациями солей. Для этого корни проростков обрабатывали в течение нескольких минут раствором диметилглиоксима. О локализации металла судили по малиновому окрашиванию.
Изучение распределения Ni в декапитированных корнях Был проведен ряд опытов, чтобы выяснить, поступает ли Ni в ткани центрального цилиндра корня, проходя через эндодермальный барьер или поглощаясь в зонах деления и растяжения, где эндодерма недифференцирована, и затем транспортируясь вверх по ксилеме. Для этого главный корень проростков обрезали на расстоянии 1 см от кончика, так как примерно на этом расстоянии у контрольных корней заканчивается растяжение клеток и начинается формирование поясков Каспари. Для декапитации были выбраны трехдневные проростки с длиной корня 40-60мм, эндодерма которых находится на первичной стадии развития, когда на радиальных клеточных оболочках ближе к перициклу выявляются пятна Каспари (Zeier et al., 1999). Место среза замазывали ланолином или вазелином для предотвращения поступления металла через поверхность среза. Проростки выращивали на растворе Ni(N03)2 в концентрации 1 мкМ в течение пяти суток. Контролем служили проростки с необрезанными корнями, инкубировавшиеся на растворе Ni(N03)2 в той же концентрации. При данной концентрации №(N03)2 не оказывает токсического действия на рост (в течение пяти суток).
Количественное определение содержания Ni и Са в проростках кукурузы Содержание Ni и Са определяли в побегах и разных участках корней (в базальном участке - в третьем сантиметре от зерновки, и в апикальном участке - в первом сантиметре от кончика корня) проростков, инкубировавшихся на растворах №(Ж)з)г (35 мкМ) в отсутствие или в присутствии Ca(N03)2 (3 мМ) в течение 24 или 48 ч. Контрольные проростки выращивали на дистиллированной воде или растворе Ca(N03)2 (3 мМ), соответственно. Перед разделением на участки корни были промыты.
Побеги и участки корней взвешивали и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при 80 С в течение 24ч. Высушенные образцы взвешивали и подвергали сухому озолению в кварцевых чашках в течение 48ч при 450 С в муфельной печи. К озоленной пробе добавляли Змл 2н НС1, накрывали чашку часовым стеклом и кипятили на слабом огне в течение 1-2 мин. После остывания анализируемую пробу фильтровали и доводили бидистиллированной водой до 10мл. Полученную пробу перед анализом разбавляли бидистиллированной водой в 10 раз (в случае побегов) или в 5 раз (в случае корней). В пробы, предназначенные для количественного анализа содержания Са, добавляли 10%-ный раствор SrCl2 в таком соотношении, чтобы его концентрация в пробе составляла 1%.
Количественный анализ проводили по стандартной методике на атомно-абсорбционном спектрофотометре "Квант-Афа» (Россия) при любезном содействии сотрудников лаборатории экологии растительных сообществ БИН РАН. Измерение содержания металлов в каждом образце проводили не менее трех раз.
Содержание Ni оценивали также в побегах и в апикальном и базальном участках корней кукурузы через сутки, двое и пять суток после начала инкубации на V раствора Хогланда в присутствии Ni(N03)2 (75мкМ). Перед разделением на участки корни были отмыты в течение нескольких минут в 3 мМ Ca(N03)2 и промыты дистиллированной водой.
Образцы взвешивали и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при 80С в течение 24ч. Высушенные образцы подвергали мокрому озолению при 140С в течении 7ч в тефлоновых бомбах, добавив предварительно к образцам 1мл смеси HN03 (65%) и НС1 (37%) в соотношении 4:1. Полученную пробу разводили в 5 раз бидистиллированной водой. Количественный анализ проводили по стандартной методике на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer 1100В (Нидерланды) при любезном содействии сотрудников лаборатории экологии и физиологии растений Свободного университета (Амстердам). Анализ был проведен не менее 4 раз в независимых повторностях.
Локализация Ni в проростках при инкубации на питательном растворе
При инкубации проростков на ХА питательного раствора Хогланда (без микроэлементов) с добавлением 30 мкМ Ni(N03)2 на первые и вторые сутки инкубации содержание Ni в тканях корня было ниже предела определения диметилглиоксимного метода (рис.67)..
В присутствии 60 мкМ Ni(N03)2 в питательном растворе на вторые сутки инкубации клетки корневого чехлика, меристемы, а также зоны растяжения (апикальный участок корня) не окрашивались (рис.68). В среднем участке корня Ni был выявлен во всех тканях корня, главным образом в протопластах клеток (рис.69). В коре скопления кристаллов диметилглиоксимина Ni были также обнаружены в межклетниках (рис.69). Наиболее интенсивно окрашивались отдельные клетки эндодермы и, часто, прилегающие к ним клетки коры. На ряде препаратов клетки гиподермы (наружный слой клеток коры, подлежащий под ризодермой), были окрашены более интенсивно по сравнению с клетками ризодермы и коры. В базальном участке корня окрашивание эндодермы возрастало. Кристаллы диметилглиоксимина Ni встречались во всех тканях корня. Основные закономерности тканевого распределения Ni сохранялись. На седьмые сутки экспозиции окрашивание тканей корня было более интенсивным по сравнению со вторыми сутками, в особенности окрашивание эндодермы и тканей центрального цилиндра корня.
При увеличении концентрации №(N03)2 в питательном растворе до 70 мкМ накопление Ni в тканях корня возрастало. В отличие от проростков на 60 мкМ Ni(N03)2, при 70 мкМ №(Ж)з)2 на вторые сутки инкубации окрашивались все ткани апикального участка корня (рис.70,71), а также чехлик и корневая слизь. Скопления кристаллов диметилглиоксимина Ni были обнаружены в клетках эндодермы и сосудах метаксилемы (рис.70,71). В среднем и базальном участках корня также окрашивались все ткани. Окрашивание тканей апикального участка корня было значительно менее интенсивным по сравнению со средним и базальным участками. На седьмые сутки закономерности распределения Ni по тканям и участкам корня сохранялись. В целом содержание Ni в тканях с течением времени инкубации возрастало.
При инкубации проростков на питательном растворе в присутствии Ni(N03)2 в концентрации 75 мкМ кристаллы диметилглиоксимина Ni были найдены во всех тканях корня уже на первые сутки. На вторые сутки экспозиции окрашивание было отмечено также для корневой слизи (рис.72). Ткани апикального участка окрашивались менее интенсивно, чем ткани среднего и базального участков. В клетках недифференцированных сосудов ксилемы и других клетках меристемы окрашивание в области ядра было менее интенсивным по сравнению с цитоплазмой, а на границе с ядерной оболочкой в протопласте было выявлено скопление кристаллов диметилглиоксимина Ni. В среднем участке корня наблюдались скопления кристаллов диметилглиоксимина Ni в протопластах клеток эндодермы, в протопластах и межклетниках коры, в сосудах прото- и метаксилемы (рис.73-75). В базальном участке наиболее интенсивно окрашивались клетки эндодермы.
На пятые сутки инкубации в присутствии Ni(N03)2 (75 мкМ) окрашивание тканей было более интенсивным по сравнению со вторыми сутками. Основные закономерности тканевого распределения Ni сохранялись, однако интенсивное окрашивание было отмечено также для клеток ризодермы в среднем участке корня. На пятые и седьмые сутки инкубации сохранялся характер распределения Ni по участкам корня: интенсивность окрашивания убывала в следующем порядке: базальный участок средний участок апикальный участок (рис.76, 77). Накопление Ni в тканях корня на седьмые сутки возрастало. В базальном участке содержание Ni было наибольшим в клетках эндодермы и перицикла. Ризодерма и кора окрашивались более слабо, чем ткани центрального цилиндра (рис.77, 78). На ряде срезов было отмечено большее накопление Ni в экзодерме по сравнению с клетками ризодермы и подлежащими слоями коры (рис.78). В побегах немногочисленные кристаллы диметилглиоксимина Ni иногда были обнаружены на пятые и седьмые сутки в проводящих тканях, а также в эндодерме мезокотиля и трихомах листа (рис. 79).
При экспозиции на питательном растворе с добавлением 80мкМ №(N03)2 окрашивание тканей на вторые и седьмые сутки инкубации было немного более интенсивным по сравнению с проростками на растворе с добавлением 75мкМ Ni(N03)2, однако основные закономерности распределения Ni по тканям и участкам корня сохранялись (рис.80).
Для выявления внутриклеточной локализации Ni был проведен гистохимический анализ распределения Ni в плазмолизированных клетках. Для этого проростки, инкубировавшиеся в течение 7 суток на ХА питательного раствора Хогланда в присутствии Ni(N03)2 (75 мкМ), выдерживали в течение 1 часа в на растворе сахарозы (0,7 М). В плазмолизированных клетках коры корня Ni был выявлен не только в протопластах, но также в большом количестве в периплазматическом пространстве (рис.81). При этом клеточные оболочки не окрашивались. Таким образом, при инкубации на питательном растворе основные закономерности тканевого распределения Ni остаются неизменными: преимущественно он накапливается в эндодерме и перицикле. Однако при этом в апикальном участке окрашивание тканей слабее, чем в вышележащих участках корня, что наиболее четко заметно на седьмые сутки инкубации. При нетоксичных концентрациях Ni(N03)2 содержание Ni в клетках меристемы обычно ниже предела определения диметилглиоксимного метода.
Клеточный анализ токсического действия Ni на рост корня и выявление структурных изменений в меристематических тканях корня
На первые сутки инкубации в присутствии №(N03)2 (35 мкМ) содержание Са (мкг/г сухой массы) в корнях проростков было ниже примерно на 20% по сравнению с таковым в корнях контрольных проростков, инкубировавшихся на дистиллированной воде (рис. 89). При этом как в контрольных, так и в выращенных в присутствии Ni проростках содержание Са в апикальном участке корня было немного выше, чем в базальном (рис. 89). Однако при пересчете на участок корня, соотношение изменялось: количество Са в апикальном участке корня было немного ниже, чем в базальном (рис.90 ).
При выращивании проростков в присутствии Са (3 мМ), его содержание в базальном участке корня возрастало примерно в 2,8 раза, а в апикальном участке -в 1,4 раза. В присутствии Ni накопление Са (мкг/г сухой массы) в апикальном и базальном участках корня снижалось на 12 и 21% от контроля, соответственно, что в пересчете на участок корня - примерно на 10% в обоих участках (рис.89,90). То есть соотношение между содержанием Са в различных участках корня значительно не изменялось: в базальном участке накапливалось примерно в 3 раза больше Са, чем в апикальном (как в отсутствие, так и в присутствии Ni).
На вторые сутки инкубации количество Са в корнях во всех вариантах опыта возрастало, достигая наибольших значений у проростков, инкубировавшихся на растворе Са(ЫОз)2 (рис.91,92). В контрольных вариантах, а также при экспозиции на растворе Ni(N03)2 в присутствии Са содержание последнего (мкг/г сухой массы) в апикальном участке корня было ниже, чем в базальном участке, и выше, чем в побегах. Напротив, при инкубации проростков на растворе Ni(N03)2 в отсутствие Са, в апикальном участке происходило накопление Са (до 211% от контроля), в то время как его содержание в базальном участке корня и побеге было ниже, чем в других вариантах опыта (на 32% и 48% ниже, чем в базальном участке корня и побегах контрольных проростков)(рис.91).
При пересчете содержания Са на участок корня или побег было показано, что суммарное накопление Са (апикальный и базальный участки корня + побег) в проростках, выращенных на растворе Ni(N03)2, ниже, чем в других вариантах (рис.92,93). Суммарное накопление Са в проростках, инкубировавшихся на растворе Ni(N03)2 в присутствии Са, было сходным с таковым для проростков, выращенных на воде, в то время как по сравнению с проростками, выращенными на растворе Са(М)з)2, содержание Са в участках корня и побегах было приблизительно на 18-23% ниже. При расчете содержания металла в мкг/г сухой массы, снижение накопления Са в присутствии Ni имело более выраженный характер: содержание Са в корнях и побегах уменьшалось примерно на 37% (апикальный участок), 32% (базальный участок) и 38% (побег) (рис.91)..,
Содержание Са в мкг/г сухой массы побегов во всех вариантах опыта было ниже, чем содержание Са в мкг/г сухой массы апикального или базального участков корня. При расчете содержания металла в побегах было показано, что количество Са в надземных органах проростков, инкубировавшихся на растворе №(N03)2 в отсутствие Са, было на 65% ниже, чем в контроле (вода). Содержание Са в побегах проростков, выращенных на растворе №(N03)2 в присутствии Са, составляло примерно 62% от соответствующего контроля (рис.93) и было сходным с количеством Са в побегах проростков, выращенных на дистиллированной воде.
. Распределение Ni в прорастающих зерновках кукурузы После первых суток инкубации содержание Ni в зерновках было ниже предела определения диметилглиоксимного метода. После двух суток Ni был найден практически во всех тканях зерновок (рис.94). Наиболее интенсивное окрашивание наблюдалось в клетках перикарпа, а также в тканях зародыша. Менее интенсивное окрашивание было обнаружено в клетках щитка. В клетках эндосперма Ni практически полностью отсутствовал (рис.95). Вероятно, Ni проникает в ткани зародыша при нарушении целостности семенной кожуры при прорастании. С этим связано его большее токсическое действие на прорастание по сравнению с наклевыванием.
Через трое суток экспозиции содержание Ni в клетках перикарпа, зародыша и щитка значительно возрастало, о чем свидетельствовало более интенсивное окрашивание (рис.94,96). Ni был обнаружен как в протопластах клеток, так и в клеточных оболочках. Заметных различий в распределении металла по тканям зародышевого корня не наблюдалось. Интенсивность окрашивания всех тканей корня, включая клетки колеоризы была примерно одинаковой (рис. 96,97).
Накопление Ni главным образом в протопластах клеток всех тканей зародышевого корня, побега и клеток щитка позволяет предположить поступление ионов Ni через перикарп зерновок по симпласту. Преимущественная локализация Ni в симпласте при поступлении металла в ткани зародыша приводит к токсическому действию тяжёлого металла на рост зародышевого корня и побега, а следовательно, и к ингибированию прорастания. Никаких физиологических барьеров внутри зародыша, ограничивающих транспорт Ni, обнаружено не было.
Влияние Ni на деление и растяжение клеток В контрольных корнях митотический индекс (МИ) в первичной коре был сходным на первые и вторые сутки инкубации, и длина меристемы практически не изменялась (табл. 7). В присутствии №(N03)2 (35мкМ) уже на первые сутки инкубации МИ снижался почти в два раза по сравнению с контролем. На вторые сутки происходило дальнейшее уменьшение МИ, и он был в три раза ниже, чем в контрольных корнях (табл. 7). Скорость образования клеток падала до 35% от контроля за 1-ые сутки, а на 2-ые сутки деления практически прекращались. Продолжительность клеточного цикла возрастала в 2,2 и 19,5 раз по сравнению с контролем на 1-ые и 2-ые сутки, соответственно (табл. 7). В присутствии Ni уменьшалась длина меристемы. Однако значительное укорочение меристемы наблюдалось только на вторые сутки инкубации, когда ее длина составляла 57% от контроля (табл. 7, рис. 98,113-116). Ni оказывал токсическое действие не только на деление, но и на растяжение клеток, хотя последнее было заметно менее выражено. Длина закончивших рост клеток на первые сутки инкубации изменялась незначительно, а на вторые составляла 74% от контроля (табл.7,8). В контрольных корнях митотический индекс был значительно выше в клетках 1-го слоя, чем во Н-ом и Ш-ем слоях чехлика (табл.9, рис.99). Он не отличался в 1-ый и 2-ой день после начала опыта. Ni(N03)2 вызывал резкое подавление делений клеток всех трех слоев уже на первые сутки инкубации. По сравнению с контрольными корнями, эффект был сильнее выражен через 48 ч после начала опыта, когда митозы отсутствовали в III-ем слое (табл.9,рис.100). В контрольных корнях длина клеток 1-го слоя была существенно больше, чем П-го и Ш-его слоев (рис. 100,102). Клетки 1-го и Н-ого слоев в большинстве случаев являются сестринскими, то есть возникают после деления одной клетки. Чем меньше длины клеток, тем они ближе к моменту их образования в результате деления материнской клетки и тем меньше различаются длины клеток первых слоев. По мере роста отношение их длин возрастает в результате того, что клетки I-го слоя растут быстрее, чем П-го. Через 48ч Ni вызывал увеличение длины клеток первых трех слоев чехлика (рис. 102).
