Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Фотосинтетический метаболизм углерода 7
1.2. Транспорт ассимилятов в растении 10
1.2.1. Транспорт ассимилятов внутри ассимилирующей клетки 10
1.2.2. Флоэмная разгрузка 16
1.2.3. Способы загрузки флоэмы 17
1.2.4. Участие апопласта в транспорте ассимилятов 23
1.2.4.1. Кислотно-основные свойства апопластной жидкости 26
1.2.4.2. Ферментативная активность апопласта 28
1.2.5. Переносчики сахарозы 35
1.2.6. Дальний транспорт 37
1.2.6.1. Участие апопласта в перераспределении ассимилятов по целому растению 38
1.3. Роль донорно-акцепторных отношений между фотосинтезирующими и потребляющими ассимиляты органами в регуляции фотосинтеза 43
1.4. Образование конечных продуктов фотосинтеза 47
2. Объекты и методы исследования 55
2.1. Объект исследования 55
2.2. Проведение опытов с меченым углеродом 56
2.2.1. Введение меченой глюкозы в побег льна-долгунца 58
2.2.2. Изучение постфотосинтетического использования меченых ассимилятов в различных органах льна-долгунца 62
2.2.3. Изучение степени вымывания меченых веществ в различных тканях зрелого стебля льна-долгунца 63
2.3. Методы исследования 65
2.3.1. Хроматографическое изучение распределения 14С среди низкомолекулярных продуктов фотосинтеза 65
2.3.2. Изучение распределения С среди фракций меченых веществ, разделяемых по растворимости 66
3. Результаты и их обсуждение. 69
3.1. Метаболизация 14С-глюкозы, вводимой в растение с транспирационным током воды, в разных тканях льна-долгунца 69
3.2. Постфотосинтетическое использование меченых ассимилятов в различных органах и тканях льна-долгунца 83
3.2.1. Особенности распределения меченых ассимилятов между частями растения в постфотосинтетическом периоде 84
3.2.2. Изменение соотношения меченых соединений в различных тканях льна долгунца в постфотосинтетическом периоде 86
3.2.3. Влияние различной освещенности на постфотосинтетическое образование высокомолекулярных веществ 94
3.3. Степень вымывания веществ в разных участках стебля, образовавшихся в результате ассимиляции 14СОг целым побегом в период быстрого роста или зеленой спелости 99
3.3.1. Распределения меченого углерода, поглощенного на разных стадиях онтогенеза, по растению льна-долгунца. 99
3.3.2. Использование технологической мочки для исследования участия 14С в образовании различных компонентов стебля льна-долгунца 104
Заключение 109
Основные выводы 112
Список сокращений 113
Список литературы 114
- Транспорт ассимилятов внутри ассимилирующей клетки
- Роль донорно-акцепторных отношений между фотосинтезирующими и потребляющими ассимиляты органами в регуляции фотосинтеза
- Изучение постфотосинтетического использования меченых ассимилятов в различных органах льна-долгунца
- Постфотосинтетическое использование меченых ассимилятов в различных органах и тканях льна-долгунца
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы повысилось внимание исследователей к процессам, происходящим в апопласте растений. Во многом это объясняется появлением новых методов извлечения содержимого этого компартмента путем центрифугирования инфильтрированных водой объектов. Использование данного метода позволило получать апопластную жидкость в больших количествах и изучать как ее катионный состав (Muhling, Sattelmacher, 1995) и величину рН (Muhling et al., 1995), так и концентрацию метаболитов (Lohaus et al., 1995). В апопласте были обнаружены многие белки-ферменты (Ogawa et al., 1996; Kronfuss et al., 1996).
В кинетических опытах с меченым углеродом было показано (Minchin, Мс Naughton, 1987; Чиков и др., 1998), что ассимиляты выходят во внеклеточное пространство не только листьев, но и стеблей, где они уносятся транспирационным током воды вверх. Таким образом, в верхней части побега листья для своего метаболизма имеют, как минимум, два пула используемых фотоассимилятов: «собственные» (образовавшиеся в ходе фотосинтеза ССЬ) и «чужие» (транспортированные из других листьев-доноров).
Можно предполагать, что эти фонды различаются не только по составу и каналам их утилизации, но и по соотношению образующихся конечных продуктов. Изучение особенностей постфотосинтетического использования «собственных» и «чужих» ассимилятов может позволить более полно понять механизмы формирования составных частей урожая и найти пути к управлению как их количественным, так и качественным составом. Постфотосинтетические процессы с точки зрения различного использования «собственных» и «чужих» ассимилятов практически не описаны в литературе.
Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы является выяснение особенностей постфотосинтетических превращений фотоассимилятов, образовавшихся в ассимилирующей клетке и транспортированных из других фотосинтезирующих органов.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Проследить метаболизацию меченой глюкозы, подаваемой в побег растения с транспирационным током воды, в различных тканях льна-долгунца.
2. Изучить распределение 14С-углерода в 14С-донорных и 14С-акцепторных тканях побега через различный постфотосинтетический период после 30-минутной ассимиляции 14СОг целыми растениями льна-долгунца.
3. Выяснить роль света как в синтезе, так и в распаде конечных продуктов фотосинтеза.
Научная новизна. При исследовании распределения 14С среди меченых соединений, образовавшихся в ходе фотосинтеза 14С02, впервые обнаружено, что радиоактивность белковых веществ, синтезированных в листьях в процессе фотосинтеза, значительно уменьшается, и в последствии они активно (особенно водорастворимые) гидролизуются. Происходит отток продуктов гидролиза к органам-акцепторам ассимилятов.
Впервые установлено, что, в отличие от белков, содержание 14С в ацетоновой фракции меченых продуктов фотосинтеза (липиды и пигменты) 14С-донорных листьев незначительно снижается в постфотосинтетическом периоде. В результате, по мере возрастания времени постфотосинтетического периода, доля радиоактивности этой фракции среди меченых высокомолекулярных соединений листа возрастает. Сделан вывод, что пигменты при своей деградации распадаются на достаточно большие "блоки", которые повторно используются в синтезе аналогичных веществ.
Практическая значимость работы. Полученные данные об утилизации «собственных» и «чужих» ассимилятов в различных органах льна-долгунца могут иметь большое значение для поиска механизмов управления качеством сельскохозяйственной продукции. Установление факта преимущественного синтеза нерастворимых полисахаридов волокна из «свежих» ассимилятов позволяет понять природу большой чувствительности качества льноволокна к стабильности погодных условий (Большакова, 2000) и может быть использовано в селекционной работе и при разработке агротехники выращивания льна-долгунца.
Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на 2-ой Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), на итоговой научной конференции 2000 года КНЦ РАН (Казань, 2001), на итоговой научной конференции 2002 года КНЦ РАН (Казань, 2003), на 6-ой Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 2001), на Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), на 5 съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на международной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003).
Благодарности. Считаю своим приятным долгом поблагодарить д.б.н., профессора Владимира Ивановича Чикова за постоянное внимание и поддержку, а так же за ценные советы и замечания в период постановки экспериментов и при обсуждении полученных результатов на всех этапах работы.
Хочу выразить благодарность коллегам по работе за их помощь и участие в проделанной работе.
Транспорт ассимилятов внутри ассимилирующей клетки
Начальный этап транспорта ассимилятов состоит в переносе диоксиацетонфосфата и фосфоглицеринового альдегида через мембраны хлоропласта в цитоплазму. Триозофосфатам принадлежит важная роль в регуляции отношений между хлоропластами и цитоплазмой. Вынос триоз осуществляется с помощью специального переносчика, расположенного на внутренней мембране хлоропласта, и он сопряжен с адекватным импортом внутрь неорганического фосфата. Современные исследования направлены на детальное изучение механизма действия вышеназванных транслокаторов.
Болтер с соавторами (Bolter et al., 1999) установили, что каналы, формируемые белком ОЕР21 внешней мембраны хлоропласта, выборочно облегчают перемещение триозофосфатов, 3-фосфоглицератов и фосфата. Анионная избираемость и ассиметричные транспортные свойства модулируются соотношениями между АТФ и триозофосфатами, 3-фосфоглицератами и фосфатом в межмембранном пространстве. Условия, которые ведут к экспорту триозофосфатов из хлоропластов, то есть фотосинтез, приводят к внешнему изменению канальных ОЕР21 белков, тогда как отношение АТФ к триозофосфату, то есть темновой метаболизм, приводит к внутреннему изменению белков ОЕР21 каналов с менее выраженной анионной избирательностью.
В случае нарушения эквимолярного возврата неорганического фосфата в хлоропласт его собственный запас фосфата быстро иссякает, поскольку каждая молекула триозы, выходя из хлоропласта, уносит с собой в цитоплазму одну фосфатную группу. Питере с соавторами (Pieters et al., 2001), изучая роль запроса углеводов в регуляции фотосинтеза в ответ на фосфатный дефицит в табаке (Nicotiana tabacum L.), показали, что низкая сила акцептора накладывает первичное ограничение на фотосинтез в Фн-дефицитных растениях, которое уменьшает сахарозный экспорт и синтез сахарозы, навязывая ограничение фотосинтеза синтезом конечных продуктов. В этих условиях переносчик триоз перестает функционировать, а избыток триозофосфатов превращается в самих хлоропластах в гексозофосфаты и далее в крахмал.
Хауслер с соавторами (Hausler et al., 2000) исследовали трансгенные растения табака с различной емкостью хлоропластного триозофосфат/фосфат переносчика для определения влияния его на изменение направления биосинтеза в сторону сахарозы или крахмала в связи с ассимиляцией СОг и низкой концентрацией Ог. Переносчик имел строгий контроль над уровнем ассимиляции. Включение в крахмал при высоком Ог увеличивалось в растениях табака с уменьшенной активностью переносчика и уменьшалось в растениях с суперэкспрессией этого белка. Таким образом, переносчик триоз осуществляет контроль по типу обратной связи над уровнем синтеза крахмала и позитивный контроль над биосинтезом сахарозы. Недостаток триозофосфатного экспорта компенсируется процессами деградации крахмала и утилизации глюкозы. Также исследуемый белок-переносчик чувствителен к содержанию метаболитов в воздухе.
Таким образом, крахмал играет важную роль регулятора экспорта подвижных ассимилятов в цитоплазму (Мокроносов, 1981). Поскольку в фотосинтезирующей клетке весь крахмал локализован в строме хлоропласта, то его ингибиторное влияние должно быть связано непосредственно с хлоропластом. Депрессия фотосинтеза может развиваться по нескольким направлениям: 1) накапливаясь в хлоропласте, крахмальные линзы уменьшают свободный объем стромы, механически воздействуют на тилакоиды. Избыток крахмала ухудшает так же и световой режим в хлоропласте; 2) возможна адсорбция ферментов на зернах хлоропластов, следствием чего могут быть конформационные изменения и изменение субстратной специфичности ферментных белков; 3) крахмал может сорбировать ионы, особенно Mg , это ведет к снижению активности Mg -зависимых ферментов, например РДФ-КО, или даже нарушение четвертичной структуры олигомерных белков; 4) накопление крахмала увеличивает сопротивление диффузии С02 на всем пути - устьичное, мезофильное, сопротивление карбоксилирования; 5) включение процесса гидролиза крахмала ведет к увеличению концентрации глюкозы в пластиде, что может вызвать глюкозное ингибирование.
Выходя из хлоропласта в цитоплазму (вторая зона на рисунке 1), триозофосфаты быстро претерпевают ряд промежуточных превращений, образуя сахарозу. Именно здесь впервые возникает сахароза — основной транспортный дисахарид. Ее образование связано с наличием целой системы ферментов, которая формируется в листе к периоду его созревания для экспорта ассимилятов. В частности, как показал Жиаквинта (Giaquinta,1978), к этой системе относится сахарозофосфатсинтетаза, катализирующая образование сахарозо фосфата из фруктозо-6-фосфата и УДФГ. Указанный фермент играет ключевую роль в цепи превращений триозофосфатов в сахарозу.
Другим ферментом, исполняющим важную регуляторную роль в той же системе, является фруктозо-1,6-бифосфатаза. Она осуществляет отщепление от фруктозо-1,6-бифосфата фосфатного остатка из положения 1. В результате этой реакции осуществляется одновременно 2 цели: 1) освобождается молекула неорганического фосфата (рис.1), которая может войти обратно в хлоропласт взамен экспортируемого триозофосфата и 2) образуется фруктозо-6-фосфат, который в отличие от фруктозо-1,6-бифосфата более стабилен, так как не может непосредственно вновь распадаться на триозофосфаты. Он дает начало образованию целого ряда гексозомонофосфатов, ведущих к синтезу сахарозы. Как и сахарозофосфатсинтетаза, фруктозо-1,6-бифосфатаза также отзывчива на донорно-акцепторные отношения, активизируясь при усилении запроса со стороны тканей акцептора и делаясь менее активной при ограничении запроса. Существенно также, что при ограничении экспорта триозофосфатов из хлоропластов, например, при понижении концентрации СОг в цитоплазме мезофильных клеток, значительно уменьшается активность и сахарозофосфатсинтетазы, и фруктозо-1,6-бифосфатазы. В результате путь к образованию сахарозы оказывается перекрытым дважды, чем обеспечивается необходимый уровень первичных продуктов фотосинтеза в цитоплазме фотосинтезирующих клеток.
Роль донорно-акцепторных отношений между фотосинтезирующими и потребляющими ассимиляты органами в регуляции фотосинтеза
Донор ассимилятов - фотосинтез и их акцептор - процессы роста и отложения веществ в запас образуют взаимосогласованную систему. Если внешние условия не лимитируют фотосинтез, то ведущая роль в детерминации фотосинтеза принадлежит внутренним процессам. Мокроносов А.Т. (1981) выделяет три категории факторов, на которых основывается это положение. 1. Существует положительная корреляция между относительной скоростью ростовых процессов и фотосинтетической активностью листьев. 2. Показано, что любые естественные или экспериментальные изменения в скорости ростовых процессов, изменяющие потребности эпигенеза в энергопластических субстратах, сопровождаются адекватными изменениями интенсивности фотосинтеза. Хамфри с соавторами (Humphries et al., 1964) использовали укоренившиеся листья фасоли как модель для изучения зависимости между фотосинтезом и акцепторными органами. Появление корней на изолированных листьях сопровождалось усилением фотосинтетической активности. Удаление корней вызывало повторную депрессию фотосинтеза. Н.А. Иванова (1970), работая на изолированных листьях томатов, наблюдала при их укоренении не только усиление фотосинтеза, но и сильную активацию биосинтеза белка и крахмала. В работе Спенса и Хамфри (Spence and Humphries, 1972) моделью служили укорененные листья батата, способные образовывать клубни. Увеличение роста клубней при изменении влажности, температуры или под влиянием бензиладенина сопровождалось увеличением чистой ассимиляции 0(. Усиление фотосинтеза при увеличении «запроса» удается наблюдать и без нарушения целостности растения, затемняя часть фотосинтетической поверхности. Торне и Коллер (Thorne and Koller, 1974) затемняли растения сои, оставляя на свету лишь отдельный лист. За час из листьев контрольных растений экспортировалось 25% «свежих» ассимилятов, а из листа затемненного растения - 60%. Соответственно этому, скорость фотосинтеза была 40 и 60 мг СОг/дм в час. Усиление фотосинтеза обеспечивалось увеличением активности РДФ-карбоксилазы и понижением мезофильного сопротивления.
Показано, что искусственное уменьшение площади листьев на растении при сохранении прежней активности аттрагирующих центров, как правило, сопровождается увеличением фотосинтетической активности единицы площади листьев. Усиление фотосинтеза при частичной дефолиации наблюдали многие авторы (Барьетас,1961; Петинов и др., 1964; Мокроносов и др., 1971). После частичной дефолиации у растений фасоли наблюдается повышение не только интенсивности фотосинтеза, но и активности РДФ-карбоксилазы (Neatles et al.,1970). Эти эксперименты подтверждают положение о том, что даже при естественной концентрации СОг общая скорость фотосинтеза определяется не только скоростью диффузии С02 , но и другими эндогенными регуляторными механизмами. Таким образом, метаболическая активность аттрагирующих центров определяет потребность в ассимилятах, то есть детерминирует интенсивность фотосинтеза, скорость и направление транспорта ассимилятов.
По мнению Мокроносова А.Т. (1981), в завершивших рост листьях есть несколько способов устранения репрессии фотосинтеза ассимилятами: полимеризация (синтез крахмала); усиление окисления продуктов фотосинтеза в дыхательном метаболизме; внутриклеточный транспорт, обеспечивающий компартментацию метаболитов в вакуоли или в свободном пространстве клетки; транспорт ассимилятов в клетки флоэмы и паренхимы. Депонирование ассимилятов можно проследить на разных структурных уровнях, в том числе и свободном пространстве (апопласте). Таким образом, Мокроносов А.Т. свидетельствует о том, что интенсивность фотосинтеза зависит от характера донорно-акцепторных отношений в растении, а свободное пространство листа участвует в демпфировании взаимодействия между фотосинтезирующими органами и органами-потребителями ассимилятов.
Распределение 14С в продуктах фотосинтеза листьев и апопласта существенно различается. Значительно больше содержится 14С в аминокислотах и гексозах, но меньше в сахарозе в клетках мезофилла, чем в апопласте. В результате, соотношение меченых сахароза/гексозы в апопласте на много выше. Свободные меченые гексозы в листе могут образоваться либо в результате дефосфорилирования соответствующих фосфатов Сахаров (и это должно, скорее всего, происходить в цитозоле), либо гидролиза вновь синтезированной 14С-сахарозы инвертазой. Соотношение радиоактивности меченых в ходе фотосинтеза сахароза/гексозы является чувствительным показателем реакции фотосинтетического метаболизма углерода на разные воздействия. Любое подавляющее фотосинтез или снижающее экспорт ассимилятов воздействие приводит, прежде всего, к снижению синтеза сахарозы и соотношения меченых сахароза/гексозы (Тарчевкий и др., 1973; Чиков, 1988). Сделанный В.И. Чиковым (Чиков, 1987; Чиков, 1988) анализ изменения фотосинтеза и фотосинтетического метаболизма углерода при действии засухи, избыточного уровня азотного питания и других неблагоприятных факторов среды показал, что основной причиной уменьшения фотосинтеза и появления неспецифических изменений фотосинтетического метаболизма углерода в таких условиях является снижение экспорта ассимилятов из листа.
В случае усиленного азотного питания такой вывод может быть подтвержден и расчетом концентрации меченых гексоз в этих двух компартментах. В опытах (Чиков и др., 1998, Chikov et al., 2001) содержание 14С в клетках мезофилла и апопласте было 1414 и 33.1 кБк у неудобренных и 3322 и 85.9 кБк у удобренных растений, соответственно. Содержание 14С в низкомолекулярной фракции составляло 70% от общего пула радиоактивных, соединений. Учитывая, что объем жидкой фазы клеток мезофилла составляет 90% объема листа (Белькович, Гусев, 1981), а часть внеклеточного пространства, где локализованы Н-АТФазы (Hoffman and Kosegarten, 1995), участвующие в транспорте сахарозы - не более 10% всего объема апопласта (т.е. 1% объема жидкой фазы листа), в гексозах было найдено 35.6; 0.23; 97.6 и 1.70 кБк, соответственно. Из этого видно, что меченых гексоз внутри клеток мезофилла значительно больше, чем в апопласте. Однако, если учесть, что апопластное пространство, а тем более зона деятельности инвертазы, во много раз меньше симпласта листа, то концентрация гексоз во внеклеточном пространстве может оказаться выше, чем в клетках мезофилла, следовательно, подтверждать факт торможения экспорта сахарозы в акцепторные ткани.
Изучение постфотосинтетического использования меченых ассимилятов в различных органах льна-долгунца
Растения льна в период быстрого роста, когда высота достигала 11-1 Зсм, накрывали прозрачной фотосинтетической камерой (рис.6), куда с помощью компрессора из газгольдера, используя установку (рис. 4), в течение 30 минут на свету вводили 14С02. Концентрация СОг в камере поддерживалась в пределах 0,035-0,025%. Затем растения оставляли вегетировать в естественных условиях. Через 1, 12, 17 или 21 сутки после поглощения меченого углерода растения расчленяли на части и фиксировали. За постфотосинтетический период высота растений достигала 11-13, 28-32, 35-37 и 40-45 см, соответственно. Побег льна-долгунца разделяли на донорную (поглощавшую 14СОг) и акцепторную (выше донорной) части, как показано на рис. 6. Каждую из этих частей дополнительно расчленяли на листья, луб и древесину. Далее, в гомогенизированных образцах анализировали распределение 14С в различных фракциях меченых веществ. Растения, расчлененные через 24 часа и 17 суток после введения 14СОг, фиксировали кипящим этанолом для анализа распределения 14С по отдельным частям растения. Белки извлекались КОН и тритоном Х-100. Избрание первой аналитической точки через одни сутки определялось необходимостью исключить влияние фотодыхания на потерю меченого углерода в постфотосинтетический период. Растения, срезанные через 12 и 21 сутки, фиксировали кипящим водяным паром при температуре 100С с последующим досушиванием при температуре 60С для определения включения 14С в высокомолекулярные вещества. В период быстрого роста растений (высота растений 25-30 см) и в зеленой спелости (высота растений 95-100 см) часть посева накрывали прозрачной камерой, куда из газгольдера подавали меченый углекислый газ. Концентрация углекислоты поддерживалась в пределах 0.035-0.025 об.%. Растения ассимилировали на свету 14СОг в течение 30 минут, а затем их оставляли вегетировать в естественных условиях до созревания. После созревания (желтая спелость) растения выдергивали с корнями и высушивали в снопиках. Высушенные растения разделяли на три части. Одну из них изучали на предмет содержания 14С в различных частях и тканях растения. При этом растения расчленяли на следующие части (рис.7): 1) нижняя часть (до 35 см от уровня земли), которая при подкормке растений 14С в фазе быстрого роста находилась в фотосинтетической камере. Таким образом, для растений, подкормленных С в фазе быстрого роста, эта часть побега непосредственно поглощала меченый СО2; 2) средняя часть (от 35 до 70 см от уровня земли); 3) верхняя часть (от 70см и выше от уровня земли); 4) отдельно учитывали массу и радиоактивность высохших листьев, семян и створок коробочек.
У растений, получавших 14С в фазе быстрого роста, средняя и верхняя части образовывались, использовав реутилизированный меченый углерод, а у получавших метку в фазе зелёной спелости её поглощали все части растения, включая и соцветие с зелёными коробочками. Каждую из этих частей растения растирали и определяли радиоактивность аликвоты - 5мг для последующего расчета содержания 14С в каждой из тканей. Вторую часть растений после удаления листьев и коробочек, также предварительно разделённых на нижнюю, верхнюю и среднюю части, подвергали технологической мочке. Мочка проводилась в стеклянных сосудах в ультратермостате при температуре 38С. Мочка в соответствии с технологией проводилась в течение 72 часов. За это время волокно полностью отделялось от древесины. Скрепляющие его вещества гидролизовались и переходили в раствор. Какое-то количество метки, вероятно, выделялось и в атмосферу. Были предприняты попытки уловить выделяющийся 14СОг поглощением его щелочью, но они не увенчались успехом. После мочки отдельно оценивали радиоактивность жидкой фракции, куда поступил меченый углерод из гидролизовавшихся веществ, а также древесины и луба (после сушки и растирания). У третьей части растений целую соломку (также разделенную на три части) после мочки и растирания оценивали отдельно радиоактивность костры, чесаного волокна и очеса, полученных в результате дальнейшей технологической обработки льно-соломки. Радиоактивность волокна оценивали отдельно в верхней, средней и нижней частях побега. Все опыты проведены в 5-6 биологических повторениях. Полученные данные обрабатывали статистически (Лакин, 1990). На таблицах и графиках представлены средние значения со среднестатистической ошибкой. В работе обсуждаются только данные, различающиеся с достоверностью не менее 0.95. Хроматографические исследования применяли для оценки распределения 14С среди низкомолекулярных продуктов фотосинтеза и веществ метаболизации меченой глюкозы. Для этого использовали фиксированные в 80% и растертые в 60% этаноле пробы. На стартовое пятно хроматограмм наносили объем вытяжки, соответствующий 50-150 тыс.имп/мин, для чего использовали хроматографическую бумагу FN-15 (Германия) размером 20x20 см. Для разделения водоспирторастворимой вытяжки на составляющие мы использовали 2 системы растворителей (Плешков, 1968).
В первом направлении - бутанол : вода : муравьиная кислота в соотношении 75 : 12 : 13, а во втором направлении - насыщенный водой фенол. После разделения меченых соединений хроматограммы высушивали и экспонировали на рентгеновских пленках РМ-1, чувствительностью 300 единиц в обратных рентгенах. Радиоактивность проб, так же как и пятен на хроматограммах, соответствующих меченым соединениям, определяли на сцинтиляционном счетчике «Дельта-300» (США). Сумму радиоактивности всех пятен на хроматограмме принимали за 100% и определяли процентное содержание каждого соединения от суммарной радиоактивности всех пятен на хроматограмме. Размолотый фиксированный материал анализировали на содержание 14С в различных по растворимости фракциях веществ (по схеме на стр. 67): извлекаемых ацетоном (липиды, пигменты); извлекаемых водой (низкомолекулярные соединения), с последующим диализом через мембраны фирмы «Baxter» (США и Канада), пропускающими вещества с молекулярной массой менее 6000 кД; водосолерастворимых белках, оставшихся в диализных мешках и экстрагированных раствором 0.2 М NaCl; спирторастворимых белках (80% этанол); пектинах, растворимых в горячей (100%) воде; белках, извлекаемых щелочью (0.1 М КОН), белков, извлекаемых тритоном Х-100. Осадок обрабатывали а-амилазой для определения содержания метки в крахмале.
Постфотосинтетическое использование меченых ассимилятов в различных органах и тканях льна-долгунца
Исследования метаболизма экзогенной 14С-глюкозы позволили обнаружить влияние света на включение метки не только в первичные продукты фотосинтеза, но и в высокомолекулярные вещества. Поскольку ,4С-углерод глюкозы, по-видимому, включался на свету в фотосинтетическое русло, отмеченные выше эффекты, вероятно, связаны с различием в использовании продуктов фотосинтеза на свету и в условиях затенения. Кроме того, часть меченых продуктов фотосинтеза после их образования в доноре экспортируется в другие органы (как по флоэме, так и через апопласт), где они уже являются «чужими», при этом пути их использования могут быть различны. Поэтому было интересно проследить за изменением метаболизма продуктов фотоассимиляции J СОг в случае использования «своих» и «чужих» ассимилятов в постфотосинтетическом периоде.
С этой целью нативные растения льна-долгунца, подкормленные в течение 30-ти мин 14С02, оставляли ассимилировать 12С02 в естественных условиях в течение длительного периода (12-21 день), так, чтобы успевала сформироваться существенная часть побега, при построении которой использовались как меченые, так и немеченые продукты фотосинтеза. В синтетических процессах нижней части побега (14С-донорная часть) использовался меченый углерод из «собственных» ассимилятов, а в верхней части побега (14С-акцепторная часть), в основном, использовался немеченый углерод, но часть «чужих» 14С-продуктов фотосинтеза, транспортированных вверх по апопласту с водным током, включалась в ткани-акцепторы 14С-ассимилятов.
За прошедшие после поглощения 14СС 2 сутки меченый углерод распределился по различным органам исследуемых растений, как показано на рис.8. Половина 14С, усвоенного в нижней (14С-донорной) части побега, через 17 дней была обнаружена в верхней (14С-акцепторной) части.
В ходе постфотосинтетических окислительных процессов более половины поглощенного меченого углерода из растения терялось. Это приблизительно соответствовало количеству имеющихся в побеге меченых низкомолекулярных веществ (табл. 6), которые могут транспортироваться из листьев в другие органы или/и использоваться в дыхании. Энергия дыхания может расходоваться на поддержание функционирующих структур, на образование новых тканей и на поглощение минеральных веществ из почвы.
Характерно, что в донорных листьях в течение всего постфотосинтетического периода, несмотря на уменьшение содержания меченого углерода, сохранялся относительно высокий уровень 14С в низкомолекулярных веществах, что свидетельствует о гидролизе высокомолекулярных соединений. Еще в 1938 Палеевым (Палеев, 1938) было показано, что в донорно-акцепторных отношениях весь транспорт подчиняется одному запросу, исходящему, например, от запасающего корня, семян, или, как это происходит в нашем случае, от верхушки развивающегося растения. В результате, наблюдается деполимеризация структурных и запасных веществ других тканей и начинается перемещение продуктов их распада к доминирующему центру.
По мере исчерпания в 14С-донорном участке низкомолекулярных 14С субстратов доля их радиоактивности в акцепторных тканях снижалась, а основная часть метки накапливалась в полимерных веществах. Образующиеся в акцепторных тканях радиоактивные полимеры, вероятно, уже в меньшей степени подвержены гидролизу и транспорту в восходящем направлении. Известно, что дыхание молодых листьев значительно интенсивнее, чем завершивших рост листьев. В результате, в верхушке побега оказывается мало радиоактивности (рис.8). Постфотосинтетическое использование 14С-ассимилятов в 14С-донорной и 14С-акцепторной частях побега приводило к образованию конечных продуктов разного соотношения (табл.5). Листья 14С-донорной части побега характеризовались более высоким содержанием метки в ацетоновой фракции (пигменты и липиды). Радиоактивность этой фракции в листьях донорного участка по сравнению с соответствующей в листьях-акцепторах или других тканях (луб, древесина) была значительно выше. Очевидно, что главными функциями луба и древесины являются проводящая и механическая (или опорная) функции, и ассимиляты в растении тратятся на синтез структур согласно специфичности ткани. Другими словами, стебель - это мало фотосинтезирующий орган, следовательно, в нем слабо развит или не развит фотосинтетический аппарат, поэтому в его тканях не происходит накопления метки в ацетоновой фракции.
Могло возникнуть сомнение, действительно ли ацетоновая фракция содержит значительное количество пигментов и липидов. Для этого с помощью двумерной хроматографии была проанализирована ацетоновая фракция 14С-донорных и 14С-акцепторных листьев. Выяснилось, что в ацетоновой фракции 14С-донорных листьев более 90% радиоактивных веществ находится во фракции пигментов и липидов (табл. 6). В 14С-акцепторных листьях в ацетоновой фракции относительная радиоактивность пигментов оказалась меньше. Более высокое содержание в этой фракции меченого углерода в аминокислотах и в веществах, локализованных в зоне старта, позволяет предполагать, что из «чужих» ассимилятов больше синтезируется сложных неполярных веществ.
