Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1. Типы роста растительных клеток 9
1.2. Типы растительных клеток, растущих интрузивно 12
1.2.1. Млечники 12
1.2.2. Пыльцевая трубка 15
1.2.3. Веретеновидные инициали камбия 21
1.2.4. Элементы склеренхимы 23
1.2.4.1. Склереиды 24
1.2.4.2. Волокна 25
1.3. Флоэмные волокна льна-долгунца как объект изучения интрузивного роста
1.4. Характеристика растяжения растительных клеток с помощью методов молекулярной биологии
1.4.1. Гены белков, которые могут принимать участие в 38
поддержании или повышении тургорного давления
1.4.2. Гены белков, которые могут принимать участие в растяжении клеточной стенки
1.4.3. Другие гены 42
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Растительный материал 45
2.1. Электронная микроскопия 45
2.3. Флюоресцентная микроскопия 46
2.4 Определение длины флоэмного волокна 47
2.5. Культивирование отрезков стебля льна in vitro 48
2.6. Подготовка растительного материала для метода ЯМР 48
2.7. ЯМР 49
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение... 50
3.1. Идентификация начала интрузивного роста флоэмных волокон 50
3.2 Выявление типа удлинения клетки в ходе интрузивного роста флоэмных волокон льна
3.2.1. Сопоставление ультраструктуры цитоплазмы кончика и срединной части флоэмного волокна
3.2.2 Оценка встречаемости плазмодесм в волокнах на разных стадиях роста
3.3. Характеристика субклеточной организации волокон на стадии интрузивного роста
3.4 Формирование пучков волокон 71
3.5 Определение длины индивидуальных флоэмных волокон и расчет скорости интрузивного удлинения
3.6 Длина участка стебля до «точки слома» как индикатор длины 81 флоэмных волокон
3.7 Поиск метода для оценки интрузивного роста волокон in vitro и in vivo
Заключение 94
Выводы 98
Список использованной литературы 99
- Типы растительных клеток, растущих интрузивно
- Характеристика растяжения растительных клеток с помощью методов молекулярной биологии
- Флюоресцентная микроскопия
- Выявление типа удлинения клетки в ходе интрузивного роста флоэмных волокон льна
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность
Рост растительных клеток разделяют на координированный, протрузивный и интрузивный. При интрузивном росте растущая клетка опережает рост клеток окружающих тканей и внедряется между ними по срединной пластинке (Эсау, 1980; Fahn, 1990; Лотова, 2001). Интрузивный рост характерен для клеток нескольких растительных тканей; при этом классическим примером служат волокна. Волокно, в ботаническом понимании, - индивидуальная клетка, элемент склеренхимы - наиболее распространенного типа механической ткани вегетативных органов сосудистых растений. Особое развитие волокна получают в лубоволокнистых и древесных культурах.
Интрузивный рост растительных клеток отчасти напоминает рост аксонов и дендритов животных (Lev-Yadun, 2001), однако очевидно, что механизмы его осуществления существенно иные, хотя бы из-за наличия клеточной стенки. Различаться могут и движущие силы, и способы регуляции, сведения о которых на сегодняшний день практически отсутствуют. Этот пробел во многом объясняется тем, что непосредственное наблюдение интрузивного роста затруднено, а выделение растущих интрузивно клеток в количествах, достаточных для биохимических и молекулярно-биологических анализов, практически невозможно. Причин для этого несколько. Во-первых, интрузивный рост осуществляется клетками, находящимися в толще других тканей. Во-вторых, клетки имеют на этой стадии биогенеза тонкую клеточную стенку при коэффициенте прозенхимности более 1000, что делает их чрезвычайно хрупкими. В-третьих, in vitro интрузивный рост воспроизвести не удается, что делает особенно важным поиск подходов для его характеристики in situ.
Для исследования интрузивного роста логично выбрать объект, в котором этот процесс наиболее выражен. К числу таких относятся флоэмные
волокна льна (Linum usitatissimum L.). Временная и пространственная локализация стадий развития этих клеток легко определяется на стебле льна благодаря существованию «точки слома» - индикатора завершения интрузивного роста волокон и перехода к последующим стадиям дифференцировки (Горшкова с соавт., 2003; Gorshkova et al., 2003). Флоэмные волокна льна собраны в пучки и расположены вдоль всего длинного и тонкого стебля растения. Лен является классическим объектом для изучения формирования волокон, на его примере, в основном, сформированы представления о развитии этих клеток (Эсау, 1980). Тем не менее, к началу наших работ, об интрузивном росте флоэмных волокон льна было лишь известно, что он существует, и что этот процесс завершается выше «точки слома».
Цель и задачи исследований. Целью представляемой работы являлась характеристика интрузивного роста флоэмных волокон льна-долгунца. Были поставлены следующие задачи:
Идентифицировать начало интрузивного роста флоэмных волокон.
Выявить тип удлинения флоэмного волокна (апикальный или диффузный).
Проанализировать субклеточную организацию волокон на стадии интрузивного роста.
Охарактеризовать формирование пучков в ходе интрузивного роста волокон.
Подобрать метод оценки интрузивного роста волокон in situ.
Научная новизна работы
В работе охарактеризован интрузивный рост флоэмных волокон льна-долгунца (L. usitatissimum L.). Впервые установлено, что интрузивный рост волокон начинается раньше, чем заканчивается координированный рост окружающих тканей, и продолжается несколько дней. За это время
индивидуальная клетка достигает длины до 10 см. Охарактеризована субклеточная организация клетки на стадии интрузивного роста. Обнаружено, что число ядер в индивидуальном волокне составляет несколько десятков и положительно коррелирует (г=+0.6) с длиной клетки. Впервые получены данные о симпластической изоляции волокон на этой стадии удлинения. Впервые установлено, что волокна удлиняются всей поверхностью, а не кончиком, как предполагалось в ранних работах. Показано, что именно в ходе интрузивного роста происходит формирование пучков волокон. Впервые установлено, что увеличение числа волокон в ходе интрузивного роста можно охарактеризовать in situ с помощью метода ЯМР по увеличению доли медленной компоненты диффузионного затухания сигналов спинового эха.
Практическая ценность работы
Практическая значимость работы во многом определяется тем, что исследования проведены на хозяйственно ценной культуре — льне-долгунце. Использование и дальнейшее усовершенствование разработанных представлений и методов позволят целенаправленно изменять свойства и качество технического волокна. Полученные данные о положительной корреляции между длиной волокна и отрезком стебля от апекса до «точки слома» могут использоваться селекционерами для экспресс оценки длины формирующихся волокон. Материалы по характеристике особого типа роста растительных клеток (интрузивный рост) могут быть использованы в лекционных курсах в университетах, академических институтах и других научных заведениях.
Связь работы с научными программами
Исследования проводились в соответствии с планами НИР КИББ КазНЦ РАН (номер госрегистрации 0120.0 408625); частично поддержаны грантами РФФИ № 05-04-48906; 06-04-48853; 06-04-81049; № 08-04-00845 а также
грантом Фонда содействия отечественной науке «Лучшие аспиранты РАН» -2008. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на V съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); VIII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2004); на Международной научно-практической конференции (Торжок, 2004); на Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006); на I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); на II Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006); на годичном собрании Общества физиологов растений России и конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006); на VI съезде Общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007); на конференциях молодых ученых КИББ КазНЦ РАН (2003, 2004, 2005); на итоговой конференции КИББ КазНЦ РАН (2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Благодарности
Огромное спасибо моему научному руководителю д.б.н. Татьяне Анатольевне Горшковой за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку. Выражаю благодарность за методическую помощь сотрудникам лаборатории
механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН д.б.н. Вадиму Владимировичу Сальникову и к.б.н. Марине Вячеславовне Агеевой (электронно-микроскопический анализ), сотрудникам лаборатории биофизики транспортных процессов д.ф.-м.н. Александру Васильевичу Анисимову и к.б.н. Владимиру Николаевичу Воробьёву (ЯМР анализ). Благодарность приношу сотрудникам ВИР им Н.И. Вавилова (группе под руководством д.б.н. Н.Б. Брач) за предоставление образцов коллекции генотипов льна.
Приношу благодарность всем сотрудникам и аспирантам лаборатории механизмов роста растительных клеток КИББ КазНЦ РАН за теплую рабочую атмосферу.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 6 таблиц и 38 рисунков. Список литературы включает 178 источников, в том числе 32 - отечественных.
Типы растительных клеток, растущих интрузивно
Они тонкостенны, изредка, например, у некоторых видов молочая {Euphorbia), стенки утолщены. Химический состав латекса сложен и многообразен. Растения, млечный сок которых богат сахарами, крахмалом и белком, служат хорошими кормовыми травами. Содержание в млечном соке растений алкалоидов и гликозидов позволяет использовать их как источники папаверина, морфина и др. Растения, содержащие в млечном соке значительное количество каучука и гуттаперчи, используются как каучуконосы. Широко известно каучуковое дерево (Hevea brasiliensis) - главный источник каучука на мировом рынке. Большинство каучуконосных растений относится к семейству молочайных и сложноцветных. Сложный и разнообразный состав млечного сока служит причиной разных мнений о значении млечников. Некоторые авторы склонны относить их к проводящим тканям, поскольку они транспортируют запасные продукты. Содержание в млечниках большого количества конечных продуктов обмена позволяет их рассматривать в качестве выделительных тканей. Решение вопроса осложняется тем, что млечники не являются обязательными тканевыми образованиями всех высших растений.
В соответствии с морфологией различают нечленистые и членистые млечники (Вагу, 1877). Первые по своему происхождению относятся к сложным млечникам и состоят из продольных цепочек клеток, у которых перегородки между отдельными клетками либо полностью сохраняются, либо становятся перфорированными, либо совершенно исчезают. Млечники этого типа раньше называли млечными сосудами. Членистые млечники широко распространены у сложноцветных, маковых и у некоторых колокольчиковых.
Нечленистые млечники образуются из одной клетки, которая в результате неопределенно долгого роста развивается в трубчатую, нередко сильно разветвленную структуру. Нечленистые млечники могут развиваться в длинные более или менее прямые трубки (неветвистые млечники) или могут многократно ветвиться, образуя обширную сеть (ветвистые). Нечленистые млечники развиты у молочайных. Scharffstein (1932) и Rosowski (1968) предположили, что система нечленистых млечников у видов Euphorbia возникает из нескольких инициальных клеток, заложенных еще в зародыше. Mahlberg, исследуя нечленистые млечники у Nerium, доказал, что нечленистые млечники закладываются ещё в зародыше, а затем во время роста растения ветвятся и интрузивно растут в побеге и корне (Mahlberg, 1961). Рост нечленистых млечников продолжается во время всей жизни растения; кончики млечников проникают в новые листья, растущие области побега и корня. Такое развитие млечников наблюдали у Nerium (Mahlberg, 1963). Рост этих ветвящихся нечленистых млечников осуществляется с помощью концевого интрузивного и координированного роста (Mahlberg, 1959). Lee и Mahlberg исследовали ультраструктуру удлиняющихся нечленистых млечников у Euphorbia maculate (Lee, Mahlberg, 1999). В растущем кончике млечника они наблюдали плотную цитоплазму, насыщенную рибосомами, маленькими вакуолями, большими митохондриями, шероховатым эндоплазматическим ретикулумом, диктиосомами и пропластидами. В субапикальной области клетки обнаружили центральную вакуоль. На основании своих исследований авторы сделали выводы о высокой метаболической активности кончика клетки и апикальном характере интрузивного роста млечников. Растущие кончики млечников у Nerium oleander внедряются между клетками по серединной пластинке, никогда не проникая внутрь клетки. Во время интрузивного роста млечники образуют контакты с новыми клетками, тогда как соседние клетки вынуждены терять свои старые контакты. Проникновению кончика млечника по срединной пластинке способствует активность пектиназ. С помощью электронной микроскопии, используя реакцию на продукт фермента, пектиназы были обнаружены в центральной вакуоли и рядом с срединной пластинкой, где млечники соприкасаются с соседними клетками (Allen, Nessler, 1984). Serpe с соавторами предположили, что интрузивный рост млечников должен влиять на содержание компонентов клеточной стенки клеток, между которыми внедряются млечники. В свое работе (Serpe et al., 2002) авторы анализировали распределение /?-0-глюканов, пектинов и арабиногалактановых белков в клеточных стенках между млечниками и окружающими клетками в апексе побега Asclepias speciosa Torr. Было обнаружено, что уровень каллозы и /?-Б-галактана ниже в клеточных стенках на границе меристематических клеток и млечников, чем в клеточных стенках меристематических клеток, не прилегающих к млечникам. Каллозу часто называют "раневым" полисахаридом, так как она участвует в «заштоповании дыр» при повреждении клеточной стенки. Отсутствие каллозы при проникновении млечников свидетельствует о том, что их рост не вызывает раневого ответа. При интрузивном росте млечников меняется уровень метилирования гомогалактуронана срединной пластинки между млечниками и соседними клетками. Таким образом, интрузивный рост млечников по срединной пластинке вызывает изменения в структуре клеточных стенок, но не вызывает раневого ответа.
Еще одним примером интрузивно растущих клеток является пыльцевая трубка (Lev-Yadun, 2001). В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании физиологии, молекулярных и генетических аспектов её развития (Becker et al., 2005; Feijo et al., 2003). Это обусловлено, в первую очередь разработкой условий для воспроизведения роста пыльцевых трубок in vitro. Именно на этой модельной системе выполнено большинство работ по характеристике удлинения пыльцевой трубки. При этом, правда, следует иметь в виду, что in vivo условия роста могут отличаться от условий in vitro. Удлинение пыльцевой трубки обусловлено почти исключительно синтезом клеточной стенки (дополнительных количеств цитоплазмы не образутся). Скорость роста пыльцевой трубки составляет -200 нм/сек, а расстояние, которое она преодолевает от рыльца пестика до семяпочки, может достигать многих сантиметров. Для хорошо изученной модели — прорастающей in vitro пыльцы лилии, подсчитано, что в кончике клетки каждую секунду формируется 1.6 мкм клеточной стенки (при диаметре пыльцевой трубки 16 мкм, толщине клеточной стенки 0.2 мкм и указанной скорости роста) (Holdaway-Clarke et al., 1997).
Прорастание пыльцевых трубок сопряжено с резкой дифференциацией метаболизма различных участков клеточной стенки и клетки в целом. Растяжение происходит путем концевого роста, сходного, но не идентичного, растяжению корневых волосков и гифов грибов (Mascarenhas, 1993). Характерной чертой такого роста является зональность в расположении субклеточных структур (рис. 3). В растущей апикальной части (3-5 мкм) формируется так называемая «чистая» зона, в которой отсутствуют какие-либо крупные образования, за исключением пузырьков аппарата Гольджи. Затем следует субапикальная зона «актиновой шапочки», где сконцентрированы элементы цитоскелета, а также многочисленные цистерны аппарата Гольджи и ЭПР. Дистальная зона характеризуется интенсивным движением цитоплазмы, расположенной тонким слоем между вакуолью и плазмалеммой.
Характеристика растяжения растительных клеток с помощью методов молекулярной биологии
Последнее десятилетие ознаменовано появлением методов геномики и протеомики, которые нашли свое, пока ограниченное, применение и в изучении процессов роста растительных клеток. Эти методы позволяют исследовать совокупность мРНК или белков, присутствующих в ткани, и оценивать их изменение на разных этапах развития или под воздействием экзогенных факторов. К числу основных достоинств этих методов относят их объективность, потому что выявление генов и белков, изменяющихся в анализируемых условиях, не зависит от выбора исследователя. Это особенно важно для выявления генов и белков, участие которых в анализируемом процессе не предполагалось. Кроме того, анализ динамики изменения профиля экспрессии позволяет выявить группы корегулируемых генов.
В литературе на сегодняшний день существует описание молекулярно-генетических аспектов растяжения у следующих клеток и тканей: 1) интрузивно растущих волокон льна (Roach, Deyholos, 2007); 2) интрузивно растущей пыльцевой трубки (Feijo et al., 2003; Becker et al., 2003, 2005); 3) протрузивно растущих трихом семян хлопчатника (Zhu, 2003; Wilkins et al., 2004; Taliercio, Boykin, 2007); 4) зоны растяжения корня кукурузы (Gepstein et al., 2004). В этих объектах представлены различные типы роста. Особый интерес для нас представляют работы Roach и Deyholos. С помощью метода микрочипов, авторы провели анализ генов, экспрессирующихся в участках стебля льна, содержащих волокна на разных стадия развития (Roach, Deyholos, 2007). В своих исследованиях авторы использовали экспериментальную систему, разработанную в нашей лаборатории (Gorshkova et al., 2003) и провели сравнения профиля экспрессии генов в участках стебля льна, расположенных выше и ниже «точки слома». При обсуждении полученных данных следует иметь в виду, что наиболее однозначно интерпретируются результаты в том случае, если анализируется запуск процесса и выявляются сопутствующие изменения профиля экспрессии. Однако собрать в достаточном для выделения РНК количестве участки стебля, в которых волокна уже существуют, но еще не растут интрузивно, да еще отделить их от апикальной меристемы, практически невозможно. С этой проблемой исследователи сталкиваются при изучении различных типов роста. Можно попытаться выявить гены, содержание мРНК которых снижается при остановке растяжения. Подобный подход был предложен для изучения протрузивного удлинения волосков семян хлопчатника (Zhu et al., 2003; Wilkins et al., 2004) и использован канадскими коллегами для выявления дифференциальной экспрессии генов на разных стадиях развития флоэмных волокон льна (Roach, Deyholos, 2007).
В перечисленных выше объектах при описании экспрессии генов на стадии быстрого растяжения авторы выделяют следующие группы: (табл. 1): 1) Гены белков, которые могут принимать участие в поддержании или повышении тургорного давления. 2) Гены белков, которые могут принимать участие в растяжении клеточной стенки. 3) Другие гены.
Ещё в 1965 Lockhart суммировал большое количество экспериментальных данных по растяжению клеток в формулу: г = Ф(Р — Y), где г — скорость роста, Ф - растяжимость клеточной стенки, Р - тургорное давление, Y - минимальное давление, оказываемое на клеточную стенку, необходимое для роста (Lockhart, 1965). Эта простая формула четко показывает, что скорость растяжения клеток - это продукт дисбаланса между тургорным давлением и механическими свойствами клеточной стенки.
Повышение тургорного давления в клетке может обеспечиваться накоплением осмотически активных веществ. К потенциальным осмотикам обычно относят ионы и сахара. В трихомах хлопка и зоне растяжения корня, в отличие от пыльцевой трубки и флоэмного волокна, высоко экспрессируются гены вакуолярной инвертазы (Kohorn et al., 2006).
Для повышения тургора можно не повышать концентрацию осмотически активных веществ, а повысить проницаемость мембран для воды, например, активной работой аквапоринов (Шапигузов, 2004; Kjellbom et al., 2000; Tyerman et al., 2002). Во всех образцах, за исключением зоны растяжения корня, обнаружена высокая экспрессия генов аквапоринов и плазмалеммы и тонопласта (табл. 1).
В последнее время появляются статьи в которых отводиться важная роль в процессе растяжения не ГҐ-помпе плазмалеммы, а вакуолярной ЬҐ-помпе (Hirschi et al., 2002). В трихомах хлопка, зоне растяжения корня и пыльцевой трубке высока экспрессия генов ЬҐ-помпьі и вакуоли, и плазмалеммы. Во флоэмных волокнах обнаружены гены только вакуолярной ЬҐ-помпьі.
Для осуществления роста, безусловно, необходимо наличие тургорного давления (величина его может достигать 1000 атм.) (Cosgrove, 1993), однако существуют многочисленные примеры того, что оно не является единственно необходимым фактором. На трихомах хлопка показано, что на первых этапах удлинения клетки осмотическое давление остаётся постоянным. А удлинение идет за счет разрыхления клеточной стенки, что согласуется с высоким уровнем экспрессия генов экспансинов, о которых речь пойдет далее. И лишь на втором этапе удлинения трихомы закрываются плазмодесмы и возрастает осмотическое давление внутри клетки (Ruan et al., 2001; Wilkins et al., 1998).
Многие исследователи на сегодняшний день сфокусированы именно на роли клеточной стенки в процессе растяжения (Cosgrove, 1999; Cosgrove, 2000; McQueen-Manson, 2001; Cosgrove, 2005; Baskin, 2005). Увеличение поверхности клеток требует не только синтеза дополнительных количеств полимеров клеточной стенки, но и модификации существующих слоев, придающей способность к растяжению (Cosgrove, 1999; Cosgrove, 2000; Cosgrove, 2001; McQueen-Manson, 2001; Cosgrove, 2005; Baskin, 2005). В отсутствии такой способности новые «порции» полимеров не увеличивали бы поверхность клетки, а откладывались бы внутрь ограниченного объема, как это происходит при формировании вторичной клеточной стенки.
Исходя из сведений о строении клеточной стенки, можно предположить, что в клетке должны существовать механизмы увеличения расстояния между микрофибриллами целлюлозы. В растении нет собственных ферментов, способных гидролизовать микрофибриллы целлюлозы. Поэтому остаются лишь следующие варианты увеличения расстояния между микрофибриллами целлюлозы: 1) гидролиз связующих гликанов эндогликаназами, 2) реструктуризация связующих гликанов за счет трансгликолазных реакций. 3) модификация водородных связей между связующими гликанами и микрофибриллами целлюлозы.
Флюоресцентная микроскопия
Для окрашивания ядер использовали краситель DAPI (4 -6 -диамино-2-фенилиндол) (Serva). Индивидуальные волокна выделяли из стебля льна после частичной мацерации в 1% Macerozyme (Serva) в течение ночи и окрашивали DAPI в концентрации 0.5 мкг/мл в течение 5-20 мин.
При анализе пучков волокон использовали краситель Cellufluor (Polyscience, Inc.) Отрезки стебля ниже «точки слома» разделяли на ксилему и волокнистую часть. Волокнистую часть стебля окрашивали Cellufluor в концентрации 0.01% на 1.25 мМ боратном буфере, рН 10 в течение 5 минут при комнатной температуре.
Актиновые филаменты окрашивали красителем родамин-фалоидином на ASB (актин стабилизирующем) буфере. Из участка стебля выше «точки слома» (без фиксации) с помощью лезвия вырезали тонкую полоску ткани и окрашивали её родамин-фалоидином в концентрации О.ЗЗмМ в течение 1-2 часов.
Для регистрации окрашивания использовали эпифлюорисцентный модуль микроскопа LSM-510 МЕТА (Carl Zeiss), фильтр для красителей DAPI и Cellufluor - FSET01 (365 нм), фильтр для родамин-фалоидина - FSET15 (546 нм)
Для определения длины волокна использовали чесаное волокно, полученное после завершения онтогенеза растений, выращенных во ВНИИЛ (г. Торжок) и растения льна различных генотипов из коллекции Всероссийского института растениеводства им Н.И. Вавилова, включавшие как долгунцы, так и межеумки, которые выращивали на полях Пушкинского филиала ВИР (Ленинградская обл.) на делянках площадью 1 м с густотой стояния, соответствовавшей производственным посевам, в 2004 и 2005 гг., различавшихся по погодным условиям. На стадии быстрого роста измеряли длину стебля от верхушки до «точки слома» (длина "вершка"). На стадии ранней желтой спелости были взяты отрезки стебля в соответствии с рисунком 32, представленном в разделе 3.6. Пучки волокон из верхней, средней и нижней частей чесаного волокна помещали на ночь в 1-2% Macerozyme. Затем из пучка волокон выделяли 150 индивидуальных волокон. Выделенные волокна раскладывали на предметном стекле, проверяли целостность клеток под световым микроскопом NU-2 (Zeiss) и измеряли их длину.
При выделении индивидуальных волокон из растений льна различных генотипов, отрезок стебля исследуемых генотипов помещали В 1-2%) Macerozyme на ночь. Сначала выделяли пучки волокон, а затем индивидуальные волокна и измеряли их длину по методике описанной выше. Проанализировали длину волокон в 25 образцах льна. Общее число выделенных волокон из одного образца - 150.
Отрезки стебля льна, вырезанные из участка стебля выше «точки слома», культивировали на среде Vi МС, которую готовили из стандартного порошка (Serva). Добавляли агар (0.8%) и сахарозу в различных концентрациях (5, 10, 20 мг/л); рН среды варьировал от 4.5 до 5.8. Среды автоклавировали, остужали и разливали в чашки Петри. Длина культивируемых отрезков стебля составляла от 2 до 6 см.
ЯМР В измерительную пробирку (0 1 см) наливали 2 мл воды и помещали срезанные стебли 10 растений. Для более плотной упаковки стеблей (с целью повышения интенсивности сигнала) удаляли все листья, за исключением тех, которые примыкают к растущей верхушке (верхний 1 см стебля). Измерения проводили выше и ниже «точки слома», сразу после приготовления образцов и через сутки. В ходе эксперимента растения не теряли тургор и за сутки вырастали на 1 см. Перемещением пробирки с растениями в сквозном канале приемопередающего контура датчика ЯМР установки выбиралась определенная зона измерения, шириной 10 мм.
ЯМР Исследования проводили на установке спинового эха на частоте 16 МГц с использованием техники импульсного градиента магнитного поля. Для измерений использовали импульсную последовательность стимулированного эха. Регистрировали зависимости относительной амплитуды эха A(g )/А(0) (фактор R) при постоянном времени диффузии (td) в зависимости от амплитуды импульсов градиента магнитного поля (g) при вариации их длительности (5) как параметра. Схема эксперимента была построена на регистрации диффузионных спадов только при одном предварительно оцененном времени диффузии td - 100 мсек. На графиках представлены результаты одного из трех экспериментов с повторяющимися закономерностями.
Полученные данные обработаны статистически, при изложении данных приведены средние значения и их стандартные отклонения. Анализ корреляционных связей между различными параметрами выполнен при помощи пакетов программ «Анализ данных» Excel ХР.
Выявление типа удлинения клетки в ходе интрузивного роста флоэмных волокон льна
Различают два способа удлинения индивидуальной клетки: апикальный рост (растяжение только кончика клетки) и диффузный рост (растяжение всей поверхности клетки). Ранее считалось, что волокна формируются путем длительного апикального роста, совмещенного с отложением вторичной клеточной стенки в срединной части клетки (Эсау, 1943 б) (Рис. 6 в). (а)
Продольные срезы верхней части стебля льна, а - общий вид продольного среза( 1,8 мм), б - начало интрузивного роста волокон. Стрелками на фото обозначены концы волокон, образующих характерные «колена». В результате проведенных недавно комплексных исследований пересмотрены представления о характере формирования этих клеток и обнаружено, что у первичных флоэмных волокон льна, как и у большинства других клеток, удлинение и формирование вторичной клеточной стенки разделены во времени (Gorshkova et al., 2003). Полученные результаты заставляют вернуться к вопросу о том, апикально или диффузно удлиняется волокно в ходе интрузивного роста.
Различия в механизмах концевого и диффузного роста проявляется при сопоставлении ультраструктуры кончика клетки и её средней части. У клеток, растущих всей поверхностью, ультраструктура цитоплазмы не имеет серьёзных отличий по всей длине клетки; у клеток, растущих апикально, можно выделить несколько зон, различающихся по структуре цитоплазмы (Yang, 1998). Структура апикально растущих клеток была детально изучена на таких примерах как корневые волоски и пыльцевые трубки (Tiwari, Wilkins, 1995; Ryser, 1999; Cheung et al., 2001; Malho, 2000 б). В самом кончике клетки формируется так называемая «чистая» зона (3-5 мкм), в которой отсутствуют какие-либо крупные субклеточные структуры, за исключением пузырьков аппарата Гольджи (рис. 3 и 14 а). За чистой зоной располагается «актиновая шапочка», где сконцентрированы элементы цитоскелета, а также многочисленные цистерны аппарата Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Считается, что «актиновая шапочка» ответственна за стабилизацию неустойчивого кончика, поэтому эти клетки очень чувствительны к агентам, разрушающим актин (Malho, 1998; Chen, 2002). Импульсное добавление низких концентраций агентов деполимеризующих актин (цитохалазин Д, оризалин) расширяет область роста клетки (Emons, 2003). Субапикальная зона отличается плотной цитоплазмой, обогащенной различными органеллами: митохондриями, эндоплазматическим ретикулумом, аппаратом Гольджи, пластидами. Цистерны эндоплазматического ретикулума располагаются большей частью параллельно длинной оси клетки, что, по-видимому, способствует направленному передвижению пузырьков Гольджи к его кончику.
Чуть ниже расположена зона вакуолизации. В этой зоне образуется участок сплошь занятый мелкими вакуолями. Непосредственно за зоной вакуолизации лежит обширная и довольно однородная по- структуре цитоплазмы срединная часть клетки, основной объём, которой, занят центральной вакуолью. (Атлас ультраструктуры растительных клеток, 1980).
В хлопковом волокне, которое является примером диффузного роста, не обнаружено зонального расположения органелл. Органеллы более или менее равномерно распределены по цитоплазме (Tiwari, Wilkins, 1995).
Известно, что у клеток с апикальным ростом микротрубочки организованны в тяжи, параллельные продольной оси клетки и отвечают за направление роста (Malho, 1998; Emons, 2000, Bibikova, 1999; Ketelaar, Emons, 2003). У клеток с диффузным ростом кортикальные микротрубочки ориентированны перпендикулярно или косо по отношению к оси роста клетки (Seagull, 1986).
Включение нового материала в клеточную стенку у апикально растущих клеток осуществляется только в самом кончике. Авторадиография хлопкового волокна (диффузный рост), культивированного на среде с Н-глюкозой, выявила равномерное включение метки по длине клетки слегка усиленное на концах (Ryser, 1977). На рисунке 14 представлено схематическое изображение клеток, растущих концевым и диффузным ростом.
В поиске аргументов о характере роста флоэмных волокон мы провели сопоставление ультраструктуры кончика и средней части клетки. Следует отметить, что идентификация кончика волокна достаточно сложна, по нескольким причинам. Во-первых, волокна - длинные клетки, что снижает частоту встречаемости кончиков клетки на продольном срезе. Во-вторых, наблюдается закрученность волокон в пучке. Поэтому увидеть целую клетку на поперечном срезе почти невозможно. Кроме того, существует опасность принять за кончик волокна косой срез через середину клетки.
Провели сопоставление ультраструктуры кончика флоэмного волокна и его срединной части. Анализ ультраструктуры флоэмного волокна льна позволил обнаружить, что в этих клетках не наблюдается зонального расположения органелл (рис. 15, 16). В кончике клетки нет «чистой» зоны, так как в этой области присутствуют органеллы - например, митохондрии (рис. 15 в, 16 в). Диктиосомы и эндоплазматический ретикулум равномерно распределены в цитоплазме волокна.
Микротрубочки, наблюдаемые нами в кончике волокна, имели поперечную ориентацию (рис. 17). Этот факт установлен также с использованием иммуномечения тубулина и анализа флуоресценции с помощью конфокального микроскопа (Ageeva et al., 2005). Таким образом, во флоэмном волокне микротрубочки расположены в кончике поперечно, т.е. так, как это характерно для клеток, растущих всей поверхностью.
Мы провели окрашивание актиновых филламентов волокон на стадии интрузивного роста флюоресцентным красителем родамин-фалодином. Окрашивание необходимо проводить на свежей ткани, поэтому у нас возник ряд трудностей с поиском кончика волокна. На рисунке 18 представлена серединная часть волокна, где актиновые филламенты расположены продольно.
Несмотря на то, что нам не удалось подтвердить или отвергнуть наличие «активной шапочки» в кончике растущего волокна, существуют косвенные данные об её отсутствии. Обнаружена митохондрия вблизи кончика волокна (рис. 15 в и 16 в). Существуют данные о продвижении хлоропласта и митохондрии в самом кончике флоэмного волокна (Ageeva et al., 2005).
Такое значительное количество ядер не имеет аналогов среди других типов клеток вегетативных органов растений. Его можно было бы объяснить необходимостью масштабной своевременной доставки транскриптов для обеспечения высокой скорости роста. Однако известны другие типы клеток (трихомы, растущие протрузивно), достигающие сходной дины, но имеющие одно ядро (Ryser, 1999). В наших исследованиях между длиной волокон и числом ядер обнаружена положительная корреляция (г=+0.6), означающая, что связь между длиной волокон и количеством в них ядер все-таки существует. Возможно, столь значительное количество ядер в индивидуальной клетке связано именно с интрузивным характером роста и необходимостью, например, интенсивного синтеза осмотически активных веществ для обеспечения повышенного тургорного давления в растущем волокне.
