Введение к работе
1. Актуальность темы.
В условиях современного ритма жизни потребление сахара неуклонно растет. Но каждый знает, что калорийность сахара достаточно велика, и если человек живет в условиях сниженных энергозатрат, то избыток калорий превращается в жир, в результате чего у большинства населения возникает угроза ожирения и сахарного диабета. При чрезмерных дозах употребления сахароза может привести к тяжелым нарушениям углеводного и жирового обмена, а также способствовать развитию различных заболеваний.
Натуральные заменители сахара такие, как фруктоза, ксилит и сорбит отличаются довольно высокой калорийностью, поэтому были синтезированы низкокалорийные искусственные подсластители, которые превосходят сахар по сладости, но никак не влияют на выброс инсулина и уровень сахара в крови. Однако искусственные подсластители имеют ряд недостатков, поэтому в настоящее время всё чаще возникает вопрос о пользе и безопасности этих соединений.
В связи с этим во многих странах проводят исследования по разработке технологии безопасного и эффективного низкокалорийного подсластителя, применение которого возможно для широкого ассортимента пищевых продуктов и разновозрастного круга населения.
D-тагатоза - полностью натуральный сахар, представляющий собой моносахарид, используемый как подсластитель. D-тагатоза фактически не отличается по вкусу от сахарозы, но с точки зрения более быстрого ощущения сладости подобна фруктозе. Её сладость составляет около 0,9 ед. от сладости сахарозы, принятой за 1,0. D-тагатоза имеет невысокую калорийность (1,5 ккал/г), в отличие от других заменителей сахарозы она лишена слабительного эффекта.
Для ферментативной конверсии D-галактозы в D-тагатозу используют фермент L-арабинозоизомераза, не обладающий выраженной субстратной специфичностью. В настоящее время в РФ производство D-тагатозы отсутствует, хотя в данном направлении проводятся исследования. Тем не менее, нарастает интерес к этому уникальному заменителю сахарозы во всех странах, в том числе и РФ. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ферментного
препарата L-арабинозоизомераза с целью получения D-тагатозы актуальна и
перспективна.
Настоящая работа посвящена разработке биотехнологии ферментного препарата
L-арабинозоизомераза для получения D-тагатозы.
Цель и задачи исследования.
Основная цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного продуцента L-арабинозоизомеразы, разработке технологии очищенного ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх для трансформации D-галактозы в D-тагатозу.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
скрининг микроорганизмов-продуцентов L-арабинозоизомеразы, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей L-арабинозоизомеразной активностью;
идентификация штамма-продуцента L-арабинозоизомеразы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
подбор наиболее эффективного состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;
разработка технологии получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза ПОх;
наработка ферментного препарата L-арабинозоизомеразы в опытно-промышленных условиях;
изучение основных параметров действия ферментного препарата L-
арабинозоизомераза ПОх и его апробация как катализатора при
биотрансформации D-галактозы в D-тагатозу.
Научная новизна работы. Проведен направленный скрининг микроорганизмов с L- арабинозоизомеразной
активностью, выделенных из различных видов почв.
В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент L-арабинозоизомеразы с максимальной активностью (25,30 ед.АиС/г). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических
и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий L-арабинозоизомеразу, идентифицирован как Bacillus mojavensis Х2.
На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом Bacillus mojavensis Х2 L-арабинозоизомеразной активности от условий культивирования, а также выхода фермента, от параметров дезинтеграции биомассы, выделения и его очистки, впервые в РФ научно-обоснована биотехнология ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮх для трансформации D-галактозы в D-тагатозу.
Практическая значимость и реализация результатов работы.
В результате скрининга почвенных изолятов бактерий, обладающих L-
арабинозоизомеразной активностью, создана лабораторная коллекция
микроорганизмов, синтезирующих внутриклеточную L-арабинозоизомеразу. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus mojavensis Х2 разработана биотехнология получения ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮх.
Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат L-арабинозоизомераза ГЮх. Проведена наработка препарата L-арабинозоизомераза ГЮх в условиях опытного производства. Выход препарата составил 6,8г/дм , активность ферментного препарата L-арабинозоизомераза ГЮХ -772 ед.АиС/г. Полученные результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».
Проведена апробация каталитического действия полученного препарата L-арабинозоизомераза ГЮХ в лабораторных условиях. В результате изомеризации D-галактозы под действием L-арабинозоизомераза ГЮх получена D-тагатоза с выходом 34,81%, что соответствует разработкам зарубежных ученых.
Апробация работы.
Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Общеуниверситетской научной конференции молодых ученых и специалистов (Москва, 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставки "Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты"; конференции молодых ученых "Инновационные технологии продуктов здорового питания" (Москва, 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудования для пищевой
промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009); Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Международном симпозиуме «Перспективные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, где отражены
