Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1.Общие представления о цинке и меди, как эсенциальных элементах и потенциальных загрязнителях окружающей среды 9
1.1.1. Медь и цинк в почве и растениях 11
1.1.1.1. Медь и цинк в почве 11
1.1.1.2. Медь и цинк в растении - поглощение, транспорт, биологическая роль 14
1.1.2. Фиторемедиация 32
1.1.2.1. Экологические группы растений по отношению к ТМ. Аккумуляторы и гипераккумуляторы 32
1.1.2.2. Виды и механизмы фиторемедиации 35
1,2.Механизмы адаптации растений к высоким концентрациям ТМ 38
1.2.1. Барьерные механизмы 39
1.2.2. Хелатирование 40
1.2.2.1. Фитохелатины 41
1.2.2.2. Металлотионеины 43
1.2.3. Компартментация 46
1.2.3.1. Цитоплазматическая мембрана 46
1.2.3.2. Вакуоль 47
1.3. САМ-фотосинтез как путь адаптации растений к абиотическим стрессорным факторам . 48
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования. 53
2.1. Объект исследования 53
2.2. Выращивание хрустальной травки в водной культуре 54
2.3. Условия проведения опытов 57
2.4. Измерение биомассы 58
2.5. Определение общего содержания воды в листьях 58
2.6. Определение интенсивности транспирации 58
2.7. Определение осмотического потенциала 58
2.8. Определение содержания свободного пролина 59
2.9. Измерение рН и буферной емкости 60
2.10. Определение концентрации хлорофилла 60
2.11. Оценка утечки электролитов 61
2.12. Определение содержания ионов в ткани растений 62
2.13. Определение активности пероксидазы 62
2.14. Определение интенсивности перикисного окисления липидов (ПОЛ) 64
2.15. Определение содержания белка 65
2.16.Оценка интенсивности экспрессии генов металлотионеинов 65
2.17. Математическая обработка данных 70
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 71
3.1. Адаптация растений к действию токсических концентраций меди и цинка 72
3.1.1. Влияние меди и цинка на прорастание 72
3.1.2. Влияние меди и цинка на растения при длительном выращивании 73
3.1.2.1. Рост и развитие растений при действии высоких концентраций меди и цинка 73
3.1.2.2. Аккумуляция меди и цинка 76
3.1.2.3. Изменение водного статуса растений при действии высоких концентраций меди и цинка. Индукция САМ. 81
3.1.2.4. Формирование окислительного стресса при действии высоких концентраций меди и цинка. 94
3.1.2.5. Индукция медью и цинком экспрессии генов металлотионеинов. 99
3.2. Адаптация растений к совместному действию засоления и меди. 101
3.2.1. Рост и развитие растений при одновременном действии высоких концентраций меди и засоления. 102
3.2.2. Аккумуляция меди в условиях совместного с засолением ее действия. 104
3.2.3. Изменение водного статуса при одновременном действии засоления и меди. Аккумуляция пролина. 105
Заключение 112
Выводы 115
Список литературы 117
- Экологические группы растений по отношению к ТМ. Аккумуляторы и гипераккумуляторы
- САМ-фотосинтез как путь адаптации растений к абиотическим стрессорным факторам
- Определение интенсивности перикисного окисления липидов (ПОЛ)
- Изменение водного статуса растений при действии высоких концентраций меди и цинка. Индукция САМ.
Введение к работе
Проблема повышенного содержания тяжелых металлов (ТМ) в окружающей среде с каждым годом приобретает все большую актуальность. В настоящее время проблемными с точки зрения превышения допустимых концентраций различных ТМ являются не только участки, прилежащие к крупным магистралям, но и рекреационные территории в крупных мегаполисах, а также сельскохозяйственные угодья. В связи с этим представляется крайне необходимым проведение исследований, направленных на изучение влияния высоких концентраций ТМ на растения и формирование у последних адаптационных механизмов, позволяющих выживать в экстремальных условиях.
Полученные в таких исследованиях данные представляют большой интерес как для понимания общих механизмов устойчивости к экстремальным воздействиям, так и с практической точки зрения, поскольку устойчивые виды, способные не только расти в присутствии повышенных концентраций ТМ, но и накапливать их в надземных органах, могут в дальнейшем использоваться в целях фиторемедиации, - одной из наиболее перспективных стратегий очистки контаминированных территорий от полютантов (Cunningham and Ow, 1996; Gleba et al., 1999; Lasat, 2002).
Факультативный галофит Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка) уже длительное время используется в качестве модели для изучения механизмов адаптации к экстремальным условиям, однако, к настоящему времени не проведено систематического изучения адаптации растений хрустальной травки к действию ТМ. В исследованиях Н.И. Шевяковой с соавт. (2003) было показано, что относительная устойчивость растений М. crystallinum к кадмию сопряжена со слабым поступлением этого ТМ в надземные органы. Напротив, в исследовании Thomas et al. (1998) была установлена возможность роста растений хрустальной травки при чрезвычайно высоких концентрациях солей меди в среде (до 8 мМ), что
сопровождалось накоплением ионов меди в листьях. Однако, несмотря на то, что авторы ограничились лишь кратковременными опытами, это не помешало им заявить о возможности использования М. ciystallinum в целях фиторемедиации загрязненных медью территорий.
В последнее время немало внимания уделяется изучению механизмов адаптации растений к комплексному действию стрессорных факторов и явлению так называемой кросс-адаптации - способности растений повышать устойчивость к данному фактору в результате адаптации к фактору иной природы. Однако, вопрос о том, сопровождается ли адаптация растений к засолению увеличением толерантности к ТМ, остается в настоящее время открытым. Вместе с тем, понимание механизмов адаптации растений к комбинированному действию хлоридного засоления и ТМ представляет помимо теоретического и немалый практический интерес, - зачастую загрязнение ТМ сопровождается и повышенным уровнем солей в почве. В особенности это характерно для территорий, прилежащих к магистралям -одного из главнейших объектов фиторемедиации в крупных мегаполисах.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение воздействия на растения хрустальной травки солей меди и цинка, а также комплекса стрессорных факторов, в частности меди и хлоридного засоления, изучение механизмов адаптации к данным стрессорам, оценка возможности использования растений в фиторемедиации. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Выяснить диапазоны концентраций сернокислых солей меди и цинка,
в которых растения хрустальной травки сохраняют способность к
нормальному прохождению онтогенетического цикла.
2. Исследовать изменение основных параметров водного статуса
растений при действии меди и цинка, а также выяснить, сопровождаются ли
такие изменения стресс-индуцированным формированием важного
водосберегающего механизма М. crystallinum - САМ-типа фотосинтеза.
3. Оценить интенсивность индуцируемого солями меди и цинка у
растений М. crystallinum окислительного стресса.
4. Выяснить, приводит ли воздействие на растения хрустальной травки
солей меди и цинка к активации экспрессии генов металлотионеинов -
основной группы хелатирующих данные ТМ пептидов растений.
Исследовать особенности адаптации растений М. crystallinum к совместному действию меди и хлористого натрия.
Проследить изменение основных физиологических параметров растений М. crystallinum при комплексном действии солей меди и засоления и дать ответ на вопрос, является ли хрустальная травка пригодной для фиторемедиации территорий, подвергнутых одновременно засолению и загрязнению ТМ.
Научная новизна. Впервые показана высокая степень устойчивости растений М. crystallinum к солям цинка на стадии проростков. Впервые показана возможность функционирования САМ-типа фотосинтеза у растений хрустальной травки при действии ТМ. Экспериментально доказано, что ТМ-индуцированный окислительный стресс у растений М. crystallinum не сопровождается нарушением барьерных свойств основных клеточных мембран. Впервые обнаружена индукция ионами меди и цинка экспрессии генов металлотионеинов у растений М. crystallinum. Впервые проведено изучение особенностей формирования адаптации растений хрустальной травки к меди при совместном действии с хлористым натрием. Установлено, что адаптация растений к избыточному засолению сопровождается снижением токсического эффекта меди и что важную роль в этом процессе играет способность растений к повышенной аккумуляции пролина.
Практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные об особенностях действия солей цинка и меди на изменение параметров водного статуса, формирование САМ и окислительного стресса у растений, а также о механизмах устойчивости как к ТМ, так и к комплексному действию факторов, имеют существенное значение для
выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов и при разработке технологии создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью. Растения М. crystalUnum могут быть рекомендованы для фиторемедиации территорий с комплексным загрязнением. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных может использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Aral Sea Basin Conference» (Бухара, 2003), на V Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на годичном собрании физиологов растений России и Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений севера» (Петрозаводск, 2004), на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц, 28 рисунков; библиография содержит 131 название, в т.ч. 111 на иностранных языках.
Экологические группы растений по отношению к ТМ. Аккумуляторы и гипераккумуляторы
Сравнение последовательностей привело к разделению IB ATPases на два класса - 1) транспортеры одновалентных катионов, таких как Си, Ag, 2) транспортеры двухвалентных катионов - Cd, Pb, Zn, Со (Hall and Williams., 2003). Биохимические исследования с использованием мембранных везикул позволили установить, что основным субстратом, переносимым этим типом АТФаз, является преимущественно одновалентная медь Си (I) и лишь в незначительной степени Си (И) (Yruela, 2005). Было найдено восемь белков, относящихся к типу IB ATPases - НМА1-НМА8. Надо отметить, что НМА7 вовлечен в трансдукцию этиленового сигнала, поскольку известно, что рецепторы этилена - Cu-зависимые белки (Rodriguez et al., 1999), НМА6 участвует в транспорте меди через мембраны хлоропластов, обеспечивая кофактором медь-зависимые белки хлоропластов, среди которых Cu/Zn СОД, пластоцианин (Shikanai, 2003).
СОРТ транспортеры - другое широко распространенное семейство Си-транспортеров, обнаруженное в растениях благодаря высокой степени гомологии с транспортерами - Ctr. Пять (СОРТ 1-5) представителей данного семейства транспортеров были найдены у Arabidopsis thaliana. Все они состоят из трех трансмембранных доменов и N-концевого металлсвязывающего домена, богатого остатками метионина и гистидина, по количеству которых различают три группы СОРТ транспортеров. В первую группу входят СОРТІ и СОРТ2, с высокой афинностью к катионам одновалентной меди (Sancenon et al., 2003). Ген, кодирующий СОРТІ, экспрессируется в кончиках корней, пыльцевых зернах, трихомах и устьицах, что играет важную физиологическую роль в аккумуляции меди в данных органах в условиях недостатка этого микроэлемента в среде, поскольку было показано, что, например в таких процессах, как развитие пыльцы и элонгация корня медь играет значительную роль (Sancenon et al., 2003). Вторая группа включает СОРТЗ и СОРТ5 транспортеры и принимает участие в транспорте ионов меди в хлоропластах, обладает несколько меньшей афинностью к Си, поскольку менее богата остатками метионина и гистидина. Наконец, СОРТ4 транспортер представляет третью группу. Гены, кодирующие СОРТ4, активно экспрессируются в корнях, СОРТ4 беден остатками цистеина и предположительно играет лишь косвенную роль в процессе трансмембранного переноса меди (Yruela, 2005).
Си-шапероны принадлежат к новому семейству низкомолекулярных металл-рецепторных протеинов локализованных в цитозоле, т.н. металлошаперонов, участвующих в транспорте ионов металлов внутри клетки. Cu-шапероны выполняют крайне важную функцию транспорта меди по цитоплазме к местам утилизации Cu-зависимыми протеинами. Они предотвращают случайное связывание меди в цитозоле с другими белками. В настоящее время известно три различных представителя Си-шаперонов растений - ССН, СОХ17 и CCS. Ген ССН арабидопсиса имеет высокую степень гомологии с геном дрожжей АТХ1 и является наиболее изученным из всех трех Cu-шаперонов растений (Himelblau et al., 1998). Высокий уровень экспрессии гена ССН обнаружен в стеблях арабидопсиса. Высокие уровни ССН обнаруживаются также в растениях томата пораженных Botrytis cinirea, что указывает на интересную взаимосвязь гомеостаза меди и ответа растения на поражение патогеном (Yruela, 2005). Основываясь на гомологии с ССН и его аналога из дрожжей, было выдвинуто предположение о том, что данный шаперон взаимодействует непосредственно с АТФазами Р-типа (Yruela, 2005). Ген СОХ17 был выделен из арабидопсиса (AtCOXlT). Он кодирует последовательность, идентичную СОХ 17 Cu-шаперону дрожжей, принимающему участие в транспорте меди к митохондриям, где она необходима для функционирования цитохром-оксидазного комплекса (Balandin et al., 2002). Значительное усиление экспрессии гена AtCOX17 в ответ на повышение концентрации меди в среде может свидетельствовать о том, что данный шаперон, так же как и металлотионеины, принимает участие в детоксикации меди в растениях (Yruela, 2005). Как поставщик кофактора к медь-зависимым белкам митохондрий (Cu/Zn СОД, цитохром-оксидаза), СОХ 17 вовлечен в усиление активности специфических ферментов стресса (Balandin et al., 2002). Ген CCS, гомолог LY7 гена дрожжей был выделен из томата, арабидопсиса и картофеля (Solarium tuberosum; StCCS) (Trindade et al., 2003). Показано, что регуляция экспрессии гена StCCS находится под контролем ауксина. Не обнаружено усиления экспрессии гена StCCS в растениях картофеля в ответ на обработку медьсодержащими препаратами. Также не обнаружено усиления экспрессии гена данного шаперона и при выращивании растений картофеля в условиях in vitro на среде с высоким содержанием меди. Это позволяет сделать вывод о том, что в присутствии повышенных концентраций меди в цитоплазме отпадает необходимость в CCS шапероне, основной функцией которого является обеспечение кофактором Cu/Zn СОД (Trindade et al., 2003).
Несмотря на существенную роль, которую играют ССН и CCS шапероны в поддержании гомеостаза меди, не обнаруживается усиления экспрессии их генов в ответ на повышение концентрации Си, что позволяет предположить, что данные белки становятся необходимыми главным образом в условиях недостатка меди, обеспечивая при этом нормальное функционирование Си-зависимых ферментов. В противоположность этому, активация гена AtCOX17 в ответ на обработку медью позволяет рассматривать этот шаперон, наряду с металлотионеинами, как один из факторов детоксификации высоких концентраций данного ТМ.
Другие возможные транспортеры меди: Новое семейство протеинов, вовлеченных в транспорт двухвалентных катионов - т.н. N-ramp (Natural resistance associated macrophage proteins) транспортеры, по-видимому могут принимать участие в транспорте меди. Семейство генов N-ramp транспортеров отличается высокой консервативностью, их гомологи были найдены у различных живых организмов. Что касается растений, то достаточно хорошо исследованы N-ramp транспортеры риса (Oryza sativa), было обнаружено три гена, кодирующих последовательности гомологичные N-ramp - OsNrampl - OsNramp3 (Belouchi et al., 1995). Также пять аналогичных последовательностей обнаружено у арабидопсиса - AtNrampl -AtNramp5 (Alonso et al., 1999). На основании сравнения последовательностей данных генов выделено две их группы: 1) OsNrampl, OsNrampS и AtNrampS и 2) OsNramp2, AtNrampl, AtNramp2, AtNramp3, AtNramp4, что позволяет предположить различную субстратоспецифичность данных транспортеров.
Также как и N-ramp транспортеры других организмов, N-ramp транспортеры растений имеют 12 трансмембранных доменов и длинную С-концевую последовательность. Достоверно участие данных переносчиков в транспорте двухвалентных катионов у растений не было показано, однако, хорошо изучено их участие в аналогичных процессах дрожжей (Hall et al., 2003; Yruela, 2005).
Таким образом, к настоящему времени известно несколько различных групп переносчиков меди в высших растениях, тем не менее, механизмы регуляции экспресии их генов все еще до конца не ясны. Вероятнее всего регуляция осуществляется на транскрипционном или посттрансляционном уровнях. Контроль работы генов многих металл-транспортеров других организмов осуществляется именно на стадии транскрипции, что обеспечивается взаимодействием транскрипционных факторов с ионами металлов. Jonak et al. (2004) (по Yruela, 2005), было показано, что повышенные концентрации меди приводят к активации митоген-активируемых протеин киназ (MAPKs), по-видимому, MAPKs, принимают участие в трансдукции сигнала, индуцированного повышением концентрации ТМ.
САМ-фотосинтез как путь адаптации растений к абиотическим стрессорным факторам
Надо заметить, что эти данные были получены в условиях in vitro на изолированных фрагментах ДНК, однако, поскольку в клетке всегда присутствует некоторое количество перекиси водорода, данная реакция может иметь место и in vivo. В растении медь присутствует главным образом в виде комплексов с органическими молекулами и проявление ее токсичности во многом определяется природой последних (Maksymec, 1997). Ueda et al. (1994) было показано, что комплексы меди с пептидами, содержащими металлсвязывающие домены на N-конце молекулы, действительно способны оказывать отрицательное действие на структуру ДНК, в то время, как комплексы меди с белками, металлсвязывающие домены которых локализованы в иных частях молекулы, такими свойствами не обладают. Существует также мнение, что Си не оказывает прямого влияния на ДНК, а повреждающее ее действие носит опосредованный характер: реакция перехода меди из двух валентного в одновалентное состояние сопровождается, как отмечалось выше, образованием в клетке активных форм кислорода, которые, в свою очередь, оказывают дестабилизирующее влияние на хроматин (Maksymec, 1997).
Что касается фотосинтетического аппарата, то наиболее уязвимой для токсичных концентраций меди его частью является фотосистема II (Рис. 2), (Baron et al., 1992, 1995; Droppa et al., 1990). Предполагается, что поток электронов от Tyrz к Р680+, блокируется высокими концентрациями меди. Также показана конкуренция ионов Си с Са окислительной части ФСН (Maksymec and Baszynski, 1999) и Fe . Обнаружено замещение высокоактивной формы Cyt З559 малоактивной, по-видимому, вследствие связывания Си2+ с остатками гистидина, ведущего к изменению окислительно-восстановительной активности цитохрома (Yruela, 2005).
Известно, что длительная экспозиция растения светом высокой интенсивности приводит к возникновению фотоингибирования (Aro et al., 1993). Показано, что медь способствует интенсификации этого процесса, по-видимому, это связано с усилением продукции медью активных форм кислорода (главным образом - гидроксил- радикала) в данных условиях (Yruela, 2005). Также предполагается, что сниженное содержание хлорофилла (во многом, вследствие индуцированной медью из-за конкурентного ингибирования Fe-недостаточности), вызванное токсичными концентрациями меди, делает фотосинтетически активные органы растения более восприимчивыми к фотоингибированию (Patsikka et al., 2002).
Давно известна способность ТМ к вытеснению катионов металлов из порфириновых комплексов in vitro (Rebeiz and Castelfranco, 1973). Эксперименты, проведенные на интактных растениях, показали, что медь способна вытеснять катионы Mg из порфиринового комплекса молекулы хлорофилла in vivo (Maksymec, 1997). Кроме того, связываясь с остатками гистидина, медь нарушает связь молекулы хлорофилла с белками светоулавливающего комплекса ФСП. Это ведет к значительному снижению продуктивности последнего. Связывание, по-видимому, происходит не только с гистидином хлорофил-связывающих белков, но и с гистидином гетеродимераБ1Ю2 (Maksymec, 1997).
Токсичные концентрации меди могут оказывать не только прямое действие на активность целого ряда ферментов нарушая нативную конформацию молекулы, но и действовать опосредованно, интенсифицируемый медью синтез в клетке этилена снижает эффективность работы фотосинтетического аппарата, активация липоксигеназы ведет к усилению процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), что нарушает нормальную структуру липидных компонентов мембран. Такое нарушение приводит к выходу ионов кальция в цитоплазму из Са-содержащих органелл (таких как хлоропласты, митохондрии, ЭПР, вакуоль) и из апопласта. В регуляцию концентрации ионов Са2+ в цитоплазме вовлечен ряд механизмов, среди которых большую роль играют Са АТФазы, ингибирование активности которых высокими концентрациями меди делает невозможным отток кальция из цитоплазмы. Высокие концентрации кальция, вызывая усиление активности фосфолипаз, действуют как триггеры катаболических процессов в цитоплазме (Maksymec, 1997). Процесс ПОЛ приводит к накоплению в клетке ряда активных метаболитов, часть которых действует как раневые сигналинг-факторы (трауматин, фазеоловая к-та), часть (жасмоновая кислота, АФК, этилен) непосредственно принимает участие в усилении катаболизма (Maslenkova et al., 1990). Процесс принимает характер "каскада".
Хорошо известна способность металлов с переходной валентностью, таких, как медь, индуцировать синтез гидроксил радикалов (ОН-) вследствие взаимодействия супероксида (02 ) с Н202 (Halliwell and Gutteridge, 1984). Мишенью действия данных АФК являются самые различные компоненты клетки - мембраны, фотосинтетический аппарат и пр. Аскорбат-глютатионовый цикл вовлечен в ответ на индуцированный медью окислительный стресс (Gupta et al., 1999).
Таким образом, высокие концентрации меди действуют на самые различные клеточные процессы. Интенсивность действия Си на тот ИЛИ ИНОЙ процесс, среди прочего, во многом определяется фазой развития растения, его физиологическим состоянием и длительностью стрессорного воздействия.
Цинк, так же как и медь является эссенциальным элементом, среднее его содержание в растениях лежит в пределах 20-60 мг/кг сухой массы (Rout and Das, 2003). Известно более 300 ферментов, для функционирования которых необходим цинк, среди них - щелочная фосфатаза, алкоголь-дегидрогеназа, Cu/Zn супероксид дисмутаза и др. (Rout and Das, 2003). Также цинк играет важную роль в стабилизации структуры многих белков, в том числе некоторых последовательностей регуляторов транскрипции - цинковых пальцев, цинковых кластеров (Grotz et al., 1998). Он необходим для регуляции азотного обмена, деления клеток, синтеза ауксинов (Shier., 1994). В отличие от меди, цинк в клетке не участвует в окислительно-восстановительных процессах.
Определение интенсивности перикисного окисления липидов (ПОЛ)
Металлотионеины (МТ) - вторая широко распространенная группа металлсвязывающих пептидов высших растений. В отличие от ФХ металлотионеины - кодируемые пептиды. Впервые они были выделены из почки лошади в 1957 году, к настоящему времени опубликовано более 2500 статей, посвященных МТ животных, проведено 4 международные конференции (Барабой и Петрина, 2003). Однако МТ растений к настоящему времени все еще остаются недостаточно изученными.
Все МТ принято делить на два больших класса (Murphy et al., 1997; Барабой и Петрина, 2003): Первый класс (МТ I) - металлсвязывающие пептиды позвоночных. В металлсвязывающем домене молекула МТ I содержит 20 остатков цистеина, расположение которых крайне консервативно.
Второй класс (МТ II) - пептиды, сходные по строению с МТ I, но не имеющие столь консервативного положения остатков цистеина. Они распространены у беспозвоночных, растений, грибов, цианобактерий и некоторых других прокариот, морских водорослей и дрожжей. Второй класс МТ в настоящее время делят на два типа, причем оба типа характеризуются наличием в молекуле 12 остатков цистеина, однако МТ II типа 1 (МТ1) имеют структуру, представляющую собой сочетание только последовательностей следующего вида - бЦист-Х-бЦист (X -неконсервативная последовательность примерно 40 аминокислот, состав которых определяется видом растения и ионом металла, вызвавшего синтез МТ). Тип 2 (МТ2) представляет собой более сложные полипептиды, в молекуле которых встречаются как бЦист-Х-бЦист-группировки, так и бЦист-бЦист или 6Цист-Х-Х...Х-6Цист (в данном случае, аминокислотная вставка может быть значительно длиннее 40 остатков) (Murphy et al, 1995; Steffens, 1990). В состав аминокислотной последовательности, разделяющей два металлсвязывающих домена, могут входить и ароматические аминокислоты. Длина такого промежутка у МТ II других организмов составляет менее 10 аминокислотных остатков и не содержит ароматических аминокислот. (Cobbett, 2000; Hall, 2002).
В настоящее время гены, кодирующие МТ, были найдены у большого числа растений. Так, например, у томата обнаружено четыре гена (LEMT1, LEMT2, LEMT3 и LEMT4), располагающихся в различных частях генома (Giritch et al., 1998). У арабидопсиса показано, что различные гены МТ экспрессируются в разных органах растений, на разных стадиях онтогенеза. Так, МТ1, представленный тремя изоформами - MTla, MTlb, MTlc, конститутивно экспрессируется у проростков растения (изоформа MTla), обработка медью значительно усиливает интенсивность экспресии. Другая изоформа этого гена - MTlc экспрессируется преимущественно в корнях и взрослых листьях. Не показано интенсификации уровня экспресии ионами меди (Garcia-Hernandez et al., 1998). Другой ген МТ2 арабидопсиса также представлен несколькими изоформами - МТ2а и МТ2Ь. Обе изоформы конститутивно экспрессируются во взрослых листьях и только МТ2а индуцируется медной обработкой (Murphy and Taiz, 1995). МТ синтезируются в норме в незначительном количестве. До настоящего времени нет однозначного ответа на вопрос, какую роль МТ играют в жизини растения. Предполагается, что они принимают участие в поддержании гомеостаза микроэлементов (таких, как Zn, Си и пр.) (по Hall, 2002). Также МТ, возможно, могут выполнять функцию антиоксидантов (Mahalingam and Federoff, 2003) и мембранных протекторов (Salt and Rauser, 1995).
Сам процесс синтеза металлсвязывающих белков, подобно, системе теплового шока, представляет собой интегральный ответ клетки на воздействие многих стрессорных факторов. Существуют данные (Palmer, 1994; Барабой и Петрина, 2003), свидетельствующие, о том, что синтез металлсвязывающих белков у животных индуцируют такие факторы, как клеточное голодание, инфекции, высокое содержание Ог, воздействие проникающей радиации и многие другие.
Стимуляция синтеза МТ определенного класса зависит от многих параметров, основными из которых являются свойство ТМ и его концентрация, ионное окружение, видовые особенности растений.
Разные ионы металлов стимулируют синтез МТ не в одинаковой мере. Такие металлы, как Са, Al, Na, Mg, U не индуцируют образования МТ. Повышение содержания в клетке металлсвязывающих пептидов при действии Fe и Cs наблюдается, очевидно, в определенных условиях, зависящих от вида растения и концентрации ТМ, так как по этому поводу имеются противоречивые данные (по Евсеева и др., 2003). Имеются данные об индукции синтеза МТ ионами меди и цинка (Murphy et al., 1997; Garcia-Hernandez et al., 1998).
Процесс образования МТ проявляет зависимость и от ионного окружения. Показано, что синтез CUP1 у Saccharomyces cerevisiae, индуцируемого Си, при культивировании дрожжей в питательной среде, содержащей ионы других ТМ, в значительной степени снижен. При этом для ингибирования синтеза CUP1 содержание Со2+, Ni2+, Zn2+ должно быть, по меньшей мере, на порядок выше, чем Cd2+ и Мп2+ (по Евсеева и др., 2003).
Изменение водного статуса растений при действии высоких концентраций меди и цинка. Индукция САМ.
Данные по росту растений хрустальной травки в присутствии сернокислых солей меди и цинка представлены на рис. 9. Растения контрольного варианта за 14 суток эксперимента не только увеличили биомассу первичных листьев с 4,1 г до 23 г, но и начали формировать боковые побеги. В то же время только при минимальной из использованных концентраций меди (10 мкМ) рост и развитие растений были близки к контрольному варианту. Напротив, уже в присутствии 25 мкМ меди рост растений был очень слабым, при более высоких концентрациях биомасса растений была даже ниже исходной величины, вследствие вызванного токсическим действием меди опада. Действие меди в высоких концентрациях, кроме того приводило к образованию белесых некротических пятен на первичных листьях растений, измельчению вторичных побегов и потере тургора.
Хрустальная травка обнаружила способность адаптироваться к действию значительно более высоких концентраций цинка: 100 мкМ ZnS04 лишь слегка снижал скорость роста, при этом снижение аккумуляции биомассы первичных листьев по сравнению с контролем было недостоверно. Растения, подвергнутые действию 250 мкМ ZnSO по уровню развития были соспоставимы с растениями, выращиваемыми в присутствие 10 мкМ сернокислой меди, отличаясь от последних несколько меньшей биомассой корня и слегка замедленным развитием боковых побегов. Даже в самой высокой из использованных концентраций - 800 мкМ цинк, несмотря на сильное торможение накопления биомассы, не блокировал развития боковых побегов, что наблюдалось у растений хрустальной травки в присутствие уже 50 мкМ сернокислой меди. По уровню накопленной биомассы первичных листьев растения, выращиваемые на среде с 800 мкМ ZnSO были сопоставимы с растениями подвергнутыми действию сернокислой меди в концентрации 25 мкМ.
Таким образом, хрустальная травка обнаружила способность расти при концентрации C11SO4 в 200 раз и ZnSC 4 800 в раз выше, чем в стандартной питательной среде, обеспечивавшей нормальное развитие растений. Тем не менее, максимальные концентрации изученных нами ТМ, не вызывавшие существенного снижения накопления биомассы, были значительно ниже: для меди не превышали 10 мкМ и для цинка - 100 мкМ, что, все-таки превосходило их концентрацию в питательной среде в 40 раз и в 100 раз соответственно.
Как и для большинства изученных растений, для хрустальной травки соли меди также оказались значительно более токсичными, чем соли цинка (Иванов с соавт., 2003; Cuypers et al., 2002). Этому выводу вполне соответствуют существенно меньшие концентрации меди в сравнении с цинком, обычно обнаруживаемые в тканях растений в норме (Си - 1-Ю мкг.г" , Zn - 10-100 мкг.г"1 сухой массы), а также минимальные токсические концентрации этих ТМ (Си - 20-30 мкг.г"1, Zn - 300-500 мкг.г 1 сухой массы) (Dan et al., 1999; Репсе et al., 2000; Patsikka et al., 2002).
Различия воздействия солей этих ТМ на растения хрустальной травки проявились также и в том, что хотя цинк (в концентрации до 1 мМ) существенно замедлял рост, однако он не блокировал накопление биомассы надземных органов. В то же время присутствие всего 100 мкМ CuSC 4 полностью прекращало развитие растений и приводило к снижению биомассы из-за отмирания части листьев.
Одним из главнейших параметров, оценка которого необходима при изучении возможности использования того или иного растения в целях фиторемедиации, является такой параметр как накопление ионов ТМ в надземных органах растения. Из данных, представленных в таблице 3, видно, что в контрольных растениях содержание меди составляло 15,3 мкг, цинка 30,7 мкг на 1 г сухой массы листьев. На среде с тяжелыми металлами увеличение их концентрации в листьях было зарегистрировано с самого начала эксперимента. Уже через три дня роста содержание меди даже при минимальной из использованных концентраций (в данном случае - 50 мкМ) увеличилось до 85 мкг/г сухой массы, т.е. более чем в 5,5 раз а на 7-й день эксперимента, в присутствие в среде максимальной концентрации - 200 мкМ достигло 215 мкг/г сухой массы листьев, что превысило контрольный показатель почти в 14 раз.
Еще более значительно было накопление цинка, концентрация которого на 3-й день эксперимента превысила 210 мкг/г сухой массы листьев при минимальной из использованных концентраций - 250 мкМ, и к седьмым суткам возросла до 317 мкг/г сухой массы, что более чем в 10 раз превысило уровень накопления данного ТМ контрольными растениями за тот же период. Более чем в 55 раз по сравнению с контрольными растениями увеличилось содержание цинка в листьях хрустальной травки при выращивании ее в присутствии максимальной из использованных концентраций цинка - 800 мкМ, составив на 7 день эксперимента 1710 мкг/г сухой массы.
