Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
Часть 1. Поглощение тяжелых металлов и стронция и факторы, влияющие на этот процесс : 12
Часть 2. Локализация металлов, их транспорт по растению и морфо функциональные механизмы детоксикации 18
2.1. Распределение Cd, Pb и Ni по органам растений. Механизмы и роль гипераккумуляции 18
2.2. Распределение тяжелых металлов и Sr по тканям растений 28
2.3. Транспорт тяжелых металлов по растению 34
2.4. Внутриклеточное распределение тяжелых металлов 39
Часть 3. Токсическое действие тяжелых металлов и ответ клетки на их избыток 46
3.1. Влияние тяжелых металлов на активность ферментов 46
3.2. Влияние тяжелых металлов на минеральное питание 53
3.3. Действие тяжелых металлов на транспирацию и водный режим 57
3.4. Действие Cd на дыхание и содержание АТФ 59
3.5. Влияние тяжелых металлов на фотосинтез 60
3.6. Действие тяжелых металлов на рост и морфогенез 64
Часть 4. Молекулярные механизмы детоксикации, транспорта и устойчивости растений к тяжелым металлам ., 71
4.1. Роль фитохелатинов и металлотионеинов в детоксикации тяжелых металлов у высших растений 71
4.1.1. Структура и синтез фитохелатинов 72
4 1 .2. Функции фитохелатинов и их участие в гомеостазе 32
4.1.3. Детоксикация Cd с образованием комплексов 2
4.1.4. Фитохелатины и устойчивость растений к кадмию 7
4.2. Роль металлотионеинов в детоксикации тяжелых металлов
4.3. Молекулярные механизмы поступления тяжелых металлов и Sr в
цитоплазму 91
Часть 5. Общие вопросы устойчивости растений к тяжелым металлам и пути ее возможной эволюции 95
Часть 6. Функциональная анатомия корня 100
Часть 7. Цели и задачи работы 108
ГЛАВА 2. Действие тяжелых металлов и стронция на рост и ветвление корня 112
1. Влияние Cd, Pb, Ni и Sr на морфологию и рост первичного корня кукурузы 112
2. Сравнительная оценка влияния различных тяжелых металлов на рост и ветвление корня кукурузы 116
3. Влияние Са на проявление токсического действия тяжелых металлов и Sr у разных видов растений 120
4. Сравнение токсического действия Ni и Zn на рост исключателей и гипераккумуляторов 124
5. Специфичность и избирательность токсического действия тяжелых металлов и Sr на рост и ветвление корня 127
ГЛАВА 3. Распределение и передвижение кадмия, свинца, стронция, никеля и цинка по тканям растений 134
1. Разработка гистохимических методов определения Cd, Pb, Ni, Sr и Zn 134
2. Распределение Cd и Pb в проростках кукурузы 146
3. Отмирание клеток различных тканей корня под действием Cd и Pb : 155
4. Распределение Sr в проростках кукурузы 156
5. Распределение Ni в проростках кукурузы 161
6. Использование плазмолиза для уточнения распределения тяжелых металлов и Sr 174
7. Распределение Ni и РЬ по тканям проростков амаранта в отсутствие и присутствии Са(1ЧОз)г 176
8. Распределение РЬ по тканям проростков люпина в отсутствие и присутствии Ca(N03)2 178
9. Распределение Ni, Zn и Sr по тканям различных видов и экотипов ярутки : 180
10. Передвижение тяжелых металлов по тканям корня 190
11. Влияние Cd и РЬ на аккумуляцию различных изоформ фитохелати нов в побегах и различных участках корня кукурузы 196
12. Роль гистидина в передвижении и накоплении Ni растениями ис ключателями и гипераккумуляторами 199
13.Распределение Cd, Pb, Ni и Sr в прорастающих зерновках кукурузы ; 203
14. Роль различных тканей растений в передвижении и накоплении тяжелых металлов и Sr 206
ГЛАВА 4. Клеточный механизм токсического действия свинца, никеля и стронция на рост корня 248
1. Влияние тяжелых металлов и Sr на деление и растяжение клеток корня в присутствии и отсутствие Са 248
2. Связь между распределением металлов и их токсическим действием нарост 255
Заключение 262
Выводы 269
Список литературы
- Распределение тяжелых металлов и Sr по тканям растений
- Действие тяжелых металлов на транспирацию и водный режим
- Фитохелатины и устойчивость растений к кадмию
- Влияние Са на проявление токсического действия тяжелых металлов и Sr у разных видов растений
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших задач экологической физиологии растений является изучение ответной реакции растений на ионы тяжелых металлов, которые при повышенных концентрациях оказывают токсическое действие на самые разнообразные физиологические процессы. Данная проблема имеет не только очевидное практическое значение, которое связано со все возрастающим загрязнением окружающей среды тяжелыми металлами, но также имеет и важное фундаментальное значение, которое связано с исследованием механизмов адаптации и устойчивости растений к тяжелым металлам. Среди них Cd и Pb - наиболее распространенные токсиканты, тогда как Ni и Zn относят также и к микроэлементам.
По ряду причин растения не могут не поглощать большинство тяжелых металлов и в отличие от животных, способны накапливать их в больших количествах. Именно поэтому проблема компартментации тяжелых металлов в растении является определяющей при изучении их токсического действия и механизмов устойчивости.
Способность растений накапливать тяжелые металлы реализуется на разных уровнях организации: клеточном, тканевом и органном, что связано прежде всего со способностью растений накапливать металлы в клеточных оболочках и вакуолях клеток разных тканей и органов, а также с существованием барьерных тканей, ограничивающих передвижение ряда тяжелых металлов. Накопление тяжелых металлов в метаболически-малоактивных компартментах клеток и в органах, которых растение может впоследствии лишиться, а также связывание металлов с хелаторами и их выделение в корневую слизь могут являться механизмами детоксикации тяжелых металлов, в результате чего тяжелые металлы исключаются из активного метаболизма. Благодаря эффективным механизмам детоксикации металлов растения продолжают расти при повышенном их содержании в среде.
Существует большое количество данных, касающихся токсического действия тяжелых металлов и их распределения по органам растений, меньше известно об их внутриклеточном распределении. Данные о распределении металлов на тканевом уровне практически полностью отсутствовали к началу наших исследований, хотя именно изучение их распределения по тканям растений является важным фактором для понимания механизмов их токсического действия и морфо-физиологических механизмов детоксикации. Решение этой задачи тесно связано с необходимостью разработки методов анализа распределения тяжелых металлов по тканям и клеткам растений, которые ранее практически не были разработаны. На этом основании в данной диссертации была поставлена задача разработать такие методы и с их помощью проанализировать связь между распределением, токсичностью и особенностями ростин-гибирующего действия металлов.
Многие виды растений способны накапливать тяжелые металлы, причем их содержание в органах растений может в десятки и даже сотни раз превышать их содержание
в окружающей среде. По способности к аккумуляции тяжелых металлов выделяют две контрастные группы растений: исключатели, у которых тяжелые металлы накапливаются, главным образом, в корневой системе, и аккумуляторы, у которых они накапливаются в больших количествах в надземных органах [Baker, 1981]. В литературе, однако, практически отсутствуют сведения о том, какими морфо-анатомическими и физиологическими особенностями обусловлена способность одних видов растений накапливать тяжелые металлы в корнях, а у других видов - в надземных органах.
Выяснение роли тканей в передвижении и накоплении металлов у исключателей и гипераккумуляторов необходимо, с одной стороны, для понимания механизма гипераккумуляции, что представляет интерес в целях изучения применения гипераккумуляторов для рекультивации почвы и очистки окружающей среды от тяжелых металлов - фиторемедиации, которая в последнее время активно разрабатывается. С другой стороны, это важно для выяснения структурных и физиологических особенностей исключателей, определяющих ограниченное поступление металлов в надземные органы, что представляет несомненный интерес для сельскохозяйственной практики.
Поступая в клетки, тяжелые металлы реагируют с функциональными группами белков и других соединений, что может являться одним из механизмов детоксикации, (металлотионеины и фитохелатины), но вместе с тем приводит к многочисленным нарушениям метаболизма и лежит в основе высокой токсичности тяжелых металлов. Прочность связывания ионов тяжелых металлов с функциональными группами биополимеров может различаться, что может быть одной из причин различной токсичности тяжелых металлов. Поэтому в наших исследованиях были выбраны широко распространенные тяжелые металлы, во-первых, обладающие различным сродством к функциональным группам биополимеров, а во-вторых, накапливающиеся в разных компартментах клетки. Так, Cd, Pb, Zn связываются главным образом с SH-группами и накапливаются в апопласте, a Ni связывается с N-содержащими лигандами и накапливается преимущественно в протопласте.
Токсическое действие металлов четко видно по ингибированию роста, что широко используется для тестирования их присутствия в окружающей среде [Wilkins, 1978; Wang, 1987; Breckle, 1991; Hagemeyer, Breckle 1996]. Действие тяжелых металлов на рост напрямую зависит от особенностей их тканевого и внутриклеточного распределения в растущем участке корня, а также от эффективности механизмов детоксикации, которые по-разному могут реализоваться в различных тканях исключателей и аккумуляторов. Поэтому решение проблемы специфичности и избирательности токсического действия металлов на рост, а также выяснение клеточных механизмов действия тяжелых металлов на отдельные ростовые процессы требует понимания особенностей их передвижения и распределения по органам и тканям в связи со свойствами их ионов.
Изучение функциональных особенностей тканей корня и побега в передвижении и накоплении тяжелых металлов у исключателей и гипераккумуляторов, а также выяснение механизма ростингибирующего действия различных тяжелых металлов необхо-
димы для разработки фундаментальных основ адаптации растений к тяжелым металлам и решения ряда практических задач.
Перечисленные выше проблемы определили актуальность данного исследования.
Цель исследования состояла в выяснении роли разных тканей корня и побега ис-ключателей и гипераккумуляторов в передвижении и накоплении тяжелых металлов в связи с особенностями их ростингибирующего действия.
Задачи исследования:
-
Выяснить роль разных тканей корня и побега в передвижении и накоплении металлов у исключателей и гипераккумуляторов
-
Выявить возможные причины избирательного накопления металлов в подземных органах исключателей и надземных органах гипераккумуляторов
3. Охарактеризовать на клеточном уровне механизмы ростингибирующего действия
Pb, Ni и Sr в связи со специфичностью и избирательностью их действия.
Научная новизна работы. Предложены новые методы гистохимического опреде
ления Cd, Pb, Sr и Zn, а метод для выявления Ni существенно модифицирован, что по
зволило повысить его чувствительность. Установлены основные закономерности рас
пределения металлов у исключателей и гипераккумуляторов. Впервые выяснен вклад
разных тканей корня и побега в передвижении и накоплении металлов. Впервые пока
заны отсутствие физиологических барьеров в меристеме корня для ионов тяжелых ме
таллов, передвигающихся по симпласту и апопласту; роль первичной коры как изби
рательного аккумулятора таких «апопластических» ионов тяжелых металлов, как Cd и
Pb; отсутствие универсальных тканевых и клеточных барьеров для передвижения тя
желых металлов; функция перицикла как ткани-аккумулятора и «кольцевого коллек
тора» в передвижении Ni у исключателей. Выяснена неоднозначность влияния Са на
распределение и токсическое действие тяжелых металлов у разных видов. Показана
возможная причина «защитного» действия Са - конкуренция за общие места связыва
ния при поглощении и транспорте. Впервые показана роль гистидина в передвижении
и накоплении Ni у исключателей и гипераккумуляторов. Установлено, что феномен
гипераккумуляции определяется не только отсутствием тканей-аккумуляторов и барь
ерных тканей в корне у гипераккумуляторов, но и ограниченным поступлением Ni в
вакуоли клеток корня и повышенной скоростью поступления Ni в сосуды ксилемы в
корнях гипераккумуляторов, в чем важную роль играет повышенный внутриклеточ
ный уровень гистидина. Проведен сравнительный анализ ростингибирующего дейст
вия тяжелых металлов. Экспериментально обоснована специфика механизма действия
Pb, Ni и Sr на рост наряду с общей неспецифичностью и неизбирательностью токсиче
ского действия металлов.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Роль тканей растений в передвижении и накоплении тяжелых металлов не одинакова не только для разных металлов, но и у растений исключателей и гипераккумуляторов.
-
В корнях гипераккумуляторов отсутствуют барьерные ткани и ткани-аккумуляторы, в результате чего их корневая система, в отличие от исключателеи, не ограничивает поступление металлов в побег.
-
Гипераккумуляторы Ni, в отличие от исключателеи, характеризуются ограниченным накоплением Ni в клетках корня и повышенной скоростью поступления Ni в сосуды ксилемы, в чем важную роль у Thlaspi caerulescens играет внутриклеточный уровень гистидина.
-
Специфика действия отдельных тяжелых металлов на различные ростовые процессы обусловлена как различиями физико-химических свойств их ионов, так и различным характером их передвижения и распределения по тканям и органам растений.
Научная и практическая значимость исследований. Проведенные исследования имеют, прежде всего, фундаментальный характер, поскольку позволяют понять основные принципы и закономерности передвижения и распределения тяжелых металлов по разным тканям в связи с различной ролью последних как у разных видов растений, так и для разных тяжелых металлов. Результаты исследования дают новые представления о специфических и неспецифических чертах ростингибирующего действия тяжелых металлов. Установленные связи между особенностями распределения тяжелых металлов и клеточным механизмом их токсического действия на рост являются важным звеном в понимании устойчивости растений к тяжелым металлам и реакции растений на их избыток. Вместе с тем представленные результаты могут иметь и практическое значение ввиду возрастающего загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами. Полученные данные о неоднозначности «защитного» эффекта Са необходимо учитывать в сельскохозяйственной практике, так как известкование почв - один из наиболее распространенных приемов, направленный на уменьшение поглощения и токсического действия тяжелых металлов. Понимание причин ограниченного поступления тяжелых металлов в надземные органы у растений исключателеи и неограниченного - у гипераккумуляторов может быть использовано для разработки методов уменьшения содержания тяжелых металлов в сельскохозяйственной продукции, с одной стороны, и увеличении содержания металлов в надземных органах растений, используемых в технологии фиторемедиации. Кроме того, определение тяжелых металлов с помощью простых гистохимических методов имеет важное значение для экологического мониторинга. Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии растений и экологии.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 1997), на Международном симпозиуме «Структура и функция корня» (Словакия, 1998), на IV Съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), на Международном симпозиуме Plants under Environmental Stress (Москва, 2001); на Международной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино,
2001); на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на I Молодежной конференции ИФР РАН (Москва, 2003), на V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на VIII Международной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004), на Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений Севера» (Петрозаводск, 2004), на III научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екатеринбург, 2004), на Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на IV Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2005), на Международной конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005), на I (IX) Международной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2006), на Международной конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006), на семинарах лаборатории экологии и физиологии растений Свободного университета (Амстердам, Голландия, 2005, 2006, 2007, 2008), на секции экологии Дома ученых (Москва, 2007), на Костычевских чтениях (Санкт-Петербург, 2007), на Международном семинаре Phytoremediation and Monitoring of Contaminated soil (Санкт-Петербург, 2007), на VI Съезде Общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007), на Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 научных работ, в том числе 23 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена в лаборатории физиологии корня Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений РАН. Из исследований, проведенных в соавторстве с коллегами, в диссертационную работу включены и вынесены на защиту только те результаты, в получении которых автору принадлежит существенная или определяющая роль. Автор выражает глубокую благодарность Е.И. Быстровой, А.Д. Кожевниковой, а также Н.В. Алексеевой-Поповой, А.И. Беляевой, М.Н. Катаевой, Л.К. Шпигун, R. Vooijs и доктору Н. Schat (Свободный университет, Амстердам, Голландия) за оказанную помощь в проведении ряда исследований. Особо благодарен научному консультанту В.Б. Иванову за конструктивные советы и постоянное содействие в работе, а также всем коллегам, принимавшим участие в обсуждении полученных результатов.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 333 страницах и состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов. Список литературы включает 625 источника, из них 555 иностранных авторов. Работа содержит 26 таблиц и 99 рисунков. 11 таблиц и 88 рисунков включены в приложение (том 2).
Распределение тяжелых металлов и Sr по тканям растений
Тяжелые металлы и Sr поступают в растения главным образом через корневую систему из почвы, в которой они распределены крайне неравномерно. Это зависит от типа почвы и источника попадания в нее тяжелых металлов [Лепнева, Обухов, 1987; Обухов, Лобанова, 1987; Бингам и др., 1993; Фролов, 1998]. Часть металлов, посту-пивших в почву, связывается с органическим материалом почвы и становится не-доступной для растений. Другая же часть остается в ионной форме и может поступать в корневую систему [Ramos et al., 1994].
Поглощение металлов представляет собой многоступенчатый процесс, включающий в себя их связывание с материалом слизи и клеточных оболочек, поступление ионов в свободное пространство и, наконец, проникновение через мембраны в клетки. На поверхности корня тяжелые металлы связываются главным образом с карбоксильными группами уроновых кислот слизи. Способность слизи связывать тяжелые ме "ii_ Tj- OJ— і Обзор литературы [Morel et al., 1986; Mench et ah, 1987]. Одновалентные и щелочноземельные металлы связываются значительно слабее. Для Ni подобные данные отсутствуют. Связывание со слизью ограничивает поступление металлов в корень и может быть важным компонентом барьерной функции корневой системы при их поступлении в растение. Часть связанных металлов может высвобождаться после биодеградации слизи [Morel et al., 1986].
Следует отметить, что пока не изучено, какая доля тяжелых металлов остается связанной со слизью и не поступает в корень. Это не было определено при анализе кинетики их поглощения, которая для Cd и РЬ в общих чертах такая же, как и для других катионов. Она носит типичный двухфазный характер [Cutler, Rains, 1974, Cataldo, Wildung, 1978, Griling, Peterson, 1981, Dushenkov et al., 1995; Salt et al., 19956].
Рядом авторов было установлено, что поглощение тяжелых металлов растениями может осуществляться как посредством пассивной диффузии, так и путем активного транспорта. Известно, что все транспортные процессы зависят от метаболизма, причем активные процессы зависят от него непосредственно, а пассивные - опосредованно. Участие метаболических процессов в поглощении Cd было изучено посредством сравнения скоростей транспорта при 0С и при 20 С. Эксперименты проводились на корнях проростков бука в присутствии "5Cd в течение 2 часов. Показано, что Cd поглощается даже при 0 С, когда метаболизм существенно замедлен [Hagemeyer et ah, 1986]. Зависимость поглощения Ni от метаболизма было изучено путем сравнениия скоростей его транспорта при разной температуре и аэрации раствора. Так, Aschmann и Zasoski показали, что при 23 С скорость поглощения Ni корнями Avena sativa линейно зависело от времени инкубации. Низкая температура (2С) существенно снижала поглощение .Ni из питательного раствора. Кривая зависимости поглощения Ni от температуры носила S-образный характер, достигая максимума между 23 и 30С. Добавление 2,4-динитрофенола (20 мкМ) в питательный раствор и выращивание растений в анаэробных условиях ингибирова-ли поступление Ni на 91% и 86%, соответственно. Эти данные свидетельствуют о преобладании метаболически активного поглощения ионов Ni над ионобменными процессами [Aschmann, Zasoski, 1987].
Пока не ясно, существуют ли специфические механизмы, определяющие различия между отдельными видами по скорости поглощения тяжелых металлов. В связи с этим Глава 1 Обзор литературы интересно отметить, что гибриды кукурузы (МО 17хН98 и ОН545хВВ) заметно различаются по способности поглощать Cd [Hinsly et al., 1982]. При разных концентрациях тяжелых металлов в растворе вклад активного и пассивного процессов различен. Так, например, активный транспорт Ni играет большую роль при низких концентрациях металла в растворе (менее 34 мкМ), в то время как при более высоких концентрациях Ni, вследствие его токсического действия, увеличивается проницаемость мембран и, как результат, возрастает поглощение Ni за счет пассивного механизма [цит. по Тэмп, 1991]. В отличие от высших растений, у лишайника Umbilicaria muhlenbergii поглощение Ni осуществлялось пассивно, так как 73% от общего количества Ni накапливалось в течение первых 5 минут инкубации, а применение анаэробиоза и таких ингибиторов метаболических процессов, как 2,4-динитрофенола и йодацетата, не снижало поступление Ni [цит. по Тэмп, 1991].
Различные зоны корня могут в разной степени участвовать в поглощении металлов. Исследование поглощения Sr корнями проростков кукурузы позволило выявить, что наибольшей скоростью поглощения Sr характеризуются клетки зоны растяжения. Им уступают клетки зоны корневых волосков, а слабее всего поглощают ионы клетки зоны деления. Интересно, что большая часть поглощенного Sr (67-70%) относительно прочно удерживается клетками всех зон корня [Мазель, 1989].
Скорость поглощения металлов зависит от многих факторов среды: температуры, аэрации, концентрации металлов в почве или растворе, ряда почвенных факторов, а также от морфо-физиологических особенностей растений. Все эти факторы определяют как скорость поглощения металлов, так и пути их дальнейшего транспорта, распределения, детоксикации.
Среди почвенных факторов, определяющих поглощение металлов, наиболее важными являются: кислотность, катионобменная способность, содержание органических веществ и извести, влагоемкость, гранулометрический состав, а также концентрации макро- и микроэлементов [Hagemeyer et al, 1986; Aschmann, Zasoski, 1987; Бингам и др., 1993; Salt et al., 19956; Sajwan et al., 1996; Poszwa et al., 2000; Андреева и др., 2001; Меркушева и др., 2001; Peralta-Videa et al., 2002]. Это влияние было подробно изучено для Cd и Ni, а для РЬ и Sr экспериментальных данных практи чески нет. Увеличение рН почвенного раствора понижает растворимость солей Cd, в результате чего биодоступность почвенного Cd снижается [blagemeyer etal, 1986; Salt et al.5 19956]. Это подтверждается тем, что содержание Cd выше у растений, выращенных на кислых почвах по сравнению с растениями, произрастающими на известкованных почвах [Бингам и др., 1993, Preer et al., 1995]. Доступность Ni также уменьшается с повышением рН почвенного раствора за счет образования малорастворимых комплексов [Тэмп, 1991; Бингам и др., 1993]. Кроме того, Ni в почвах сильно абсорбируется оксидами магния и кальция в широком интервале рН и оксидами железа при рЫ выше 5.5 [Бингам и др., 1993]. На поверхности корня и почвенных частиц может образовываться пленка из нерастворимых соединений железа (III), которая способна связывать Ni, делая его недоступным для растения [Taylor, Crowder, 1983]. Было установлено, что Ni более подвижен в почвах с низким содержанием гумуса, легким гранулометрическим составом и избыточным увлажнением [Мер-кушева и др., 2001]. Поглощение Sr из почвы снижается в присутствии гуминовых кислот, которые формируют комплексы со Sr, снижая его доступность для растения [Koranda, Robinson, 1978; Paasikallio et al., 1994; Negri, Hinchman, 2000].
В последнее время большое внимание уделяется влиянию хелатирующих агентов, искуственно вносимых в почву, на поглощение тяжелых металлов растениями [Blaylock et al., 1997; Huang et al., 1997; Blaylock, 1999; Прасад, 2003]. При добавлении синтетических хелаторов (ЭГТА, ЭДТА) в загрязненную тяжелыми металла-ми почву аккумуляция тяжелых металлов в растениях увеличивалась. Так, например, добавление ЭГТА (10 мМ/кг) в почву увеличивало содержание Cd в побегах Brassica jimcea до 2800 мг/кг по сравнению с 220 мг/кг в контроле [Blaylock et al., 1997; Huang et al., 1997; Blaylock, 1999]. Внесение хелаторов в почву было предложено использовать для ее очистки от тяжелых металлов, хотя рентабельность этого вызывает сомнения.
Действие тяжелых металлов на транспирацию и водный режим
До сих пор остается до конца не выясненным, каким путем РЬ поступает в клеточные оболочки. Помимо прямого поступления в апопласт, некоторые авторы допускают возможность поступления РЬ в клеточные оболочки из симпласта посредством аппарата Гольджи. Этот процесс зависит от присутствия ионов Са. Действительно, в присутствии Са накопление РЬ в клеточных оболочках некоторых видов растений увеличивалось [Antosiewicz, 2005]. К анализу этого явления мы еще вернемся в главе 3.
Значительная часть поглощенных металлов может находиться на внешней поверхности плазмалеммы [Wierzbiska, 1984], и тем самым не поступать в цитоплазму. Некоторое количество Cd и РЬ может поступать в цитоплазхгу, однако механизм их поступления остается до сих пор мало изученным. По-видимому, Cd и РЬ проникают в клетку пассивно, хотя и не исключено их активное поступление. Последнее может быть связано с конкуренцией с другими металлами за мембранные переносчики [Salt et al., 19956]. Более подробно этот вопрос будет рассмотрен ниже. .
Внутри клеток большая часть Cd и РЬ находится в вакуолях, в которых, вместе с клеточной оболочкой, содержится до 96% поглощенного металла [Nishizono et al., 1987; Wierzbicka, Antosiewicz, 1993]. В крупных вакуолях корней полевицы, кукурузы, лука и Thlaspi caendescens найдены электронноплотные гранулы, содержащие Cd, которые были заключены в аморфное электронно-плотное вещество [Rauser, Ackerley, 1987; Liu, Kottke, 2003; Wojcik et al., 2005]. Размер вакуолей под действием тяжелых металлов может даже увеличиваться [Stoyanova, Tchakalova, 1993].
В ряде работ, посвященных внутриклеточному распределению Ni, было показано, что для гипераккумуляторов {Alyssum serpyllifolium, Alyssum bertolonii, Alyssum lesbiacum, Thlaspi goesingense) характерна локализация металла преимущественно в вакуоли в виде комплексов с органическими кислотами, благодаря чему большая часть металла находится в метаболически малоактивном компартментс клетки, что является одним из механизмов детоксикации тяжелых металлов [Brooks et al., 1981; Wozny et al., 1982; Krotz et al., 1989; Mazen, El Maghraby, 1997/98; Kramer et al., 1997, 2000; Kupper et al., 2001; Boominathan, Doran, 2003; Bidwell et al., 2004]. Так, после выращивания растений Alyssum serpyllifolium из семян в течение 6 недель на почве в присутствии 500 мкг/г Ni(N03)2, наибольшее содержание Ni наблюдалось в вакуолях в виде комплексов с малатом, малонатом и цитратом. Значи-тельно меньшее количество Ni было связано в клеточных оболочках (3.6 %), хло В то же время для другого гипераккумулятора, Hybanthns floribundus, были полу чены противоречивые данные. С одной стороны, было отмечено значительно большее содержание Ni в клеточных оболочках, где он был связан с пектинами [Salt, Kramer, 2000], а с другой, показано преимущественное его накопление в ва куолях клеток эпидермы [Bidwell et al., 2004] (рис. 1, табл. 8). Таким образом, для изучения внутриклеточного распределения Ni у растепий-гипераккумуляторов не обходимы дальнейшие исследования. . Способность накапливать тяжелые металлы в вакуоли в виде комплексов может определять устойчивость растений к их повышенному содержанию в среде. Например, было показано, что протопласты, выделенные из клеток листьев Thlaspi goesingense, были более устойчивы к действию NiSC 4 (250 мкМ), чем протопласты из неустойчивого KNi вида, Thlaspi arvense [Kramer et al., 1997].
Однако, теми же авторами с помощью спектроскопии (X-ray absorption spectroscopy) было показано, что после 24 часов экспозиции проростков на раство t /го pax, содержавших 1 мкМ NiS04 и 40 цСі NiCl2, только 15-20 % Ni находилось в вакуоли в виде комплекса с цитратом, примерно 10-15 % Ni связывалось в цитоплазме с гистидином и до 65-70 % аккумулировалось в апопласте клеток листьев Thlaspi goesingense. В то же время неаккумулятор Thlaspi arvense накапливал больше металла в цитоплазме (примерно 22 %) и меньше - в вакуоли (около 8 %). При этом его содержание в листьях обоих видов было примерно одинаковым. Таким образом, возможно, что гипераккумулятор был более устойчив к Ni благодаря связыванию его в вакуоли [Kramer et al., 2000]. Полученные данные противоречат более поздним исследованиям, в которых методом .рентгеновского микроанализа было установлено, что Ni накапливался главным образом в вакуолях и, в меньшей степени, — в клеточных оболочках и цитоплазме эпидермальных клеток листьев Thlaspi goesingense, Alyssum bertolonii и Alyssum lesbiacum, выращивавшихся на почве с добавлением 2000 (для Thlaspi) или 4000 (для Alyssum) мг Ni / кг почвы (в виде NiSCXO в течение 86 или 64 дней, соответственно [Kupper et al., 2001]. Воз-можно, полученные отличия во внутриклеточном распределении металла у Thlaspi goesingense явились результатом использования соли в различных концентрациях и разного времени инкубации растений, а также неодинаковой точности методов Глави 1 Обзор литературы анализа. Так, Kramer с соавторами использовал для анализа листья, содержавшие менее 1000, a Kupper с соавторами - листья, содержавшие более 10000 мг Ni / кг сухой массы. Результаты последней работы представляются более надежными, так как в ней были использованы листья с типичным для гипераккумулятора содержанием металла, а также более точные методы.
Механизмы поступления тяжелых металлов в компартменты клетки остаются до конца невыясненными. Выяснение механизмов поступления поглощенных тяжелых металлов в вакуоль несомненно имеет важное значение для понимания устойчивости растений к ним. Во-первых, возможно, что эндоплазматический ретикулум непосредственно связан с апопластом [Гамалей, 1997] и ионы тяжелых металлов могут попадать в него непосредственно из окружающего раствора. Этот путь не обсуждается в литературе. Во-вторых, преимущественная локализация тяжелых металлов в вакуоли может обеспечиваться накоплением в ней соединений, обладающих большим сродством к тяжелым металлам (например, анионов органических кислот) и образующих с ними трудно растворимые комплексы [Krotz et al., 1989; Mazen, El Maghraby, 1997/98]. В -третьих, это может определяться синтезом в цитоплазме специальных соединений -фитохелатинов, которые образуют комплексы с тяжелыми металлами и участвуют в их поступлении в вакуоль. На этих соединениях мы подробно остановимся ниже.
Транспорт металлов (или их комплексов) в вакуоль может также осуществляться с помощью транспортеров, локализованных в тонопласте. Такие транспортеры были найдены у Thlaspi goesingense, (TgMTPltl, TgMTPlt2) [Pcrsans et al., 2001] и Thlaspi montanwn (TmMTP) [Maser et al., 2001]. TgMTPltl и TgMTPlt2 от-личаются по аминокислотному составу богатого гистидином металл-связывающего домена. Это отличие отражается в металлоспецифичности транспортеров. Так, экс-прессируясь в трансформированных дрожжах, TgMTPltl обеспечивал устойчивость к Cd, Со и Zn, a TgMTPlt2 — к Ni. По сравнению с негипераккумуляторами Thlaspi arvense, Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, у Thlaspi goesingense была установлена постоянная повышенная экспрессия гена TgMTPl, что обеспечивает более эффективный транспорт Ni в вакуоль и его детоксикацию у Thlaspi goesingense
Фитохелатины и устойчивость растений к кадмию
Типичным следствием токсического действия тяжелых металлов является уменьшение содержания хлорофилла, причем содержание хлорофилла b часто снижается сильнее, чем хлорофилла a [Stiborova et al., 1986, Stiborova, 1988; Kacabova, Nart, 1986; Lagriffoul et al., 1998; Vodnik et al., 1999; Drazic, Mihailovic, 2005; Rai et al., 2005]. Это снижение, по-видимому, может быть обусловлено как ингибированием ферментов синтеза хлорофилла [Stobard et al., 1985; Prassad, Prassad, 1987; Molas, 1997; Morsch et al., 2002] (табл. 9, 10), так и недостатком Fe и Mg [Khalid, Tinsley, 1980; Piccini, Malavolta, 1992 и др.] (табл. 11). Надо также заметить, что у разных видов растений при одной и той же концентрации металла в среде содержание хлорофилла изменяется по-разному. Так, при концентрации Cd в питательном растворе 9 мкМ было обнаружено значительное снижение содержания хлорофилла в молодых листьях Brassica juncea, тогда как содержание пигмента в листьях Thlaspi caendescens практически не изменялось [Salt et al., 1995]. Ингиби-рование синтеза хлорофилла тяжелыми металлами часто визуально выражаются в виде хлороза, что часто отмечалось в литературе [Khalid, Tinsley, 1980; Barcelo et al., 1988; Sheoran et al., 1990; Piccini, Malavolta, 1992; Bishnoi et al., 1993; Ibakwe et al., 1996; Ewais, 1997; Molas, 1997; Ernst, 1999; Барсукова, Гамзикова, 1999]. В отличие от тяжелых металлов, Sr (10 мМ) вызывал увеличение содержания хлорофилла в листьях Beta vulgaris. Механизм этого явления еще не вывлен [Kim, 1997].
Кроме подавления синтеза хлорофилла тяжелые металлы нарушает транспорт электронов, связанный преимущественно с фотосистемой II [Baszinsky et al., 1980; Veeranjaneyulu, Das, 1982; Mohanty et al., 1989; Krupa, Baszynski, 1995], что может быть следствием структурных и функциональных изменений мембран тилакоидов, а также результатом снижения ферредоксин-НАДФ+ оксидоредуктазной активности и нарушения синтеза пластохинона [Krupa, Baszynski, 1995] (рис. 3). При более детальном исследовании, например, было показано, что Ni,оказывал ингибирующее действие на транспорт электронов от феофитина через пластохинон QA и Fe на пласто-хинон QB посредством изменения структуры переносчиков (пластохинона QB) или белков реакционного центра [Mohanty et al., 1989; Krupa, Baszynski, 1995]. Кроме того, под действием Ni может снижаться уровень содержания цитохромов b6f и Ь5595 а также ферредоксина и пластоцианина в тилакоидах хлоропластов, что приводит к снижению эффективности транспорта злеісгронов [Veeranjaneyulu, Das,
Влияние тяжелых металлов на световые реакции фотосинтеза. MSP - система фотоокисления воды, Р680 - реакционный центр фотосистемы П (PSII), D1 - D2 - белки фотосистемы П, PQ - PQH2 - пул пластохинона, RFeS - Fe-содержащие белки Риски, PC -пластоцианин, Р700 - реакционный центр фотосистемы I (PSI), А - N - белки фотосистемы I, Fdx - ферредоксин, FNR. - ферредоксин НАДФ+оксидоредуктаза, CFo - CFi - частицы АТФазы, красными стрелками приведены пути транспорта электронов, синими стрелками показан транспорт протонов. Схематическое изображение мембранной организации Z-схемы приведено по Malkin, Niogi, 2000 [Серегин, Кожевникова, 2006]
Тяжелые металлы оказывают токсическое действие также на темновые реакции фотосинтеза, ингибируя активность ключевых ферментов цикла Кальвина, что наблюдалось в листьях Cajanus cajan, инкубировавшегося в присутствии NiCl2 (1 мМ) [Sheoran et al., 1990] и других тяжелых металлов (табл. 9, 10). Возможно, ин-гибирование реакций цикла Кальвина, являясь первичным механизмом действия тяжелых металлов, приводит к возрастанию количества АТФ и НАДФН, образующихся в результате световых реакций, которые, в свою очередь, создают высокий градиент рН по разные стороны мембраны тилакоида, что и вызывает ингибирова-ние работы фотосистемы II [Krupa, Baszynski, 1995]. Глава 1 Обзор литературы
Таким образом, на примере фотосинтеза, как впрочем, и на примере других процессов, можно четко проследить прямое и опосредованное действие тяжелых металлов. Прямое воздействие связано с ингибированием ферментов синтеза хлорофилла и цикла Кальвина, нарушением транспорта электронов вследствие снижения пула пластохинона и активности ферредоксин НАДФ+ оксидоредуктазы, изменением липидного состава мембран и числа тилакоидов. Косвенное же воздействие опосредовано металл-индуцированным водным стрессом, недостатком Mg и Fe, а также закрыванием устьиц, вследствие чего уменьшается количество доступного С02.
Все вышеперечисленные изменения метаболизма клеток под действием тяжелых металлов приводят к существенному изменению роста и развития растения.
Нарушение морфогенеза - один из видимых симптомов воздействия различных стресс-факторов, который часто используется для оценки их фитотоксичности. Однако до настоящего времени остаются до конца невыясненными те механизмы, которые обуславливают ингибирование роста под воздействием различных тяжелых металлов, то есть не ясно, в чем заключается общность и специфика токсического действия разных тяжелых металлов на рост. В то же время, ростовые процессы являются очень полезной и интересной моделью, позволяющей в полной мере оценить взаимосвязь между особенностями тканевого и внутриклеточного распределения металлов и механизмом их токсического действия Рассмотрим имеющиеся в литературе данные по действию тяжелых металлов на рост и морфогенез более подробно.
Токсическое действие металлов четко видно по ингибированию роста, что широко используется для тестирования их присутствия в окружающей среде [Wilkins, 1978; Wang, 1987; Devies, 1991; Breckle, 1991, 1996; Moya et al., 1993; Moustakas et al., 1994; Hagemeyer, Breckle, 1996]. Торможение роста происходит, с одной стороны, из-за нарушения метаболизма и, с другой стороны, в результате более прямого действия металлов на рост, например, в результате взаимодействия с полисахаридами оболочек и снижения их пластичности.
Влияние Са на проявление токсического действия тяжелых металлов и Sr у разных видов растений
Помимо фитохелатинов важную роль в детоксикации некоторых тяжелых металлов (особенно меди) играют металлотионеины (МТ), которые обладают высокой гомологией к металлотионеинам животных. Однако есть и существенные различия в расположении остатков цистеина вследствие чего металл-связывающие белки растений отнесены ко второму классу металлотионеинов [Robinson et al., 1993, 1997; Rauser, 1999].
В настоящее время выделено 3 типа МТ-подобных генов растений, продукты которых различаются по расположению остатков цистеина. Типы I и П содержат два богатых цистеином N- и С- концевых домена, разделенных центральным доменом. В типе I содержатся исключительно Цис-Хаа-Цис комплексы, тогда как тип П содержит также Цис-Цис и Цис-Хаа-Хаа-Цис комплексы, где Хаа - определенная аминокислотная последовательность. Конечные, богатые Цис домены наиболее консервативны. Геном одного растения может содержать несколько МТ-подобных генов. Так, например, у ара-бидопсиса имеется не менее 7 МТ-подобных генов. Они кодируют несколько типов МТ-подобных белков [Robinson et al., 1993, 1997; Murphy et al., 1997; Clemens, Sinun, 2003].
Известна последовательность растительного гена, кодирующего металлотионеины в растениях гороха (PsMTA). Ген PSMTA был найден у Е. coli и белок, продукт экспрессии этого гена, связывает с уменьшающимся сродством Си, Cd и Zn. Представляет интерес тот факт, что этот ген содержит последовательность, которая отвечает за образование этилена [Robinson et al., 1997], содержание которого под воздействием ионов Cd в большинстве случаев возрастает [Fuhrer, 1982].
Глава 1 Обзор литературы " В последние годы одной из наиболее разработанных является модель взаимодействия Cu-связьшающих белков Saccharomyces cerevisiae с поступлением Си и Fe в клетку [Robinson et al., 1997]. Поступление Си опосредовано мембранным переносчиком CTRL Поступившие в клетку ионы Си непосредственно связываются с сенсорной молекулой АСЕ1, в результате чего конформация последней изменяется, что дает ей возможность индуцировать экспрессию двух структурных генов {CRS5 и CUP1), ответственных за синтез двух МТ-подобных белков, связывающих избыток ионов Си в цитоплазме. Кроме того, поступившие в цитоплазму ионы Си, возможно с помощью переносчика ССС2, поступают в эндоплазматическии ретикулум, где происходит активация РЕТЗ-оксидазы, необходимой для высвобождения ионов Си от переносчика (рис. 9).
Структура комплекса металлотионеина с медью (содержит 7 атомов Си) и схема регуляции генов, участвующих в метаболизме Fe и Си у S. cerevisiae. Адаптировано по R. Klausner et al. (1997) (доступна на сайте http://wv v.ncbi.nlm.nih.gov/Yeast/klausner.htrnl).
У дрожжей транскрипция генов, ответственных за поступление Fe (FET3, FRE1, FRE2) стимулируется низкими концентрациями этого металла или / и Си, Регуляция в ответ на Си опосредуется Си-зависимым активатором транскрипции МАСІ, который Глава 1 Обзор литературы таюке индуцирует экспрессию гена CTR1, ответственного за поступление в клетку Си (рис.9).
Таким образом, в детоксикации тяжелых металлов могут принимать участие фи-тохелатины, металлотионеины, а также белки теплового шока [Neumann et al., 1994]. О последних еще нет достаточной информации. Образование фитохелатинов - одна из составных частей программы ответа клетки на поступление тяжелых металлов в цитоплазму. Обладая высоким сродством к SH-группам, ионы Cd являются одними из сильнейших активаторов их синтеза. Не являясь первичными генными продуктами, фитохелатины синтезируются на основе глутатиона или его аналогов (гомоглута-тиона, гидроксиметилглутатиона) в результате пептидилтрансферазной реакции, катализируемой фитохелатинсинтазой. Биосинтез фитохелатинов регулируется на уровне экспрессии семейства генов, кодирующих фитохелатинсинтазу, а также генов, кодирующих ферменты синтеза глутатиона. Остается, однако, неизвестным, происходит ли вторичное использование фитохелатинов, поступивших в вакуоль и если происходит, то как они поступают обратно в цитоплазму. Не ясно также, какие сигнальные системы и фитогормоны участвуют в регуляции экспрессии генов, кодирующих фитохелатинсинтазу и ферменты синтеза глутатиона. Решение этих вопросов, а также изучение участия фитохелатинов в детоксикации других металлов позволит более полно понять их роль в метаболизме высших растений.
В связи с проблемой гипераккумуляции и фиторемедиации, в последнее время все большее внимание уделяется механизмам поступления тяжелых металлов через плазмалемму. Показано, что существует по крайней мере три механизма транспорта тяжелых металлов: с участием переносчиков [Rogers et al., 2000; Thomine et al., 2000; Pence et al., 2000; Kochian, 2000], Ca каналов [White, 1998, 2000; Perfus-Barbeoch et al., 2002] и фитосидерофоров [Kochian, 2000]; показана возможность транспорта комплекса Ni с никотианамином посредством протонного симпортера ZmYSl у Zea mays [Schaaf et al., 2004].
Поглощение Fe представляет собой двухступенчатый процесс, на первой стадии которого при недостатке Fe происходит активация Ре(Ш)редуктазы, которая восстанавливает внеклеточные хелаты Fe(III) до Fe2+ (рис. 10). У дрожжей клонировано два гена {FRE1 и FRE2), кодирующих Ре(Ш)редуктазу. Аналогичный ген и белок (FR02) недавно были выделены из корней Arabidopsis. Последний представляет собой флавоцитохром, функционирующий как Ре(Ш)редуктаза. Активность FRE1 и FRE2 зависит от нескольких факторов транскрипции, а также от содержания в клетке ионов Си (рис. 9). Показано, что в корнях томата и Arabidopsis активность Ре(Ш)редуктазы была сосредоточена в апикальном участке корня [Kochian, 2000].
