Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1 Микрофлора кишечника 7
1.1.1 Состав нормальной микрофлоры кишечника 7
1.1.2 Функция микрофлоры 9
1.1.3 Дисбактериоз 10
1.2. Функциональное питание как наиболее перспективное направление в профилактике дисбиотических состояний 14
1.3 Критерии выбора пробиотических культур для создания кисломолочных синбиотических продуктов 18
1.3.1. Требования к пробиотическим культурам 19
1.3.2. Пробиотические и технологические свойства штаммов молочнокислых бактерий и бифидобактерий 20
1.3.3. Устойчивость штаммов к антибактериальным препаратам 23
1.4 Пребиотическая составляющая синбиотических продуктов 27
1.4.1 Бифидогенное действие растворимых и нерастворимых пищевых волокон и актуальность их использования в функциональном питании 27
1.4.2 Дрожжевой экстракт как стимулятор роста бифидобактерий и компонент в функциональных продуктах питания 29
1.5 Перспективность разработки синбиотических продуктов 37
1.6 Заключение по обзору литературы. Цели и задачи исследований з8
2 Организация эксперимента, изучаемые объекты и методы исследований 41
2.1 Организация эксперимента 41
2.2 Объекты исследований 43
2.3 Материалы и питательные среды 44
2.4 Методы исследований 46
2.4.1 Физико- биохимические методы исследований 46
2.4.2 Микробиологические методы исследований 47
2.4.3 Статистическая обработка результатов 49
3 Разработка пробиотической составляющей синбиотических продуктов 50
3.1 Обоснование выбора бифидобактерий в качестве пробиотика для синбиотических продуктов 50
3.2 Изучение сочетаемости штаммов бифидобактерий и создание консорциума на их основе 50
3.3 Изучение антибиотикоустойчивости разработанного консорциума 56
4 Разработка технологии синбиотических продуктов 63
4.1 Обоснование выбора бифидогенных волокон для введения в состав синбиотических продуктов 63
4.1.1 Разработка рациональной концентрации и способа внесения Fibregum В и Equacia в состав синбиотика 64
4.1.2 Разработка рациональной концентрации и способа внесения в состав синбиотика дрожжевого экстракта 78
4.2 Описание технологического процесса производства синбиотических кисломолочных продуктов 82
4.3 Улучшение органолептических свойств продукта за счет введения в состав синбиотика термофильного стрептококка 86
4.4 Разработка технологии синбиотических продуктов учитывающих возрастную категорию пациента 88
5 Изучение показателей качества в процессе хранения синбиотических кисломолочных продуктов 90
Основные результаты и выводы 95
Библиографический список 96
Приложения 119
- Функциональное питание как наиболее перспективное направление в профилактике дисбиотических состояний
- Дрожжевой экстракт как стимулятор роста бифидобактерий и компонент в функциональных продуктах питания
- Изучение сочетаемости штаммов бифидобактерий и создание консорциума на их основе
- Разработка рациональной концентрации и способа внесения в состав синбиотика дрожжевого экстракта
Введение к работе
Полноценное и здоровое питание является одним из наиболее важных и необходимых условий для сохранения жизни и здоровья человека. Развитие рынка продуктов функционального питания главным образом обусловлено фиксируемой тенденцией ухудшения здоровья населения. Особенно велика роль продуктов функционального питания в поддержании микробной экологии человека, прежде всего микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
При микроэкологических нарушениях наблюдается уменьшение абсолютного числа бифидобактерий и увеличение общего количества патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и продуктов их метаболизма, что приводит к возникновению и обострению хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Известно также, что при дисбиотических состояниях снижается иммунитет организма, который тесным образом связан с функцией нормальной микрофлоры, рассматриваемой в настоящее время в качестве своеобразного органа иммунной системы. Именно поэтому так важно поддержание микроэкологического равновесия в желудочно-кишечном тракте. Применение синбиотиков (комплекс пробиотиков и пребиотиков) является наиболее эффективным путём нормализации дисбаланса кишечной микрофлоры, так как при этом не только имплантируются вводимые микроорганизмы, но и избирательно стимулируются рост и активация метаболизма индигенных лакто- и бифидобактерий.
Теоретические и практические основы в области создания функциональных продуктов питания заложены в трудах Гончаровой Г.С., Шендерова Б.А., Семенихиной В.Ф., Гавриловой Н.Б., Ганиной В.И., Евдокимова И.А., Забодаловой Л.А., Королевой Н.С., Рогова И.А., Рябцевой С.А., Титова Е.И., Тихомировой Н.А., Токаева Э.С., Бобреневой И.В., Хорольского В.В., Храмцова А.Г., Degeest В., Fuller R., Lee К., Shah N.P.,
6 Sanders M.E., Fuller R., Tannock G.W., Gibson G.R., Shin H.S., Arai S., Morinaga Y и др.
Значение продуктов функциональной направленности весьма велико для России, так как, согласно исследованиям, в последние годы отмечаются ухудшение экологической обстановки, увеличение стрессовых факторов и нарушения в структуре питания населения, что приводит к дисбалансу нормальной кишечной микрофлоры - дисбактериозу.
Таким образом, разработка технологии производства и расширение ассортимента синбиотических продуктов отечественного производства, которые могут быть рекомендованы для профилактики дисбиотических состояний, является обоснованной и актуальной.
Цель диссертационной работы - разработка технологии новых видов высокоэффективных комплексных синбиотических продуктов, содержащих высокий титр бифидобактерий и способствующих нормализации деятельности ЖКТ.
Функциональное питание как наиболее перспективное направление в профилактике дисбиотических состояний
Впервые на существенную роль нормальной микрофлоры кишечника в жизнедеятельности человека поддержании его здоровья указал в своих работах выдающийся русский учёный И.И. Мечников. Он считал, что молочнокислая диета способствует снижению количества патогенных микроорганизмов, называя молочнокислые продукты продуктами долголетия. И.И. Мечников впервые предложил поддерживать нормальную микрофлору кишечника на оптимальном уровне с помощью микробов и продуктов их жизнедеятельности. На протяжении ряда лет ведётся поиск оптимальных средств, направленных на профилактику возникновения дисбактериоза и увеличивающих сопротивляемость организма к неблагоприятным факторам внешней среды. С этой целью пытаются применять ферментированные с помощью бактерий кисломолочные продукты, которые в настоящее время являются важным компонентом питания людей.
Одним из достижений конца XX века явилась разработка концепции «пробиотики и функциональное питание», затрагивающей фундаментальные и прикладные аспекты здоровья человека, медицины и пищевой биотехнологии. Под этим понятием понимают такие препараты, биологически активные добавки к пище и продукты питания, которые обеспечивают организм не столько энергетическим и пластическим материалом, сколько контролируют и модулируют определенные физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции,
способствуют поддержаншо здоровья, снижают риск возникновения заболеваний и ускоряют процесс выздоровления [134].
В настоящее время наиболее прогрессивным направлением поддержания микробной экологии человека на оптимальном уровне является использование для этих целей микробных препаратов на основе представителей нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека [4]. Для направленного создания или восстановления нарушенного микробиоценоза человека используют разнообразные приемы: - инокуляция новорожденных определенными микроорганизмами или их комплексами; введение в больших количествах детям и взрослым антагонистических штаммов бактерий - представителей нормальной микрофлоры (бифидобактерий, лактобацилл и др.) в составе фармакопейных препаратов или продуктов питания специального назначения; - применение разнообразных по происхождению и химической природе субстанций, способствующих селективному размножению "дружественных" для человека анаэробных представителей нормальной микрофлоры (например, бифидогенных факторов); - добавление в пищу различных метаболитов анаэробной кишечной микрофлоры и т.д. В последние годы появились исследования, свидетельствующие об эффективности кисломолочных продуктов с пробиотиками при лечении воспалительных заболеваний кишечника, болезни Крона и неспецифического язвенного колита [173]. Назначение смеси с пробиотиками младенцам с функциональными нарушениями толстого кишечника в виде запора, способствует нормализации консистенции и частоты стула [191]. Исследованиями отечественных и зарубежных авторов показана высокая эффективность кисломолочных продуктов, обладающих про биотическим эффектом, при пищевой аллергии, непереносимости лактозы, воспалительных заболеваниях кишечника, дисбиозе кишечника, кшпечных инфекциях, хеликобактериозе. Итальянские ученые выявили у некоторых видов кисломолочных бактерий, использующихся при изготовлении кисломолочных продуктов, гипотензивное действие, заключающееся в синтезе веществ-ингибиторов АПФ (ангиотензин-превращающего фермента), что свидетельствует о возможности их применения при лечении артериальной гипертонии. В ряде исследований показана терапевтическая эффективность кисломолочных продуктов, содержащих пробиотики, у людей, болеющих респираторными инфекциями [161]. В двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании Н. Szajewska и J.Z. Mrukowicz с соавт. [199], был отмечен положительный лечебный эффект в виде снижения тяжести и длительности диарейного синдрома у детей с острой диареей при назначении функциональных пробиотических продуктов. М. Juntunen с соавт. [170] продемонстрировали профилактическую и терапевтическую эффективность смесей, содержащих штаммы бифидобактерий, у младенцев с ротовирусной инфекцией. Авторами отмечено, что комбинация нескольких пробиотиков в молочной смеси значительно повышает способность к адгезии нормальной флоры кишечника, а также стимулирует местный иммунитет. J.M. Saavedra с соавт. [192] изучали профилактические свойства смеси, обогащенной пробиотиком, у младенцев 5-12 месяцев жизни, находящихся в условиях стационара в двойном плацебо-контролируемом исследовании. Результаты работы показали, что 39 % младенцев, вскармливаемых обычной смесью, за период госпитализации (17 дней) перенесли ротовирусную инфекцию, тогда как в группе детей, получавших обогащенную смесь пробиотиком, болели только 10 %. Получены данные, свидетельствующие об эффективности применения кисломолочных продуктов, обогащенных лакто- и бифидобактериями при лечении гастритов, ассоциированных с инфекцией Helicobacter pylori. Так, А. Armuzzi и F. Gremonini с соавт. [140] показали, что назначение про- и пребиотиков в комплексе с эрадикационной антибактериальной терапией гастритов, ассоциированных с инфекцией Helicobacter pylori, в течение 2 недель позволяет значительно снизить побочные эффекты антибактериальной терапии в виде диареи и тошноты. Сейчас во всем мире происходит постепенное, но все более уверенное движение современного человека к увеличению использования для поддержания своего здоровья про- и пребиотиков и продуктов функционального питания [79]. Переход от концепции адекватного питания к концепции оптимального питания обусловлен рядом объективных причин. Прежде всего, этот переход связан с увеличением стоимости лечения заболеваний традиционными фармацевтическими средствами. Стоимость затрат на здравоохранение в развитых странах Северной Америки и Европы каждые 10 лет увеличивается на 1 %. У многих жителей во всех возрастных группах, проживающих в развитых странах, отмечается все возрастающее желание улучшить качество своей жизни и максимально возможно продлить её. Это вынуждает их заботиться о своем здоровье и внедрять в свой пищевой рацион здоровое питание. В Западной Европе к началу 21 века 15 % всех жителей имели возраст старше 65 лет. Через 30 лет по данным демографов процент таких людей достигнет 20-25. В США в настоящее время до 40 % населения при лечении и профилактике острых и хронических заболеваний вместо традиционных лекарственных препаратов используют те или иные продукты функционального питания [85].
Рынок «здоровой пищи» в США ныне оценивается в 25 млрд. дол. с ежегодным 20 %-м приростом. В Западной Европе стоимость схожих продуктов питания достигает 10-12 млрд. дол. США. Если 15-20 лет назад ни одна из 250 самых крупных фармацевтических фирм не занималась продуктами функционального питания, то в 1993 году 2/3 из них имели отделы подобного направления [9]. Производство функциональных пищевых продуктов в России все еще находится в начальной стадии. Последние исследования экспертов компании Euromonitor International подтверждают увеличение продаж функциональных продуктов в России. По их же данным, на рынке «здоровых продуктов» наиболее динамично развиваются сектора молочной (65 %) и масложировой продукции. Среди молочных продуктов наибольшим спросом пользуются кисломолочные продукты с пробиотическими культурами (йогурты, простокваша, кефир) [32, 85,103].
Дрожжевой экстракт как стимулятор роста бифидобактерий и компонент в функциональных продуктах питания
Специалисты в области здорового питания в настоящее время утверждают, что повышенное количество диетического волокна до 25-35 г/день составляет важную часть здоровой пищи [22]. Некоторые диетические волокна влияют на пищеварительные процессы и, соответственно, на метаболическую реакцию организма. К этой категории можно отнести такие диетические волокна, которые поддерживают баланс экосистемы, селективно стимулируя рост и/или активность полезной микрофлоры кишечника.
Диетическое волокно препарата Fibregum обладает такими свойствами и является многофункциональным пищевым волокном, поэтому может использоваться в разных отраслях пищевой промышленности в качестве лечебной добавки [39].
Препарат Fibregum содержит волокно акации, т.е. экссудат, выделенный из деревьев акации (Leguminosae), преимущественно из видов, принадлежащих к группам Fabales и Gummiferae. С химической точки зрения препарат Fibregum является достаточно однородным по составу полисахаридом в соединении с более разнородными гликопротеинами. Полисахаридная фракция состоит главным образом из очень разветвленного арабино-галактана. Глюкуроновая кислота и элементы рамнозы могут быть обнаружены в окончании цепи".
Экстенсивная ферментация волокна акации увеличивает количество бактерий, присутствующих в слепой кишке и в фекальных массах. В человеческом организме при приеме волокна акации (10 г в сутки в течение 10 суток) может увеличиваться количество бактерий рода бактероидов, бифидобактерий и лактобацилл. Доказано, что при применении Fibregum количество бактерий фекальной флоры может увеличиваться от 6,5 до 50 %.
Как известно, диетическое волокно не переваривается в тонком кишечнике и поэтому не является источником метаболизируемой энергии [18]. Тем не менее, некоторые типы диетических волокон ферментируются бактериями, находящимися в толстом кишечнике, что ведет к синтезу короткоцепочечных жирных кислот, которые метаболизируются клетками эпителия стенок кишечника и печенью. Следовательно, калорийность диетического волокна не равна нулю. Кроме того, присутствие диетического волокна в продуктах может сократить адсорбцию других калорийных веществ, таких как жиры и углеводы. Вот почему никогда невозможно определить точную энергетическую ценность диетического волокна.
Энергетическая ценность волокна акации оценена на основе измерения колеблющейся кривой роста крыс, которых кормили различными количествами волокна акации. До тех пор, пока вводимое количество волокна акации не превышало 30 % от общего рациона, энергетическая ценность волокна акации не превышала нулевого значения. Тем не менее, рекомендуется рассматривать его энергетическую ценность как 2 ккал/г.
Fibregum натурален и хорошо сочетается с пищевыми продуктами органического происхождения. Благодаря низкой калорийности, он прекрасно подходит для замены сахарозы в рецептурах с низким содержанием сахара и без такового (основной компонент). Введение Fibregum стимулирует развитие благотворных кишечных бактерий, способствует выработке кишечной микрофлорой большого количества короткоцепочечных жирных кислот, которые, как известно, играют положительную роль в физиологии организма. Отсутствие вкуса и низкая вязкость позволяют вносить достаточно большие количества Fibregum без нарушения органолептических свойств готового продукта. Одна из основных областей применения Fibregum - молочные продукты (подкисленные молочные десерты, молочные напитки, плавленый сыр, желировашюе молоко).
Анализ литературных данных [8, 42, 43, 46] позволяет сделать заключение о целесообразности совместного применения пищевых волокон с пробиотическими культурами при производстве синбиотиков.
Применение дрожжей в пищу людей известно с начала нашего века. Проведенные исследования показали, что белки растительного и лшвотного происхождения можно с успехом заменить дрожжевыми белками. В области питания людей дрожжи описаны как «ценный источник белка и большой резервуар комплекса витаминов группы В» [12].
Дрожжи усваиваются организмом человека на 85-88 %, занимая по этому показателю промежуточное положение между белками растительного и животного происхождения [7]. В настоящее время внимание ученых привлекли новые источники получения белка из микроорганизмов, которые способны в процессе культивирования накапливать от 30 до 80 % белка [94].
Разработка процессов промышленного производства белка, полученного с помощью дрожжевых организмов, имеет большое практическое значение, так как дрожжевая биомасса является одним из наиболее психологически приемлемых для питания и биологически ценных продуктов микробиологического синтеза. Дрожжевая биомасса может быть получена на отходах сельского хозяйства, гидролизатах древесины, её выход не зависит от климатических и погодных условий. Поэтому её использование чрезвычайно выгодно для обогащения белками пищи человека[7]. При этом отмечается ее использование как высокобелкового продукта или как функциональной добавки в различных рационах [184].
Изучение сочетаемости штаммов бифидобактерий и создание консорциума на их основе
На современном этапе развития пищевой биотехнологии актуальным является развитие научных подходов к созданию продуктов здорового, рационального питания. Учёные полагают, что в 21 веке все больший сегмент на рынке продовольственных товаров будут занимать синбиотические продукты питания, действие которых, прежде всего, направлено на профилактику и предупреждение развития многих, в том числе хронических заболеваний, а, следовательно, на оздоровление населения [48]. Серьезной основой для развития данного направления в нашей стране и за рубежом следует считать интенсивность научных исследований в области физиологии, биохимии, геномики, протеомики, метаболомики, биотехнологии и других фундаментальных наук, вызванных требованиями создания эффективных и безопасных пищевых продуктов.
Кризисная ситуация, сложившаяся в нашей стране в обеспечении населения микронутриентами, послужила стимулом комплексного использования молочных ресурсов и растительных компонентов для создания продуктов функционального питания. Для повышения биологической ценности и лечебно-профилактического действия продуктов всё шире применяют молочнокислые пробиотические микроорганизмы. Особое значение в этой связи уделяется технологическим и неизвестным ранее физиологическим свойствам молочнокислых микроорганизмов, содержащихся в продуктах, потребление которых способствует укреплению здоровья и снижению риска развития многих заболеваний.
В настоящее время на основании результатов многочисленных клинических и лабораторных исследований достоверно установлена положительная роль пробиотических микроорганизмов и пребиотических веществ в жизнедеятельности макроорганизма, что и послужило наиболее важным основанием разработки научных принципов создания синбиотиков [57,63,81,91,92]. 1.6 Заключение по обзору литературы. Цели и задачи исследований
Производство ПФП является актуальной задачей для современной пищевой промышленности. О популярности продуктов здорового питания в европейских странах, США, Японии свидетельствует статистика качественных изменений продовольственного рынка. По имеющимся в литературе данным можно заключить, что как в зарубежных странах, так и у нас в стране постоянно возрастает доля реализации на потребительском рынке продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами. Продукты направленные на коррекцию микрофлоры желудочно-кишечного тракта, играют важную роль в питании людей, так как подержание стабильности микробных ассоциаций в кишечнике имеет чрезвычайно большое значение для жизнедеятельности человека и является одним из показателей его здоровья.
Интерес к бифидобактериям как наиболее типичным представителям группы пробиотиков объясняется не только тем, что они являются полезными для человека, но и тем, что метаболиты этих микроорганизмов, также обладают позитивными свойствами. При создании продуктов с пробиотиками одной из важнейших задач является подбор штаммов, соответствующих физиологическим и технологическим задачам и выполняющих свои функции в организме человека. С учетом того, что бифидосодержащие продукты играют важную роль в жизнедеятельности человека, необходимо целенаправленно подходить к их разработке и производству.
В целом, результаты клинических исследований большого количества авторов позволяют рекомендовать пищевые волокна для включения в пищевые рационы для профилактики различных заболеваний ЖКТ. Исследования, направленные на изучение бифидогенных свойств некоторых пищевых волокон «in vitro», в частности гуммиарабика и композиции гуммиарабика и нерастворимых пищевых волокон, не обнаружены в доступных литературных источниках. В связи с этим, считаем что исследование в данном направлении является актуальным.
В настоящее время на основании результатов многочисленных клинических и лабораторных исследований достоверно установлена положительная роль пробиотических микроорганизмов и пребиотических веществ в жизнедеятельности макроорганизма, что и послужило наиболее важным основанием разработки научных принципов создания синбиотиков.
На основании вышеизложенного, целью диссертационной работы являлась разработка технологии новых видов высокоэффективных комплексных синбиотических продуктов, содержащих высокий титр бифидобактерий и способствующих нормализации деятельности ЖКТ. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: обосновать состав синбиотических продуктов на основе литературных данных и проведенных исследований; - исследовать взаимодействие штаммов разных видов бифидобактерий и создать консорциум на их основе; - исследовать влияние растворимых и нерастворимых пищевых волокон, дрожжевого экстракта, на развитие и активность бифидобактерий в молоке и отработать состав и технологию получения синбиотических кисломолочных продуктов.
Разработка рациональной концентрации и способа внесения в состав синбиотика дрожжевого экстракта
Немаловажное значение при подборе культур микроорганизмов для про- и синбиотических продуктов и препаратов придается такому свойству, как устойчивость к антибиотикам. Из литературы известно [23, 24, 25], что совместное применение антибиотиков и антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.
В связи с вышеуказанным, возникла необходимость создания антибиотикоустойчивых бактерийных препаратов, использование которых совместно с антибиотиками позволило бы исключить возможность развития дисбактериозов и сократить сроки лечения больных за счет быстрой и эффективной нормализации микрофлоры ЖКТ [17,19].
Именно поэтому при разработке консорциума для синбиотического продукта являлось важным изучение таких его свойств, как антибиотикоустойчивость или, другими словами, чувствительность пробиотических микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП). Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные. Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП - величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК). Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК. Одной из основных модификаций диффузионного метода является диско-диффузионный метод. В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Каждый штамм, входящий в консорциум, в отдельности уже изучался на устойчивость к различным антибиотикам, нашей же задачей являлось сравнение антибиотикоустойчивости отдельных штаммов и. разработанного консорциума. Для решения данной задачи наиболее оптимальным и удобным являлся диско-диффузионный метод. Данный метод включает в себя несколько этапов: - приготовление и розлив по чашкам Петри питательнаой среды; - приготовление бактериальной суспензии и инокуляция; - аппликация дисков и инкубация; - учет результатов. Все этапы определения чувствительности пробиотических микроорганизмов к различным антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом выполнялись в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04.
В качестве питательной среды для бифидобактерий использовалась среда Миллера-Хильтона. Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой готовилось в соответствии с инструкцией изготовителя. Важным моментом при определении чувствительности ДДМ является толщина слоя агара в чашке. Она должна составлять (4,0±0,5) мм, это достигается внесением в чашку Петри диаметром 90 мм строго 20 мл агара. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливались на строго горизонтальную поверхность. Соблюдение указанных предосторожностей необходимо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.
Следующим этапом в проведении исследования является приготовление бактериальной суспензии и инокуляция. Стандартный инокулюм наносился пипеткой на поверхность чашки Петри с питательной средой в объеме 1 мл и равномерно распределялся по поверхности с помощью шпателя.
Затем, после инокуляции, на поверхность питательной среды наносились диски с АБП (см. рис. 3). Аппликация дисков проводилась с помощью стерильного пинцета. Для определения чувствительности ДДМ использовались стандартизированные коммерческие диски.
Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри кверху дном помещались в анаэростат (см рис. 4), с целью создания анаэробных условий. Анаэростат, в свою очередь помещался в термостат, где и проходила инкубация при температуре 37 С в течение 3 суток.
После окончания инкубации чашки помещались кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под утлом в 45 (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измерялся штангенциркулем с точностью до 1 мм (см. рис. 5). Результаты проведённого исследования представлены в табл. 12.
