Содержание к диссертации
Введение
1.Аналитический обзор 10
1.1. Влияние бактериофагов на качество и безопасность кисломолочных продуктов и сыров 10
1.2. Источники бактериофагов 12
1.3. Современные аспекты классификации бактериофагов 14
1.4. Действие фагов на бактериальную клетку 19
1.5. Основные направления борьбы с бактериофагом 24
1.6. Существующие методы выявления фагов 30
1.7. Заключение 33
2. Организация эксперимента, изучаемые объекты и методы исследований 36
2.1. Организация эксперимента 36
2.2. Объекты исследований 36
2.3. Материалы и питательные среды 38
2.4. Методы исследований
2.4.1. Биохимические методы исследований 39
2.4.2. Микробиологические методы исследований 39
2.4.3. Спектрофотометрические методы исследований 42
2.4.4. Генетические методы исследований 42
2.4.5. Математические методы 44
Экспериментальная часть 45
3. Экспериментальное обоснование рациональных параметров метода индикации бактериофагов, лизирующих молочнокислые бактерии разных таксонов 45
3.1. Изучение влияния подготовки проб на выявление бактериофагов
3.2. Обоснование выбора стандартизованных жидких и плотных питательных сред для выявления бактериофагов молочнокислых бактерий 56
3.2.1. Подбор жидких стандартизованных питательных сред 56
3.2.2. Определение возможности выявления бактериофагов на разных плотных стандартизованных питательных средах 63
3.3. Этапы метода индикации бактериофагов, лизирующих разные виды молочнокислых бактерий 65
4. Применение разработанного метода для выделения и изучения бактериофагов, лизирующих молочнокислые бактерии 71
4.1. Выделение бактериофагов молочнокислых бактерий из промышленных проб молочных продуктов 71
4.2. Идентификация бактериофагов с помощью ДНК фингерпринта 75
4.3. Изучение свойств бактериофагов 80
4.3.1. Спектр литического действия бактериофагов 80
4.3.2. Изучение термоустойчивости бактериофагов 82
5. Проверка метода индикации бактериофагов в лабораторных и промышленных условиях. разработка мероприятий по профилактике бактериофагии 84
5.1. Проверка разработанного метода в лабораторных и промышленных условиях для выявления бактериофагов из промышленных объектов 84
5.2. Изучение действия на бактериофаги различных факторов и разработка мероприятий по профилактике бактериофагии 93
5.2.1. Изучение действия на бактериофаги различных уровней рН 93
5.2.2. Изучение действия дезинфицирующих средств на бактериофаги, лизирующие лактококки, термофильные стрептококки и молочнокислые палочки
5.2.3. Изучение действия ультрафиолетового излучения на
бактериофаги 98
5.2.4. Изучение возможности создания антифаговой питательной среды 99
5.3. Разработка этапов мониторинга бактериофагов, лизирующих разныевиды молочнокислых бактерий 104
Выводы 109
Библиографический список
- Источники бактериофагов
- Методы исследований
- Обоснование выбора стандартизованных жидких и плотных питательных сред для выявления бактериофагов молочнокислых бактерий
- Изучение действия на бактериофаги различных факторов и разработка мероприятий по профилактике бактериофагии
Введение к работе
Актуальность работы
Развитие рыночных отношений в нашей стране, перспективы вступления во Всемирную торговую организацию все более настойчиво ставят вопросы повышения качества и конкурентоспособности продукции, в особенности продукции пищевой промышленности В связи со сложной экологической обстановкой в настоящее время получение качественного продукта представляет собой достаточно непростую задачу Состав микрофлоры, участвующей в биотехнологическом цикле, играет важную роль в получении ферментированных молочных продуктов с требуемыми показателями качества и безопасности В результате развития полезной микрофлоры в молочном сырье происходит ряд биохимических реакций, при которых формируются органолептические, физико-химические и микробиологические показатели готовых продуктов Направленность биотехнологических процессов в производстве молочных продуктов во многом определяется активностью развития стартовых культур в применяемом сырье
Одной из важнейших причин снижения активности молочнокислого процесса является поражение микрофлоры заквасок бактериофагами Попадание бактериофагов в сырье возможно на любой стадии производства, что приводит к торможению или полному прекращению процесса ферментации молочного сырья, нарушению консистенции, потере аромата, возникновению порока позднее вспучивание сыров или ухудшению других показателей качества Нарушение молочнокислого процесса при получении ферментируемых продуктов приводит к материальным потерям, а также увеличению возможности возникновения пищевых инфекций за счет развития остаточной микрофлоры и микрофлоры вторичного обсеменения, в том числе условно-патогенных микроорганизмов и их токсинов
Теоретические и практические основы в изучении явления бактериофагии в молочной промышленности заложены в трудах В 3 Ахвердяна, Л А Банниковой, В И Ганиной, А В Гудкова, Н С Королевой, Н Ф Кувалдиной, Л Г Мытник, Г Д Перфильева, В Ф Семенихиной, Д А Яковлева, Н Ackermann, V Braun, A Coffey, С Hill, A Jarvis, Т R Klaenhammer, Р Laux, S Moineau, H Neve, В Terzaghi, M Teuber, D Tremblay и др Изучением явления бактериофагии ученые занимаются несколько десятилетий, тем не менее, существует ряд нерешенных проблем
Важнейшим этапом предотвращения фаголизиса на предприятиях является оценка фаговой ситуации путем проведения мониторинга бактериофагов Однако на отечественных молочных предприятиях практически не проводится фаговый мониторинг, который позволял бы систематически устанавливать наиболее опасные критические контрольные точки и вовремя разрабатывать и осуществлять профилактические мероприятия Такое положение в нашей стране связано с несовершенством методов по выявлению бактериофагов Это обусловлено применением мезофильных молочнокислых бактерий тест-культур, ограниченного числа питательных сред и низкой чувствительностью методов Существующие методы, которые применяются в
настоящее время на предприятиях, позволяют выявлять бактериофаги, лизирующие лактококки В то время как на предприятиях молочной промышленности с резким увеличением ассортимента выпускаемых продуктов, по-видимому, расширился спектр фагов, которые способны инактивировать молочнокислые бактерии разных таксономических групп
В этой связи актуальным и целесообразным является разработка метода индикации и выделения бактериофагов, способствующего установлению критических контрольных точек на всех этапах биотехнологического процесса, снижению риска обострения инфекции бактериофагами в условиях предприятий молочной промышленности и осуществлению фундаментальных исследований
Цель и задачи исследований
Целью настоящей диссертационной работы являлось разработка метода индикации бактериофагов, способных лизировать различные виды молочнокислых бактерий, а также позволяющего выделять чистые бактериофаги для использования при отборе фагоустойчивых стартовых культур и усовершенствовать мероприятия по профилактике явления бактериофагии
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
- подобрать режимы подготовки проб для выявления бактериофагов,
обосновать выбор жидких и плотных стандартизованных питательных сред для выявления бактериофагов молочнокислых бактерий разных видов,
разработать метод индикации бактериофагов и осуществить его проверку в лабораторных и производственных условиях,
- исследовать современное состояние фагового фона на предприятиях,
вырабатывающих ферментируемые молочные продукты,
разработать мероприятия по профилактике бактериофагии и этапы мониторинга бактериофагов на предприятии,
разработать Инструкцию по проведению мобильного мониторинга бактериофагов и контролю стартовых культур на предприятиях молочной промышленности
Научная новизна
Обоснованы рациональные режимы подготовки проб, позволяющие выявлять наличие бактериофагов в молочном сырье, продуктах, смывах с оборудования Экспериментально установлены сочетания жидких и плотных стандартизованных питательных сред для выявления бактериофагов, лизирующих разные таксоны молочнокислых бактерий
На основании изучения спектра литического действия выявлены чувствительные тест-культуры для обнаружения бактериофагов, лизирующих термофильные молочнокислые стрептококки и палочки
Проведено изучение свойств и идентификация вновь выделенных бактериофагов с применением полимеразной цепной реакции, что позволило осуществить их депонирование в ФГУП ГосНИИ генетики и селекции
промышленных микроорганизмов под номером Ph-1622, Ph-1623, Ph-1624, Ph-1625
С применением разработанного метода впервые установлено, что на предприятиях молочной промышленности присутствуют бактериофаги, лизирующие не только лактококки, но и термофильные стрептококки и молочнокислые палочки
Получены новые данные о влиянии различных веществ на адсорбцию бактериофагов на клетки молочнокислых бактерий Научно и экспериментально обоснован состав антифаговой питательной среды, способствующей подавлению действия бактериофагов
Практическая ценность
Разработан метод индикации бактериофагов, лизирующих различные виды молочнокислых бактерий, проведена его проверка в лабораторных и производственных условиях, показана эффективность применения разработанного метода для выявления бактериофагов, лизирующих молочнокислые бактерии разных таксонов Разработаны этапы мониторинга бактериофагов и стартовых культур на предприятиях молочной промышленности
Выделенные бактериофаги используются при исследовании фагочувствительности производственных штаммов, заквасок
Разработана и утверждена Инструкция по проведению мобильного мониторинга бактериофагов и контролю стартовых культур
На способ получения антифаговой питательной среды подана заявка на патент за № 2006141278 от 22 12 2006
Полученные результаты используются в учебном процессе при проведении лабораторных работ, выполнении научных дипломных работ и на факультете повышения квалификации специалистов молочной промышленности Разработаны и изданы методические указания к выполнению лабораторных работ для магистров техники и технологий по направлению 260100 - Технология продуктов питания и студентов специальности 260303 -Технология молока и молочных продуктов
Диссертационная работа выполнялась по теме №2-8-03 «Разработка механизма мобильного мониторинга бактериофагов и стартовых культур в биотехнологических процессах молочных продуктов», осуществляемой в рамках приоритетных направлений развития науки, технологий и техники Российской Федерации «Живые системы»
Апробация работы
Результаты научной работы доложены и обсуждены на студенческой конференции технологического факультета МГУПБ (2004 г), на IV и V Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (2005, 2006 гг) В 2004 г работа была отмечена грантом по конкурсу ассоциации «Университетский
комплекс прикладной биотехнологии» (2004 г) Работа была отмечена дипломом на V Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, ВВЦ, 29 июня - 3 июля 2005 г), а также дипломом и медалью на Международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (12-16 марта 2007 г)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, приложений Работа изложена на НО страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 24 рисунка Библиография представлена 155 источниками, в том числе 88 зарубежных авторов, количество приложений 9
Источники бактериофагов
Бактериофаги широко распространены в природе и встречаются в почве, водоемах, молоке, молочных продуктах, сточных водах, содержимом кишечника и др. Там, где присутствуют бактерии, там и присутствуют гомологичные к ним бактериофаги. Поражение бактериофагом может происходить на любой стадии производства. Первичное загрязнение молока происходит обычно на фермах. Следствием контактных инфекций при недостаточной гигиене может стать круговорт (ферма - транспортировочная цистерна - молочный завод). Другими источниками загрязнения являются воздух, зараженная фагами вода, а также недостаточно вымытые и продезинфицированные емкости и другие виды оборудования [15, 16, 17, 32, 34,35,103].
Источники фагов на заводах делят на прямые и косвенные. Основным прямым источником фагов являются сырые и сухие молоко и сливки, а также сыворотка. В сыром молоке некоторые фаги размножаются гораздо быстрее, чем в том же молоке после пастеризации. Сырое молоко может загрязнять фагами окружающую среду, из которой фаги попадают на оборудование.
Количество фагов в сырых и сухих молоке и сливках тем выше, чем сильнее оно загрязнено микроорганизмами, а также весной и летом [38]. При транспортировке непастеризованной сыворотки фагами заражаются молокоцистерны и фляги, а через них и сырое молоко. При анализе фагоустойчивости культур лактококков по сезонам года выявлено, что индекс фагоустойчивости значительно колеблется [40, 41]. Наиболее благоприятным для фагов сезоном является весна, когда отмечается повышение фагочувствительности культур, что обусловлено менее богатым составом молока, в частности, витаминами, макро- и микроэлементами [7].
Применение непастеризованной сыворотки для силосования кормов повышает содержание фагов в силосе и сыром молоке. Увеличение количества фагов в молоке может быть связано с расположением молокоприемных пунктов, например, молоко, получаемое на фермах, расположенных с подветренной стороны скотных дворов, в большей степени обсеменяется микроорганизмами и бактериофагами.
К прямым источникам фагов относят сухие и жидкие закваски, бактериальные концентраты, поскольку они всегда содержат лизогенные культуры.
К косвенным источникам относят воздух, пыль, воду, персонал, с которыми фаги могут попадать на заводы. Фаги могут развиваться в плохо вымытых и продезинфицированных молокопроводах, оборудовании, инвентаре, в остатках молока на полу, особенно при наличии в нем выбоин, трещин, на стенах, т. е. везде, где размножаются хозяева фагов.
Особенно опасно попадание фагов в молоко для приготовления производственной закваски, так как при этом создаются идеальные условия для репродукции фагов, а размножившиеся в закваске фаги вместе с закваской сразу попадают в емкость с пастеризованным молочным сырьем.
В зарубежной и отечественной литературе имеются сведения по исследованию фаговой ситуации на молочных и сыродельных заводах [12, 33, 58, 63, 65, 97, 108, 109, 126, 130, 131]. В данных работах установлено, что наиболее опасными источниками распространения фагов на сыродельных заводах являются производственная закваска и подсырная сыворотка. Бактериофаги обнаружены в сыром и пастеризованном молоке, закваске, смывах с пола, оборудования, сыворотке, воздухе цехов. Анализ литературных данных о результатах фагового мониторинга молока, подвергнутого тепловой обработке свидетельствует о том, что наличие фагов в термизированном и пастеризованном молоке связано как с терморезистентностью ряда фагов, так и с повторным загрязнением из производственной среды. Систематическое и квалифицированное проведение фагового мониторинга и контроль стартовых культур, жесткий контроль производства в критических контрольных точках - необходимые условия стабильного производства продукции, безопасной для потребителей.
Поскольку заквасочную микрофлору относят к одному из важнейших прямых источников бактериофагов, то следует постоянно осуществлять работу по подбору штаммов с высоким индексом фагоустойчивости, а для этого необходимо выделять, идентифицировать и изучать свойства бактериофагов, циркулирующих на предприятиях.
Методы исследований
Для приготовления стерильного обезжиренного молока сухое обезжиренное молоко смешивали при 45 С с водой в соотношении 100 г сухого молока на 1 дм воды. Затем выдерживали молоко 30-60 мин для набухания белков, фильтровали и стерилизовали при давлении 0,1 МПа в течение 15 мин при температуре 121 С.
Для приготовления гидролизованного молока стерильное обезжиренное молоко охлаждали до 45 С, устанавливали рН 7,6-7,8. Затем к 1 дм молока добавляли 0,5-1,0 г порошка панкреатина и 5 см хлороформа. Колбу закрывали корковой пробкой и выдерживали в течение 48-72 ч при температуре 42-45 С. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивали, приоткрывали пробку, чтобы пары хлороформа вышли. После выдержки колбу вынимали из термостата, гидролизованное молоко фильтровали через двойной бумажный фильтр, разводили водой в 2 раза, устанавливали рН 7,0-7,2 и стерилизовали при 121 С в течение 15 мин. В работе использовали разбавленное гидролизованное молоко и агар с гидролизованным молоком (к разбавленному гидролизованному молоку, добавляли 1,5-2,0% агара, стерилизовали при 121 С 15 мин).
Для культивирования молочнокислых бактерий и их количественного учета использовали питательные среды: среду для определения термофильных стрептококков (Ml7), среду для определения лактобактерий MRS, среду для определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), среду для культивирования бифидобактерий (ГМК-2), тиогликолевую среду для контроля стерильности, приготовленные в соответствии с инструкциями по их приготовлению. Физиологический раствор готовили по ГОСТ 10444.11. Для проверки на стерильность питательные среды выборочно помещали в термостат t=(37±l) С выдерживали до 3-х суток. Стерильность определяли по микроскопии препарата или по образованию помутнения среды при выдержке ее в течение трех суток при (37±1) С.
Определение титруемой кислотности проводили методом титрования по ГОСТ 3624-92, ГОСТ 13264-88. Определение активной кислотности- рН проводили потенциометрическим методом по ГОСТ 19881 с использованием рН-метра марки рН-150.
При проведении исследований применяли стандартные микробиологические методы. Контроль штаммов на чистоту проводили микроскопированием. Микроскопирование препаратов осуществляли в соответствии с ГОСТ 9225-84 и Инструкцией по микробиологическому контролю на предприятиях молочной промышленности. Отбор проб и подготовка к анализу осуществляли по ГОСТ 9225. Для получения бактериальных культур в логарифмической фазе роста Q вносили 1 см исследуемой «ночной» культуры (КОЕ=10), закваски, бактериального концентрата в стерильные жидкие питательные среды (100 см3), колбы термостатировали при температуре, зависящей от видового состава: лактококки - (28±1) С, термофильные стрептококки - (37±1) С, молочнокислые термофильные палочки- (37±1) С. Наступление собственно логарифмической фазы роста культур определяли по наличию в пробирках с культурой увеличения оптической плотности по сравнению с исходным материалом. Для количественного учета молочнокислых бактерий (ГОСТ 30705-2000) готовили ряд десятикратных разведений, для посева отбирали не менее трех последовательных разведений (ГОСТ 9225-84).
Для выявления наличия бактериофагов в исследуемых образцах применяли метод поверхностного посева (ГОСТ 26670-85) на чашки Петри, который заключается в следующем: на чашки Петри с подсушенной средой наносили 0,1 см индикаторной тест-культуры в фазе логарифмического роста, растирали на поверхности шпателем Дригальского и оставляли на 10-15 мин для впитывания влаги в агар. Затем на чашку наносили каплю образца, закрывали крышкой и оставляли на 10-15 мин при комнатной температуре. После чего чашки переворачивали и термостатировали в течение 16-18 ч при температуре (28±1)С при выявлении бактериофагов лактококков и при (37±1) С при выявлении бактериофагов, лизирующих термофильные молочнокислые стрептококки и термофильные палочки. Если после указанного времени термостатирования наблюдали зону угнетения роста в месте нанесения исследуемого образца, то устанавливали перевиваемость литического агента.
Для этого в пробирку с 3 см3 стерильного физиологического раствора помещали кусочек агара, взятый из зоны лизиса, добавляли 0,3 см хлороформа, тщательно взбалтывали и оставляли на 24 ч при температуре (4±2)С для более полного выхода частиц фага из агара. Затем каплю суспензии из пробирки наносили на свежеприготовленный газон индикаторной культуры и термостатировали 16-18 ч. В случае появления негативной (прозрачной) зоны вновь, считали, что угнетение роста культуры вызвано действием бактериофага.
Для количественного учета бактериофагов использовали метод определения титра фага (двухслойный метод). Для определения титра фага 3 см полужидкой среды (0,75 %), 1 см тест-культуры в фазе логарифмического роста, 1 см разведения фага перемешивали при 42 С. Затем выливали на чашку Петри с подсушенной плотной питательной средой (1,5 %). Термостатировали в течение 16-18 ч при температуре (28±1) С при выявлении бактериофагов лактококков и при (37±1)С при выявлении бактериофагов, лизирующих термофильные молочнокислые стрептококки и палочки. На следующий день по числу негативных колоний с учетом разведений определяли титр фага.
Для накопления бактериофагов в 10 см стерильного гидролизованного молока (разведенного водой 1:1, рН 6,8-7,0), либо среды Ml7 вносили 1-2 петли чувствительной культуры (КОЕ=10 -10 в 1 см ), термостатировали до получения культуры в фазе логарифмического роста. Затем в эту же пробирку вносили кусочек агара с зоной лизиса, либо 0,1 см3 лизата бактериофага (10 БОЕ в 1 см); термостатировали в течение 16-18 ч; центрифугировали в стерильных стаканчиках при 3600 об/мин в течение 20 мин. или фильтровали через установку «Стерифил 250» с фильтром (размер пор 0,46 мкм), задерживающим бактерии и пропускающим вирусы, а затем полученные лизаты переносили в стерильные пробирки.
Действие УФ-излучения на фаги в лабораторных условиях определяли по наличию или отсутствию зон лизиса в смыве, взятом после обработки поверхности пластины, изготовленной из нержавеющей стали и имитирующей поверхность оборудования.
Действие дезинфицирующих веществ, уровней рН и температуры на фаги в лабораторных условиях определяли по изменению титра бактериофагов в образце после воздействия.
Для определения влияния различных веществ на адсорбцию фагов на клетки молочнокислых бактерий 200 см каждой питательной среды подогревали до температуры (30±2) С. В образцы добавляли 10 см фильтрата, содержащий бактериофаг с титром 10 БОЕ/см и 3% свежеприготовленной культуры. В качестве контроля для сравнения использовали приготовленные таким же образом образцы, в которые не был внесен бактериофаг, а также обезжиренное молоко с фагом и без добавления фага. Далее термостатировали при (30±2) С, определяли в течение каждого часа титруемую и активную кислотность.
Для поддержания стартовых культур в активном жизнеспособном состоянии производили их периодические пассажи. Поскольку в работе применяли молочнокислые бактерии, то в качестве среды использовали стерильное обезжиренное молоко. Культуры молочнокислых бактерий перевивали петлей в 10 см3 стерилизованного обезжиренного молока, термостатировали (при температуре лактококки - (28±1) С, термофильные стрептококки и палочки (37±1 С)) до свертывания молока, после чего полученные культуры хранили при температуре (4±2)С. Интервал между перевивками составлял не более 20 дней.
Для длительного хранения клеток молочнокислые бактерии перевивали в обезжиренном молоке и хранили при -20 С в течение полугода. Коллекцию фагов поддерживали в лизатах на среде Ml7 с добавлением 0,1 % хлороформа при температуре (4±2) Сив лиофилизированном состоянии.
Контроль штаммов на чистоту проводили микроскопированием. Фаги проверяли по своей видовой специфичности (спектр литического действия) и по морфологии бляшек.
Обоснование выбора стандартизованных жидких и плотных питательных сред для выявления бактериофагов молочнокислых бактерий
Существующий метод, изложенный в Технологической инструкции по приготовлению и применению заквасок и бактериальных концентратов для кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности предусматривает при выявлении бактериофагов в заквасках использование в качестве питательной среды - гидролизованного молока. Однако, методика приготовления этой среды трудоемка, и состав получаемых партий не стандартизирован. В настоящее время для молочнокислых бактерий реализуются сухие питательные среды, получаемые в промышленном масштабе, которые легко приготовить в лабораторных и производственных условиях. В этой связи изучали возможность использования серийно-выпускаемых стандартизованных как жидких, так и плотных питательных сред для обнаружения бактериофагов, лизирующих разные виды молочнокислых бактерий.
При выявлении бактериофагов необходимо, чтобы исследуемые тест-культуры давали сплошной рост на чашке Петри, для этого в 1 см среды должно содержаться не менее 10-10 КОЕ. Бактериальные культуры в фазе логарифмического роста можно разделить на две категории: собственно логарифмические культуры, соответствующие середине логарифмической фазы, и «ночные» культуры, где бактерии находятся в самом конце логарифмической фазы [43]. В проводимой работе получали культуры в собственно логарифмической фазе роста. В качестве объектов для исследования применяли следующие жидкие питательные стандартизованные среды: среда Ml7 для определения термофильных стрептококков, среда ГМК-2 для культивирования бифидобактерий, тиогликолевая среда для контроля стерильности продукции (ТГ), бульон MRS для молочнокислых бактерий.
Из полученных результатов экспериментов можно заключить, что рост культур лактококков и термофильного стрептококка на питательных средах: гидролизованное молоко (ГМ), ГМК-2, Ml7 незначительно отличался (рис. 3.5).
В основном, собственно логарифмическая фаза роста наблюдалась на питательной среде ГМК-2 на час позднее по сравнению с гидролизованным молоком как для лактококков, так и для культур термофильного стрептококка. На среде Ml 7 культуры лактококков и термофильного стрептококка запаздывали в развитии: лактококки - на час, термофильный стрептококк - на 0,5 часа, но в целом давали хороший рост. Следует отметить, что молочнокислые палочки, в частности, ацидофильные бактерии одинаково развивались на гидролизованном молоке, в бульоне MRS и среде ГМК-2, но практически не развивались на среде Ml 7 в течение 3-х суток. В этой связи, стандартизованные жидкие питательные среды ГМК-2 и Ml7, бульон MRS можно рекомендовать для получения культур в собственно логарифмической фазе роста для обнаружения бактериофагов.
В микробиологической практике развитие культур в жидких питательных средах можно устанавливать визуально по образованию мути в питательной среде в сравнении с контролем (питательная среда без добавления культуры), что и делали в проведенной серии экспериментов.
В то же время нефелометрический метод для определения развития молочнокислых бактерий имеет широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и точно определять концентрацию клеток в питательной среде.
Поэтому в серии следующих экспериментов получали данные о зависимости оптической плотности от количества клеток в конкретных условиях выращивания, на основании которых строили калибровочную кривую. Для этого в пробах каждые 0, 4, 5, 6, 7, 8 ч определяли оптическую плотность и количество бактериальных клеток нефелометрическим методом и методом подсчета бактериальных колоний на чашках Петри соответственно.
В начале измерений была выбрана длина волны, при которой выполняются следующие условия: - оптическая плотность имеет максимальную величину; - ход кривой примерно параллелен горизонтальной оси, т. е. оптическая плотность мало зависит от длины волны. Данные по обоснованию выбора светофильтра приведены в табл. 3.3. Дмах=0,83 при длине волны 670 нм, поэтому в дальнейших измерениях использовали данный светофильтр. В дальний кюветодержатель помещали контроль (жидкую питательную среду: гидролизованное молоко, ГМК-2, Ml7, тиогликолевая среда), в ближний - питательную среду с культурой после культивирования при оптимальной температуре в течение 0, 4, 5, 6, 7, 8 ч и затем измеряли оптическую плотность с учетом разбавлений.
На основании полученных данных была составлена математическая модель зависимости оптической плотности от количества клеток в бактериальных суспензиях молочнокислых бактерий с применением компьютерной программы Excel. Полученные в пятикратной повторности данные отображены в табл. 3.4-3.5.
Изучение действия на бактериофаги различных факторов и разработка мероприятий по профилактике бактериофагии
Одним из важнейших направлений возможного применения предложенного метода является выявление бактериофагов по ходу технологического процесса ферментируемых молочных продуктов. Это позволит определять критические контрольные точки, на которых возможна инфекция бактериофагом. Для проверки метода в лабораторных условиях на предприятиях молочной промышленности по ходу технологических процессов было отобрано 278 проб. Для индикации бактериофагов в отобранных пробах в качестве тест-культур использовали не только серийно-выпускаемую тест-культуру лактококков (как рекомендовано технологической инструкцией по приготовлению заквасок), но и отобранные ранее чувствительные к фагам культуры термофильного стрептококка, молочнокислых палочек, а также бактериальные концентраты и закваски, используемые на обследуемых предприятиях.
Образцы с предприятий молочной промышленности после специальной подготовки были исследованы на наличие фагов. Полученные результаты представлены в табл. 5.1.
Результаты исследования отобранных на предприятиях проб сырого молока и сливок на наличие бактериофагов показали, что в 66,7 % проб сырого молока и 70% сырых сливках присутствовали бактериофаги. Отмечено, что образцы значительно отличались как по бактериальной обсеменённости, так и по количеству фаговых частиц в 1 см3. Таблица 5.1 Результаты мониторинга бактериофагов при производстве кисломолочных продуктов (йогурт, апигурт, фругурт, сметана, домашний сыр, творог)
Наименованиеисследуемогообразца Количество образцов Наличие зон лизиса при использовании
Стандарт ной тест-культуры Заквасоклактокок-ков заквасок термофильного стрептококка заквасок термофильныхмолочнокислых палочек Сырое молоко 24 0-н/о 15-обн. 0-н/о 15-обн. 0-н/о 15-обн. 24-н/о Сырые сливки 15 0-н/о 11-обн. 0-н/о 11-обн. 8-н/о 7 - обн. 15-н/о Молоко до заквашивания (пастеризованная смесь) 22 17-н/о 5- обн. 13-н/о 9-обн. 12-н/о 10-обн. 22-н/о Сливки для сметаны до заквашивания 12 9-н/о 3 - обн. 7-н/о 5 - обн. 6-н/о 6 - обн. 12-н/о Закваска производственная 32 26 -н/о 6 - обн. 24-н/о 8-обн. 25 -н/о 7 - обн. 32-н/о Заквашенная смесь 29 17-н/о 12-обн. 6-н/о 23 - обн. 7-н/о 22 - обн. 6-н/о 23- обн. Сыворотка из под творога и сыра 56 40-н/о 22-обн 16 -н/о 40-обн 16-н/о 40 - обн 16-н/о 40-обн. Готовый продукт 36 4-н/о 2-обн. 2-н/о 18-обн. 13-н/о 23-обн. 18 -н/о 18-обн. Смывы с 52 45-н/о 42-н/о 44-н/о 52 -н/о Оборудования 7-обн 10-обн 10-обн ИТОГО: 278 195-н/о 83-обн. 131-н/о 147-обн. 138-н/о 140-обн. 197-н/о 81-обн. Примечание «обн»- наличие зоны лизиса; «н/о»- зона лизиса не обнаружена
Выявлено, что в сырье после пастеризации присутствовали бактериофаги, которые в дальнейшем могут лизировать клетки полезной микрофлоры, применяемой для производства продуктов.
В настоящее время на предприятиях используют закваски прямого внесения, бактериальные концентраты и производственные закваски. В ходе работы установлено, что 25% образцов производственных заквасок содержали фаги с низким титром (10-10 БОЕ/см). В этой связи производственную закваску и молоко, предназначенное для ее приготовления, следует отнести к критическим контрольным точкам при проведении мониторинга бактериофагов.
Наличие бактериофагов, лизирующих лактококки, термофильные стрептококки, молочнокислые палочки, было выявлено в творожной сыворотке и сыворотке из под домашнего сыра. При этом титр бактериофагов составлял (10-10V)BOE/CMJ.
Таким образом, проведенные исследования проб, отобранных на молочных предприятиях, показали наличие большого количества бактериофагов, способных лизировать разные виды молочнокислых бактерий (рис. 5.1).
Бактериофаги были выделены в 30,7% образцах смывов с оборудования, что доказывает, возможность инфицирования пастеризованного молока и возможность дальнейшей приостановки процесса ферментации. 90% проб готовых продуктов содержали бактериофаги. частота обнаружения бактериофагов, %
Анализ полученных данных, свидетельствует об увеличении количества образцов, в которых выявлены бактериофаги в случае использования в качестве индикаторных тест-культур - стартовые культуры с разным видовым составом молочнокислых бактерий.
При использовании разработанного метода бактериофаги были обнаружены в 70 % исследуемых промышленных образцов. Из них 53 % проб содержали фаги, лизирующие термофильные стрептококки; 50,3%-фаги, лизирующие лактококки; 29,4% проб содержали фаги, лизирующие термофильные молочнокислые палочки (рис. 5.2). разработанный метод существующие методы бактериофаги лактококков бактериофаги термофильного стрептококка бактериофаги молочнокислых палочек
Существующие методы позволили выявить бактериофаги лактококков в 31% проб. Полученные данные свидетельствуют о том, что в некоторых пробах содержались бактериофаги, лизирующие разные виды молочнокислых бактерий. Проведенная работа позволила установить перечень основных критических контрольных точек, мониторинг которых следует осуществлять при определении риска существования опасного фактора - бактериофагов по ходу технологии: - сырые молоко и сливки, поступающие на предприятия; - сырые молоко и сливки перед началом технологического процесса; - пастеризованное сырьё, перед внесением стартовых культур; - закваска; - заквашенная смесь; - готовые продукты; - смывы с оборудования; - молочная сыворотка.
Далее в ходе работы было исследовано 45 заквасок лактококков и 48 термофильного стрептококка. Все изученные закваски отвечали по технологическим показателям требованиям нормативных документов [61].
При этом сравнивали производственные закваски и закваски прямого внесения отечественных и зарубежных производителей.
В среднем индекс фагоустойчивости у испытанных партий стартовых культур (отечественных традиционных заквасок и бактериальных концентратов, а также заквасок прямого внесения - DVS) в зависимости от условий производства снижался на 23,3%, что свидетельствовало о возможном изменении свойств используемых видов стартовых культур, в том числе их фагоустойчивость.
