Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1. Рост и развитие колеоптиля и мезокотиля проростков кукурузы 6
1.2. Гормональная регуляция роста и развития 12
1.3. Изменения роста, вызванные деэтиоляцией 27
1.4. Фитогормоны на начальных этапах роста проростков и их органов при деэтиоляции 37
1.5. Электрофизиологическая система регуляции роста и развития растений 42
1.6. Взаимосвязь электрофизиологической и гормональной систем регуляции роста и развития 59
2. Материал и методика 66
2.1. Изучение анатомического строения колеоптиля и мезокотиля проростка кукурузы 66
2.2. Исследование действия фитогормонов на рост и биоэлектропотенциалы органов проростка кукурузы 68
2.3. Измерение биоэлектропотенциалов (БЭП) тканей органов проростка 68
2.4. Измерение роста органов проростка 70
2.5. Измерение прироста мезокотилей, обработанных ИУК и кинетином в темноте и при облучении красным светом 73
2.6. Исследование действия красного света на БЭП 74
3. Результаты и обсуждение 75
3.1. Анатомическое строение органов зародыша кукурузы 75
3.2. Динамика развития тканей колеоптиля и мезокотиля проростков кукурузы 76
3.3. Действие фитогормонов на рост и БЭП отрезков органов проростков кукурузы 94
3.3.1. Ростовые и биоэлектрические реакции у отрезков корней с апексами 94
3.3.2. Ростовые и биоэлектрические реакции у отрезков колеоптилей 103
3.3.3. Ростовые и биоэлектрические реакции у отрезков листьев 110
3.3.4. Ростовые и биоэлектрические реакции у отрезков мезокотилей 118
3.4. Действие красного света на рост проростков кукурузы 138
3.5. Рост и деление клеток мезокотилей проростков кукурузы в темноте и при освещении красным светом 138
3.6. Действие красного света на биоэлектропотенциалы тканей колеоптильного узла и примыкающей к ней ростовой зоны мезокотиля 143
3.7. Действие ИУК и кинетина на рост мезокотилей в темноте и облучении красным светом 145
Выводы 149
Список литературы 151
- Фитогормоны на начальных этапах роста проростков и их органов при деэтиоляции
- Взаимосвязь электрофизиологической и гормональной систем регуляции роста и развития
- Измерение биоэлектропотенциалов (БЭП) тканей органов проростка
- Рост и деление клеток мезокотилей проростков кукурузы в темноте и при освещении красным светом
Введение к работе
ВВЕДЕНИЕ
Рост и развитие растительного организма, формирование его органов, их взаимодействие в целом растении управляется иерархией систем регуляции, в основе которой на клеточном уровне лежат генная, мембранная и регуляция активности ферментов (Полевой, 1982, 1986, 2001). В многоклеточном организме с усложнением взаимосвязей органов возрастает значение межклеточных систем регуляции - трофической (Курсанов, 1976; Мокроносов, 1983), гормональной (Кулаева, 1973; Кефели, 1974; Полевой, 1982, 1986; Гамбург, 1976; Муромцев, Агнистикова, 1984; Дерфлинг, 1985; Кефели и др., 1989; Кулаева, Кузнецов, 2004) и электрофизиологической (Леваковский, 1866; Scott, 1967; Pickard, 1973; Опритов и др., 1977 и др.). К настоящему времени интенсивно исследуются трофическая и гормональная регуляции морфогенеза и в меньшей степени - электрофизиологическая, в частности взаимоотношение гормональной и электрофизиологических систем. В определенной степени это связано с недостаточной изученностью влияния известных фитогормонов на биоэлектрогенез растений на разных этапах онтогенеза. Лучше других исследованы электрофизиологические реакции органов растений на синтезируемую в верхушках побегов и отвечающую за развитие корневой системы индоли-3-уксусную кислоту (ИУК). В ответ на её воздействие в тканях и органах индуцируется
ВВЕДЕНИЕ 4 позитивная волна биоэлектропотенциала (БЭП) (на клеточном уровне -гиперполяризация мембранного потенциала). Появление этой волны сопутствует базипетальному транспорту гормона (Newman, 1963), индуцирует поляризацию клеток, способствует созданию осевой полярности у растений. Медленный (0,5-1,5 см/ч) базипетальный транспорта ауксина, его влияние на биоэлектрические потенциалы тканей и органов создает электрические градиенты как на клеточном и тканевом, так и на организменном уровнях, влияющие на транспортные и морфогенетические процессы у растений.
Значительно менее исследовано влияние на биоэлектрогенез другого важнейшего фитогормона «центральной гормональной системы» (Полевой, 2001) - цитокинина, ответственного за функционирование апекса и органов побега и вырабатывающегося в меристемах корней. Цитокинины не оказывают влияния на биоэлектрогенез и рост отрезков колеоптилей, растущих растяжением, но вызывают быструю гиперполяризацию мембранного потенциала у некоторых объектов (корни, междоузлия Nitella) (Маггё et al, 1975; Абулатыбов и др., 1979; Максимов, Медведев, 1979). О влиянии на БЭП гиббереллинов, участвующих в удлинении стеблей, функционировании листьев и меристем и других процессах, известно еще меньше. Необходимо комплексное исследование воздействия гормонов как на рост, так и на биоэлектрогенез органов. Особенно интересно такое исследование при смене морфогенетических программ в ходе прорастания семени в темноте и при выходе органов проростка на свет.
Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействия гормональной и электрофизиологической регуляции роста органов проростков кукурузы в темноте и при облучении красным светом. В работе были поставлены следующие задачи:
ВВЕДЕНИЕ 5
Изучить анатомическое строение органов зародышевой оси в сухом семени и органов этиолированного проростка кукурузы от начала замачивания до 5-суточного возраста.
Исследовать действие фитогормонов - индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), кинетина и гибберелловой кислоты (ГК) на рост органов и их частей этиолированных проростков кукурузы.
Изучить влияние этих фитогормонов на биоэлектрогенез у органов (и их частей) этиолированных проростков кукурузы.
В ходе деэтиоляции под действием красного света исследовать влияние фитогормонов на рост органов проростков кукурузы.
Проанализировать части органов проростков кукурузы в качестве модельных систем для изучения коррелятивного роста.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Фитогормоны на начальных этапах роста проростков и их органов при деэтиоляции
В настоящее время выделены внутриклеточные ауксин-связывающие белки, один из которых - растворимый белок 57 кДа способен непосредственно взаимодействовать с РҐ-АТФазой плазмалеммы, что увеличивает её активность (Кулаева, Кузнецов, 2004). Показано, что АВР1 также участвует в гиперполяризации мембранного потенциала плазмалеммы и в подкислении клеточных стенок в ходе роста растяжением (Leblan et al., 1999). Необходимо отметить, что в последние годы открыты трансфакторы, участвующие в зависимом от ауксина включении генов (AFRs) и установлена структура регуляторного элемента промотора генов, регулируемых ауксином. Активно исследуются гены семейства Аих/1АА, которые кодируют короткоживущие ядерные белки (трансфакторы), способные димеризоваться сами по себе и с белками AFRs, что регулирует экспрессию включаемых ими генов (Кулаева, Кузнецов, 2004).
Самой ранней из исследованных реакций ткани растений на обработку ИУК является развитие волны гиперполяризации мембранного потенциала (Cleland, 1977; Goring et al., 1979; Полевой, 1986; Felle et al., 1991). Сейчас известна ведущая роль ИУК в регуляции многих главнейших процессов жизнедеятельности растений, среди которых деление клеток, рост клеток растяжением, дифференциация проводящих пучков, корнеобразование, ингибирование роста боковых органов и многие другие. В биохимическом плане ИУК оказывает влияние на многие стороны обмена веществ: усиливает синтез нуклеиновых веществ и белков, дыхание, активность многих ферментов и т.д. (Гамбург, 1976; Полевой, 1982; 1986; Дёрфлинг, 1985).
ИУК и ее производные (конъюгаты с аминокислотами, углеводами) обнаружены во всех органах растений. Особенно высоко их содержание в развивающихся почках (в молодых листьях и зачатках), в активном камбии и проводящих пучках, в пыльце и формирующихся семенах. У проростков злаков особенно много ИУК в нескольких верхних миллиметрах верхушки колеоптиля, из которой она поступает в нижележащие зоны и органы. Содержание ИУК весьма варьирует: от 1 мкг на 1 кг сырой массы до ингибирующих рост концентраций (Полевой, 1982).
У растягивающихся клеток 4-суточных колеоптилей кукурузы обнаружен радиальный градиент ИУК. При анализе содержания ИУК по тканям оказалось, что в расчете на одну клетку концентрация ИУК составила в паренхиме - 1 пг, эпидерме - 0,44 пг, в клетках проводящего пучка - 0,59 (Саламатова и др., 1982).
У этиолированных проростков кукурузы наибольшее содержание свободной и связанной ИУК в пересчете на сырую массу выявляется в верхушке колеоптиля, верхней 10-мм части мезокотиля, а также в корнях в участке от апекса до конца зоны корневых волосков (Полевой А., 1993).
Кроме того, обнаружена различная различной чувствительность органов к ИУК. Например, максимальной чувствительностью по сравнению с отрезками других органов обладает базальная часть корня, рост которой усиливается при обработке ИУК в концентрации 10" Ми ниже (Москалева, 1989). Изменение чувствительности к ИУК может происходит при изменении её содержания. При искусственном снижении количества ИУК в колеоптилях кукурузы возрастает чувствительность к ней его клеток. При внесении избыточной ИУК междоузлиям гороха, наоборот, чувствительность снижается (Haga, lino, 1998). Кроме того, существует изменение чувствительности к ИУК в зависимости от возраста проростков. Высокой чувствительности соответствует большая скорость роста. Так, у этиолированных проростков кукурузы абсолютный прирост всех органов максимален на 2-3 сутки. В это время интенсивность роста и деления клеток, а также роста клеток растяжением наибольшие (Москалёва, 1987). В дальнейшем, прирост органов замедляется, почти прекращаясь на 5-е сутки у колеоптиля и мезокотиля. Скорость роста листа на 4-е сутки обгоняет скорость роста мезокотиля и колеоптиля, он прорывает колеоптиль и выходит наружу, создавая тем самым условия для перехода проростка к автотрофному питанию (Москалёва, Полевой, 1987).
ИУК транспортируется полярно сверху вниз с затратой энергии в отличие от цитокининов, абсцизинов и гибберелловых кислот, транспорт которых происходит с током воды по ксилеме и флоэме. Это отличие позволяет контролировать потоки ИУК, что делает её главным гормоном в системах регуляции у растений.
Транспорт ИУК из верхушки колеоптиля осуществляется в режиме осцилляции со скоростью, совпадающей с перемещением электрической волны, генерируемой ИУК. Так как основное количество ИУК у проростков кукурузы образуется в верхушке колеоптиля, декапитация приводит к снижению скорости роста как колеоптиля, так и мезокотиля, что коррелирует со снижением в нем количества ИУК (lino, Carr et al., 1982; Tamimi et al., 1996). Однако спустя 3 часа после декапитации наблюдается спонтанное восстановление уровня роста колеоптиля, совпадающее с восстановлением величины мембранного потенциала его клеток (Tamimi et al., 1996). Обработка ИУК отрезков мезокотилей с удаленным колеоптилем восстанавливала их рост (Москалева, Полевой, 1989).
Взаимосвязь электрофизиологической и гормональной систем регуляции роста и развития
Микроритмы. Помимо ПД и ВП у высших растений зарегистрированы микроритмы, имеющие небольшую амплитуду (несколько милливольт). Они носят нерегулярный характер. Их природа остается неясной.
Градиенты БЭП, будучи связанными с фитогормонами, играют, вероятно, большую роль в жизнедеятельности растений, чем распространяющиеся электрические потенциалы, хотя функциональная значимость последних доказана. Характер, величина, распространение БЭП тесно связаны с синтезом и транспортом фитогормонов, места синтеза которых четко определены (а, следовательно, существуют градиенты фитогормонов по тканям и органам). В противоположность этому система быстрых распространяющихся потенциалов не имеет стационарных центров, и является диффузной. Центры возбуждения возникают в любом месте, где существует стрессовая ситуация (Полевой, 1998). Очевидно, что так же как и у животных, между гормональной и электрофизиологической (БЭП, ПД, ВП и др.) системами регуляции существует взаимосвязь. Однако у растений эта проблема еще не достаточно исследована.
Как отмечалось выше, градиенты биоэлектрических потенциалов в органах и организме формируется на ранних стадиях развития растения. Уже через 30 минут после оплодотворения яйцеклетки бурой водоросли Pelvetia происходит электрическая поляризация клетки. Аналогичные петли тока обнаружены у прорастающей пыльцы лилии, растущего корневого волоска, в эмбриогенезе дикой моркови (Вахмистров, 1991; Rathore, Robinson, 1989). Помимо электрической полярности зародыша моркови в апопласте по его длине существует градиент рН. Электрические поля, проходящие через растения могут быть результатом полярного транспорта ИУК, а электрическая полярность и градиент рН являются результатом ИУК-зависимой активации ІҐ-АТФазьі. Предполагается участие обоих факторов в эмбриональном развитии (Rathore, Robinson, 1989). По данным Raven, продольный градиент БЭП у молодых листьев (от верхушки к основанию) возникает в результате полярного транспорта ИУК (Raven, 1979). Наличие ИУК придает тканям аттрагирующие свойства. Локализуясь преимущественно в меристемах, ИУК продвигается базипетально в растущих стеблях и способствует акропетальному транспорту Сахаров и других ассимилятов. Транспорт сахарозы в тканях быстрорастущей части растения в 10 раз выше по сравнению с нерастущеи (Кефели и др., 1990). Ранее Jaffe предложил рассматривать плазмалемму в качестве фазы электрофореза (Jaffe, 1977).
Действие ИУК на Н+-А ТФазу плазмалеммы. Как упоминалось выше, функционирование ИУК тесно связано с электрофизиологическими реакциями, поэтому гормональная и электрофизиологическая системы регуляции имеют тесную связь.
В середине 60 гг. было показано, что ИУК оказывает влияние на БЭП и рост отрезков колеоптилей проростков злаков. Притом, биоэлектрическая реакция обнаруживалась сразу, в то время как, усилению роста предшествовал лаг-период 12-15 мин (Newman, 1963; Полевой и др., 1968). Обработка ИУК апикального конца отрезка колеоптиля без верхушки приводит к появлению медленных колебаний БЭП, когда сначала развивается деполяризация, сменяющаяся волной позитивации. За первой электро позитивной волной часто наблюдается появление второй с меньшей амплитудой и продолжительностью. ГК и цитокинин не оказывали влияния на разность электропотенциалов отрезков колеоптилей, растущих растяжением (Полевой и др., 1969).
Разные ткани реагируют на обработку ИУК по-разному. Показано, что ИУК индуцирует электропозитивацию БЭП у проводящих тканей корней одуванчика. У паренхимных тканей мезокотилей кукурузы ИУК, напротив, вызывает электронегативацию. У одуванчика выявлены радиальные градиенты БЭП между запасающими и проводящими тканями. Возникающий электрический градиент может способствовать как полярному аксиальному, так и радиальному транспорту ИУК (Полевой, Тараховская, 2001).
Доказано, что одной из мишеней в механизме действия ИУК является ЬҐ-АТФаза плазмалеммы, активацию которой можно зарегистрировать через 10-15 мин после начала действия фитогормона (Полевой и др., 1989; Rayle, Cleland, 1992; Cho, Hong, 1995). Ингибитор синтеза белка циклогексимид подавлял ИУК-индуцированную волну позитивации и рост отрезков колеоптилей, а ингибитор ДНК-зависимого синтеза РНК актиномицин Д подавлял включение меченого предшественника в РНК (Шарова и др., 1986). У обработанных циклогексимидом отрезков стебля проростков гороха увеличивается скорость транспорта ИУК (Nam et al., 1999).
Таким образом, индуцирующее действие ИУК на электропозитивную волну БЭП, секрецию ионов Н+ и рост отрезков зависит от синтеза белков уже в первые минуты действия ауксина. Следовательно, ИУК в ранний период активирует синтез белков, необходимых для роста растяжением, на уже существующих полисомах.
Измерение биоэлектропотенциалов (БЭП) тканей органов проростка
Как уже отмечалось цитоплазматический рецептор ИУК - АВР57, совместно с ИУК непосредственно активирует ІҐ-АТФазу. Это приводит к выходу протона из клетки, входу К, гиперполяризации плазмалеммы. Важно, что увеличение МП активирует ген ZMK1, отвечающий за синтез белков К+-канала. Показана способность прямого действия ИУК на катионные каналы в плазмалемме. Специфичность этих управляемых ИУК каналов значительно выше для Са +. В результате обеспечивается вход Са + в клетки (Шишова и др., 1997; 1998). Недавно было показано, что ИУК вызывает также выход СГ из клетки за счет открытия анионных каналов (Keller, Von Volkenburgh, 1996). Таким образом, предполагается, что первичная негативация БЭП при действии ИУК вызывается входом ионов Са внутрь цитоплазмы клеток и выходом ионов СГ из клетки.
Известно, что вход ионов Са2+внутрь клеток является одной из первых реакций при трансдукции многих сигналов (Ward et al., 1995; Шишова и др., 1997). Одним из таких сигналов является гормональный. Ингибирование работы кальциевых каналов приводит к устранению ИУК-зависимой регенерации корней, роста клеток растяжением, дифференциации протонемы мхов (Leshem, Lurie, 1995; Naren et al., 1995; Cho, Hong, 1996; Bhatla et al., 1996). В опытах с изолированной микросомальной фракцией из колеоптилей кукурузы было установлено, что ИУК способна также in vitro в течение 30 с активировать фосфоинозитидный механизм внутриклеточной трансдукции (Синютина, Полевой, 1995).
Необходимо отметить, что под действием ИУК происходит быстрая активация Са -независимой фосфолипазы А2 (Yi, 1996; Hager, 2003). Этот фермент разрушает липофосфатидилхолин до фосфатидилхолина, который активирует ЬҐ-АТФазу (Kasamo, 2003). ИУК в 3 раза повышает уровень синтеза МНА2 - основной изоформы Н АТФазы несосудистых тканей колеоптилей. Под действием ИУК увеличивается ток мембран эндоплазматической сети (ЭС), количество пузырьков Гольджи. В результате этих изменений уже через 10 минут после обработки ИУК количество ІҐ-АТФазьі в плазмалемме значительно увеличивается (эффект снимается циклогексимидом). Закисление клеточной стенки приводит к активации экспансина -основного белка, принимающего участие в кислом росте, ксилоглюкангидролаз, ксилоглюканэндотрансгликозилаз, экзо-р-глюканаз. Позднее активируется ген эндо-р-глюканазы, обеспечивающей долговременный рост при действии ИУК. Пока выявлено 4 класса ИУК-регулируемых генов: Aux/IAAs, SAURs, GHs5, OsARFl. ИУК снимает репрессию этих генов, воздействуя на участок в промоторной части. Функции этих генов активно изучаются. Ранние генные изменения касаются контроля транскрипции вторичных ИУК-регулируемых генов (Hager, 2003). На основании полученных и литературных данных в 1998 году Полевым В.В. были предложены две гипотетические схемы механизма действия ИУК с участием ионов Н и Са2+: 1. ИУК непосредственно активирует Са +"каналы в плазмалемме. Увеличение уровня Са + в цитоплазме подавляет ЬҐ-АТФазную активность. Снижение ЬҐ-АТФазной активности и обмен Са2+ на ионы Н вакуоли через тонопласт приводит к подкислению цитоплазмы, что вызывает активацию ТҐ-АТФазьі. Увеличение синтеза белка и в частности короткоживущей ЬҐ- АТФазы является необходимым условием действия ИУК на БЭП и рост клеток. 2. ИУК активирует фосфолипазу С и фосфоинозитольный цикл. Инозитол-1,4,5-трифосфат индуцирует выход Са2+ из вакуоли. Диацилглицерол и Са2+ активизируют протеинкиназу С-типа, что может быть причиной открытия катионных каналов в плазмалемме. Далее ионы Са2+ и Н действуют согласно предыдущей схеме (Полевой, 1998). Предполагается также существование трёх контуров действия ИУК на рост, различных по механизму: 1. В пределах мембраны (первые минуты), 2. Синтез белков на шероховатом ретикулуме (десятки минут), 3. Активация мРНК белков, необходимых для долговременной поддержки действия ИУК (Полевой, 1998). Предполагается, что белки-переносчики ИУК распределены в плазмалемме не равномерно и, поскольку они заряжены положительно, то диффундируют в сторону электроотрицательности БЭП (Медведев и др., 1986). Обнаружено несколько типов переносчиков ИУК: Auxl (вход), PIN1 и PIN2 (выход), MDR (переносчики, обеспечивающие латеральный транспорт) (Hager, 2003). Из всех фитогормонов только для ИУК характерно полярное перемещение по тканям растительного организма. Благодаря этому в растениях существуют апикально-базальные градиенты распределения ИУК. В результате полярного транспорта в базальных частях клеток ИУК больше, что выражается в более сильной экскреции Н , чем в апикальных клетках, из-за чего между ними возникает разность БЭП. Представленный обзор литературы не мог охватить всех возможных аспектов гормональной и электрофизиологической регуляции у растений, но очевидно, что необходимы дальнейшие исследования этих систем и их взаимодействия в ходе роста и развитии растений.
Рост и деление клеток мезокотилей проростков кукурузы в темноте и при освещении красным светом
Так как предыдущими авторами анатомическое строение и развитие корня проростков кукурузы подробно исследовано, то в нашей работе развитие корня не изучалось (Эсау, 1969; Иванов, 1974). Анатомическое исследование строения органов покоящегося семени кукурузы показало, что у зародыша колеоптиль, мезокотиль уже сформированы (рис. 10). Длина колеоптиля составляет 2,3 мм, мезокотиля - 0,5 мм. Снаружи и внутри колеоптиль окружен однослойной эпидермой. Клетки наружной эпидермы существенно больше внутренней. Клетки наружной эпидермы колеоптиля отличаются большими размерами (28 мкм) по сравнению с окружающими паренхимными (рис. Па). Однако уже в нижней трети колеоптиля, их размер снижается и в районе узла сходен с паренхимными. В верхушке колеоптиля в эпидерме ядра имеют лопастную форму (рис. 116). Предположительно клетки эпидермы эндоредуплицированы.
Основной объем колеоптиля образован клетками коровой паренхимы со средней длиной 20 мкм. На поперечных срезах видно, что верхней части колеоптиль имеет овальную форму, с более широкой частью со стороны проводящих пучков, а основании почти круглый (рис. 12а; 146). Вдоль длины колеоптиля количество слоев клеток коровой паренхимы в поперечном направлении снижается от 15 в основании до 7-8 в верхушке. В колеоптиле выявляются два проводящих пучка. Клетки пучков вытянутые (прозенхимные). Явных признаков дифференцировки сосудистых пучков не выявлено, однако, в некоторых зародышах видны первые начавшие дифференцировку клетки протоксилемы. Следует отметить, что клетки паренхимы в самой верхушке колеоптиля крупные, округлой формы, по размерам больше других паренхимных клеток (рис. 11а). На продольных срезах зародыша кукурузы видно, что колеоптиль покрывает 4-5 листьев. Проводящие пучки листьев сливаются в колеоптильном узле с проводящей системой мезокотиля (рис. 12).
Снаружи мезокотиль окружен однослойной эпидермой. Эти клетки незначительно меньше клеток коровой паренхимы. Основной объем мезокотиля, как и колеоптиля, сформирован за счет клеток коровой паренхимы. Они несколько мельче, чем в колеоптиле. Их длина составляет в среднем 18 мкм. На поперечном срезе в самой широкой части мезокотиля от эпидермы до проводящего пучка насчитывается до 15 слоев клеток КП, а вдоль от основания до колеоптильного узла - до 30 слоев (рис. 10).
У мезокотиля проводящий пучок один. Он представлен рядами метаксилемы и флоэмы. Клетки метаксилемы содержат крупные эндоредуплицированные ядра. По мере удаления от колеоптильного узла размер клеток метаксилемы увеличивается (рис. 10). Флоэма мезокотиля интенсивно окрашивается алциановым синим. Клетки эпидермы по размерам сходны с паренхимными клетками. зародыш практически не претерпевает изменений. Рост и деление клеток колеоптиля начинаются после 36 часов от начала замачивания зерновок. Существенной особенностью наружной эпидермы колеоптиля является отсутствие клеточных делений на всех этапах развития проростка. В эпидерме верхушки колеоптиля ядра лопастные. У колеоптилей проростков всех возрастов по мере удаления от верхушки клетки наружной эпидермы существенно быстрее клеток коровой паренхимы увеличиваются в размерах. Начиная с нижней трети колеоптиля, размер клеток снова снижается. Размер клеток и ядер внутренней эпидермы, как и в зародыше по размерам существенно мельче, чем наружной (рис. 126). Деления особенно активны у 2-суточньтх колеоптилей. К этому возрасту, длина колеоптиля и мезокотиля примерно одинакова и составляет по 5 мм. На этом этапе делящиеся клетки коровой паренхимы и проводящих пучков занимают 2/3 колеоптиля, начиная от узла (рис. 13). У 3-суточных колеоптилей деления происходят только у основания, а с 4-х суточного возраста деления отсутствуют по всей длине колеоптиля. Важно отметить, что в ходе роста и развития проростка структура верхушки колеоптиля сохраняется той же, что и на ранних стадиях. В 500 верхних микрометрах в коровой паренхиме делений клеток нет никогда. Дифференцировка клеток ксилемы проводящих пучков колеоптиля идет снизу вверх от колеоптильного узла. С началом клеточных делений увеличивается количество облитерированных (утолщенных) сосудов ксилемы в пучках колеоптиля. По мере роста колеоптиля дифференцировка пучков происходит не одинаково в разных участках. С 36 часов замачивания на расстоянии около 200 мкм от апикальной клетки в верхушке колеоптиля большинство клеток пучка дифференцируются в ксилемные элементы (рис. 14а,б). В этом участке колеоптиля ядра эпидермы лопастные, клетки паренхимы округлые. На удалении около 300 мкм от верхушки колеоптиля в пучке появляются флоэмные элементы. Клетки флоэмы дифференцируются позднее. Они оказываются окруженными клетками ксилемы (рис. 15а,б). Здесь и еще в клетках на 100 мкм ниже верхушки колеоптиля ядра эпидермы остаются лопастными.
