Содержание к диссертации
СОКРАЩЕНИЯ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Систематика и происхождение, ботаническое описание и особенности биологии льна-долгунца 11
Основные направления и проблемы селекции льна-долгунца 17
Биотехнологические способы создания генетического разнообразия льна 20
Морфо генетический ответ растений рода Linum 21
1.4.1.Физиологический контроль морфогенеза in vitro 23
1.4.1.1.Зависимость морфогенеза от источника экспланта 23
Зависимость морфогенеза от генотипа растения-донора 29
Зависимость морфогенеза от состава среды 30
Получение новых форм растений в роде Linum методами культуры тканей . 36
Растительные протопласты в качестве источника новых форм растений рода Linum 38
Эмбриокультура и культура пыльников в качестве источника новых форм растений рода Linum 39
1.5. Получение новых форм растений методами генетической
инженерии 40
Использование селективных генов при трансформации клеток растений 42
Репортерные системы и возможности их применения в генетической трансформации 45
р-глюкуронидаза (GUS) E.coli - одна из наиболее распространенных репортерных систем 48
Получение трансгенных растений рода Ыпит 51
1.6. Заключение 59
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 61
ILL Реактивы, использованные в работе 61
Растительный материал 61
Среды для культивирования растений и растительных тканей.. 61
Получение проростков in vitro в качестве источника эксплантов62
Регенерация растений 62
П.б. Укоренение растений-регенерантов 63
П.7. Исследование морфологии растений и цветка 63
IL8. Бактериальные штаммы и среды для выращивания бактерий... 63
П.9. Трансформация растений 65
11.10. Анализ трансформированных растений 66
II. 10.1. Тестирование по росту в селективных условиях 66
II. 10.2. Методы молекулярной биологии 66
П.10.2.1. Выделение тотальной ДНК 66
П.10.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 61
II. 10.2.3. Электр о форетические методы 67
II.10.3. Анализ экспрессии встроенного репортерного гена GVS 68
II. 10.3.1. Гистохимический метод определения активности В-
глюкуронидазы 68
II.10.3.2. Флуориметрическим метод определения активности В-
глюкуронидазы 68
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 70
Ш.1. Стерилизация семян и получение проростков in vitro 70
111.2. Обоснование выбора эксплантов 71
Ш.З. Изучение и оптимизация факторов, влияющих на
морфогенетическуго способность семядольных эксплантов льна-
долгунца 73
Ш.З. 1. Подбор оптимального физиологического возраста экспланта 74
III.3.2. Изучение влияния генотипа и соотношения регуляторов роста в
питательной среде 76
Ш.3.3. Изучение влияния способов предварительной обработки
эксплантов 80
Ш.3.4. Изучение влияния соотношения регуляторов роста в питательной
среде при различном физиологическом возрасте экспланта 83
III.3.5. Изучение влияния негормональных компонентов питательной
среды 84
Ш.З.6. Изучение влияния абсцизовой кислоты 87
Ш.З.7. Укоренение и вегетативное размножение 89
Ш.З.8. Морфология растений-регенерантов 91
Ш.4. Получение трансгенных растений льна-долгунца 92
Ш.4.1. Влияние антибиотиков на каллусо- и побегообразование на
эксплантах нетрансформированных растений 92
Ш.4.2. Трансформация растений 94
Ш.4.2.1. Влияние времени взаимодействия с агробактерией на частоту
трансформации 94
111.2.2.2. Влияние используемой генетической конструкции на частоту
трансформации 95
Ш.4.3. Анализ растений трансформантов 96
IIL4.3.1. Повторное тестирование растений на устойчивость к Км 97
IIL4.3.2. Анализ ДНК трансформированных растений 98
111.4.3.3. Определение экспрессии гена р-глюкуронидазы 99
Ш.4.4. Морфологические особенности трансгенных растений 102
Ш.4.5. Изучение наследования встроенных генов 104
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПО
СОКРАЩЕНИЯ
БАП - 6-бензиламинопурин
ИУК - индолилуксусная кислота
НУК - нафтилуксусная кислота
АБК - абсцизовая кислота
Км - канамицин
Кл . - клафоран
2,4Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
nptll - ген неомицинфосфотрансферазы II
nos- промотор гена нопалинсинтазы
чт - частота трансформации
чр - частота регенерации
ап - анализ поколения
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших
сельскохозяйственных культур комплексного использования является лен-
долгунец (Linum usitatissimum L). Он широко применяется в текстильной,
лакокрасочной, электротехнической, резиновой, кожевенной,
мыловаренной, фармацевтической, а также пищевой и других отраслях промышленности. Льняные ткани отличаются гигиеничностью, продолжительным сроком носки, хороши при стирке и устойчивы против гниения. Льняное масло используется для изготовления масляных красок, олифы, лаков и как продукт питания. Льняной жмых - высокопитательный концентрированный корм для животных (содержит до 36% легкоусвояемых белков). Кроме того, лен-долгунец способен хорошо расти в зонах умеренного климата, что делает эту культуру особенно важной для условий средней полосы и севера России.
Современное сельское хозяйство и перерабатывающая промышленность предъявляют достаточно высокие требования к сортам, но их генетическое однообразие и селекция на трудно совместимые признаки, такие как высокая урожайность семян и волокна, высокая урожайность волокна и его высокое качество, дружное созревание, неполегаемость и т.п., очень часто затрудняют работу селекционеров. Широкие возможности для решения этих проблем открывают биотехнология и генетическая инженерия, методы которых позволяют включать в геном растений чужеродные гены, изменяя свойства растений.
Хотя лен в культуре in vitro известен около 30 лет [Ruybczynsky, 1975; Gamborg, Shyluk, 1976; Mathews, Narrayanaswamy, 1976; Murray et al., 1977; Lane, 1979; McHughen et al., 1984; 1989; 1986; 1994; 1997; 1998; Pretova, Williams, 1986; Ling, Binding, 1887; McHughen, 1987; 1989; Jordan, McHughen, 1988; Dong, McHughen, 1991; 1993; Nichterlein, Fredt, 1993; Поляков и др., 1998; Tejklova, 1998; Dedicova et al., 2000; Каляева и др.,
2000; Поляков, 2000(a); Mundhara, Rashid, 2001; 2002; Hjordis et al., 2003; Rutkowska-Krause et al., 2003; Yildiz, Ozgen, 2004]. В настоящее время активно исследуют, в основном, лен масличный, у которого достаточно легко образуются растения-регенеранты. Однако применение для льна-долгунца методов регенерации и генетической трансформации, основанных на уже разработанных системах для льна масличного, дают низкую частоту образования побегов-регенерантов и побегов-трансформантов. В нашей стране исследования, связанные с культурой ткани и генетической инженерией льна-долгунца, были начаты в нескольких научных центрах [Чикризова, 1997; Поляков и др., 1998, 2000; Егорова, 1999; Поляков, 2000; Каляева и др., 2000; Каляева, 2001; Пролетова, 2000; 2003; Чикризова, Поляков, 2000; 2004; Пролетова и соавт., 2004], однако, к настоящему времени их ведется очень мало.
В работах, посвященных разработке систем регенерации и трансформации льна-долгунца, в качестве эксплантов, как правило, использовали сегменты гипокотиля, также применяемые при трансформации льна масличного. Однако известно, что при снятии апикального доминирования образование адвентивных почек на гипокотиле льна происходит в основном из эпидермальных клеток [Crooks, 1933; Link, Egers, 1946; Murray et al., 1977 Shepard, 2000], тогда как трансформация и пролиферация трансформированных клеток идет вокруг раневой поверхности. Поэтому после генетической трансформации огромная часть побегов на сегментах гипокотиля образуется из ^трансформированных клеток, а часть образующихся побегов состоит из трансформированных и ^трансформированных клеток (химерные побеги). Увеличение раневой поверхности путем удаления части эпидермиса, надрезания и прокалывания эксплантов при подготовке гипокотилей к трансформации позволяет несколько увеличить процент истинно трансгенных растений-трансформантов, но, с другой стороны, делает процесс более трудоемким, и к тому же снижает жизнеспособность
эксплантов [Поляков и др., 1998]. Dong и McHughen [1993] в своих работах показали, что доля химерных по трансгену растений-трансформантов, образующихся на сегментах гипокотиля, даже при удалении части эпидермиса перед проведением генетической трансформации, может достигать 45%. Все это делает актуальным разработки надежных, воспроизводимых и высокотехнологичных методов регенерации и трансформации растений льна-долгунца, доступных для широкого круга исследователей и для специалистов с/х производства.
Мы предположили, что использование иного типа экспланта позволило бы избежать проблемы образования химерных по трансгену побегов после генетической трансформации, которая связана с феноменальной природой образования адвентивных почек на гипокотиле льна. Из литературы известно, что развивающиеся семядоли обладают высоким морфогенетическим потенциалом, так как в них находится большое количество различных гормональных соединений [Sharma et al., 1990; Kusnetsov et al., 1994; Wilhemova et al., 2004]. Хотя в работах других исследователей семядоли проростков льна были охарактеризованы как низкоморфогенные экспланты, мы предполагали, что при использовании методов регенерации, разработанных в нашей лаборатории для семядольных эксплантов других культур, и семядоли проростков льна-долгунца будут способны к высокой степени регенерации.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение трансгенных растений льна-долгунца при использовании семядольных эксплантов.
В ходе исследования решались следующие задачи:
1. Изучить и оптимизировать факторы, влияющие на
морфогенетическую способность семядольных эксплантов льна-долгунца.
2. Исследовать способность к регенерации семядольных эксплантов
различных сортов ль на-долгунца.
3. Разработать способ агробактериальной трансформации
семядольных эксплантов льна-долгунца и получить растения-
трансформанты, содержащие репортерные и селективные гены.
4. Доказать трансгенность полученных трансформантов, показав
наличие и экспрессию введенных репортерных генов в трансгенных
растениях.
5. Показать наследование введенных генов.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований разработан новый метод регенерации растений льна-долгунца, позволяющий с высокой эффективностью получать побеги на семядольных эксплантах растений разных генотипов. Впервые при использовании семядольных эксплантов льна-долгунца при применении различных конструкций получены трансгенные растения с репортерным геном СС/Зф-глюкуронидазы). Впервые для льна-долгунца было показано, что наличие в используемой для трансформации конструкции последовательности внутренней инициации трансляции - IresMPcr75, выделенной из генома тобамовируса крестоцветных, вызывало увеличение эффективности трансляции по сравнению с экспрессией гена в линиях трансгенных растений, полученных после трансформации с конструкциями, не имеющими такой последовательности. Разработанная система трансформации может быть использована для получения новых форм льна-долгунца.
