Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Глава I. Характеристика эндо-1,4-/3-ксиланазы 9
Ксиланы зерна злаков: структура, состав 9
Продуценты эндо-1,4-/2-ксиланаз 10
Направленный биосинтез эндо-1,4-|3-ксиланазы 15
1.3.1 Влияние состава среды на биосинтез
эндо-1,4-/-ксиланазы 16
1.3.2. Влияние условий культивирования на
биосинтез эндо-1,4-|3-ксиланазы 22
Выделение и очистка препаратов эндо-1,4-|-ксиланазы 24
Физико-химические свойства эндо-1,4-/5-ксиланаз 26
Молекулярная масса эндо-1,4-|&-ксиланаз и их структура 26
Влияние рН и температуры на активность
ц, эндо-1,4-/-ксиланаз 28
1.5.3 Исследования каталитических центров 33
Субстратная специфичность действия эндо-1,4-|3-ксиланаз 35
Применение гемицеллюлозолитических ферментных препаратов в пищевой промышленности 38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 49
Глава 2. Материалы и методы исследований 49
Объекты исследований 49
Методы определения активности фермента 49
Определение количества белка 51
Математическое планирование экспериментов 51
Получение технического препарата эндо-1,4-|3-ксиланазы 51
Гель-фильтрация и ионообменная хроматография 52
2.7 Фракционирование ферментного препарата методом
электрофореза 53
Определение молекулярной массы фермента методом гель-фильтрации 54
Определение субъединичной структуры белка
методом электрофореза 54
Тонкослойная хроматография конечных продуктов ферментативного гидролиза ксилана 55
Анализ состава аминокислот 56
2.12 Методы определения показателей солода, сусла и пива 57
Глава 3. Исследование биосинтеза эндо-1,4-/3-ксиланазы Rhizopus
var microsporus 595 59
3.1. Получение активного продуцента эндо-1,4-/3-ксиланазы 59
3.2 Разработка условий культивирования продуцента
эндо-1,4-/?-ксиланазы R. var microsporus 595 на твердых
питательных средах 61
т, 3.3 Разработка условий культивирования продуцента
эндо-1,4-/?-ксиланазы R. var microsporus 595 при
глубинном способе выращивания 70
Глава 4. Получение препарата эндо-1,4-/$-ксиланазы
R. var microsporus 595 и исследование его физико-химических
свойств 88
4.1 Выделение и очистка эндо-1,4-/3-ксиланазы 88
4.2. Определение молекулярной массы и субъединичного
строения фермента 96
Ф 4.3 Аминокислотный состав эндо-1,4-|3-ксиланазы 96
Влияние рН и температуры на активность фермента 100
Кислотная и термическая инактивация эндо-1,4-/3-ксиланазы 101
Изучение действия эндо-1,4-0-ксиланазы на ксилан 116
Определение константы Михаэлиса эндо-1,4-/3-ксиланазы 116
Исследование ферментативного гидролиза ксилана 118
Идентификация аминокислотных остатков активного центра 124
Глава 5. Применение ксиланазы в технологии пива 129
Исследование влияния различных факторов на качественные показатели пивного сусла 129
Разработка технологии получения пивного сусла с применением ксиломикроспорина 138
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 143
ЛИТЕРАТУРА 144
ПРИЛОЖЕНИЯ 167
Введение к работе
Актуальность работы. Исследование микробного синтеза ферментов, их физико-химических свойств, специфичности действия имеет важное практическое значение с точки зрения рационального использования ферментных препаратов и интенсификации технологических процессов.
Растительное сырье из-за его доступности находит все большее применение в различных отраслях пищевой промышленности. Так ксиланы достаточно широко распространенные в природе (содержание их в клеточных стенках растений составляет до 40%), рассматриваются как потенциальный источник моно- и олигосахаридов, спиртов и других органических соединений, в которые они могут быть превращены под действии систем ферментов, способствующих их расщеплению. Поэтому среди гидролитических ферментов все больше находит свое применение в промышленности эндо-1,4-/?-ксиланаза (КФ 3.2.1.8) (1,4-/-0-ксилан ксиланогидролаза), катализирующая эндогидролиз (1,4) -/З-О-ксилозидных связей в ксиланах.
Вопросами исследования свойств эндо-1,4-|3-ксиланаз и их применения в различных отраслях промышлености посвящены работы Родионовой Н.А. (2002), Гужовой Э.П. (1987), Элисашвили В.И. (1999), Subramaniyan S. (1998), Tenkanen М. (1997) и многих других отечественных и зарубежных авторов. Так, исследован биосинтез фермента, проведена очистка, изучены некоторые физико-химические свойства. Однако данных исследований не достаточно, в связи с этим остается важным и актуальным вопрос поиска новых высокоактивных продуцентов ферментов, гидролизующих ксилан.
Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Изыскание
оптимальных условий микробного синтеза ферментов и исследование их физико-химических свойств» (№ гос. регистрации 01930004491) , 2001-2005 гг.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение и исследование физико-химических свойств микробной эндо-1,4-/3-ксиланазы.Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих основных задач:
выбор активного продуцента эндо-1,4-/3-ксиланазы;
исследование условий биосинтеза и рационального режима культивирования продуцента;
разработка эффективного метода выделения и очистки эндо-1,4-/3-ксиланазы;
изучение некоторых физико-химических свойств фермента;
определение кинетических закономерностей и термодинамических параметров кислотной и термической инактивации высокоочищенной эндо-1,4-/3-ксиланазы;
- использование ферментного препарата при производстве пива.
Научная новизна. Научные положения диссертационной работы
помогают расширить и углубить фундаментальные знания о регуляции метаболизма микромицетов на уровне исследуемого фермента. Изучены физиолого-биохимические особенности штамма Rhizopus var microsporus 595 и условия биосинтеза эндо-1,4-/3-ксиланазы. Обоснованы подходы, принципы и методы получения препарата фермента различной степени чистоты. Установлены закономерности процесса биокатализа в зависимости от внешних факторов. Исследована термическая и кислотная инактивация эндо-1,4-0-ксиланазы. Обоснованы параметры и условия применения ферментного препарата при производстве пива.
Практическая значимость работы. Разработаны режимы и компонентный состав питательных сред при твердофазном и глубинном культивировании микромицета . Штамм Rhizopus var microsporus 595 рекомендован в качестве продуцента эндо-1,4-|3-ксиланазы для промышленного использования. Реализована технология получения препарата эндо-1,4-/3-ксиланазы и определены его физико-химические и биохимические свойства. Установлены параметры стабильности и максимальной активности фермента. Обоснована необходимость применения ферментного препарата в пивоваренной промышленности при получении пивного сусла. Подобраны: стадия внесения препарата, дозировка, температура и длительность выдержки затора, что положительно сказывается на выходе готового продукта и сокращении затрат на основное сырье.
Промышленная апробация в условиях предприятия ПТК «Вена» подтвердила целесообразность и практическую значимость результатов исследований.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на внутривузовских и международных конференциях. Они были представлены на IV Международный симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пушино, 2001), международной конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001), II Всероссийской научно-технической конференции «Теория конфликта и ее приложения» (Воронеж, 2002), IV научно-практической конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Ульяновск, 2002), 6-ой и 7-ой Путинской школа-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино-2002, 2003), конференции «Современные методы теории
функций и смежные проблемы» (Воронеж, 2003), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции» (Воронеж, 2003) и внутривузовских конференциях ВГТА за 2001-2002 г.
Публикации, Основные результаты диссертационной работы изложены ВІЗ публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (180 источников, в том числе 119 зарубежных авторов) и приложения. Иллюстративный материал включает 39 рисунков и 20 таблиц.
Работа выполнялась на базе кафедры «Микробиологии и биохимии» Воронежской государственной технологической академии. Автор выражает свою искреннюю благодарность научному руководителю д.т.н., профессору Григорову B.C., К.6.Н., доценту Шуваевой Г.П., д.б.н., профессору Корнеевой О.С. за оказанную помощь в выполнении и консультации при написании настоящей диссертационной работы, а также признательность коллективу кафедры за доброжелательное отношение при выполнении работы и содействие при оформлении диссертации.
