Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Продуценты микробных липаз и их характеристики 8
1.2 Факторы, влияющие на биосинтез липазы при культивировании продуцентов 12
1.3 Получение очищенных препаратов липазы и их физико-химические свойства 18
1.4 Практическое применение препаратов микробной липазы 28
1.5. Использование микроорганизмов в мясной промышленности 33
1.6. Применение стартовых культур в технологии мясных продуктов 36
1.6.1 Характеристика и свойства стартовых культур... 43
1.7 Взаимодействие дрожжей и стартовых культур 48
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований 54
2.1 Схема экспериментальных исследований 54
2.2 Объекты исследований
2.2.1 Оживление чистой культуры 56
2.2.2 Культивирование дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711 56
2.3 Методы определения активности липазы 57
2.4 Подбор субстратов 60
2.5 Аминокислотный анализ 60
2.6 Общие биохимические и микробиологические методы исследования 62
2.7 Выделение и очистка ферментного препарата 62
2.8 Определение молекулярной массы 64
2.9 Физико-химические методы исследования мясного сырья 65
2.10 Оценка биологической ценности продуктов 68
2.11 Специальные методы исследования 72
Глава 3. Получение ферментного препарата липазы и исследование его физико-химических свойств 80
3.1 Влияние различных источников углерода и азота на биосинтез липазы 80
3.2 Выбор условий культивирования Yarrowia lipolytica Y-1711 87
3.3 Разработка условий получения очищенного ферментного препарата липазы 91
3.4 Молекулярная масса и аминокислотный состав молекулы липазы 96
3.5 Исследование влияния рН и температуры на активность липазы 97
3.6 Исследование влияния рН и температуры на стабильность липазы 100
3.7 Определение субстратной специфичности липазы 103
Глава 4. Выбор и обоснование стартовых культур для создания композиции 106
4.1 Подбор видов микроорганизмов для создания композиции 106
4.2 Изучение возможности совместного использования микроорганизмов различных видов 111
4.3 Подбор оптимальных соотношений молочнокислых бактерий и ферментного препарата 113
Глава 5. Исследование возможности применения композиции молочнокислых бактерий и ферментного препарата липазы в технологии сырокопченых колбас 117
5.1 Исследование влияния массовой доли консорциума микроорганизмов на рН модельных фаршей 120
5.2 Исследование функционально-технологических показателей ферментированных модельных фаршей... 118
5.3 Оценка аромата модельного фарша с добавлением композиции 125
5.4 Определение общего микробного числа модельного фарша 129
5.5 Модификация технологии и определение качественных показателей готового продукта 131
Выводы 140
Список использованных источников
- Получение очищенных препаратов липазы и их физико-химические свойства
- Культивирование дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711
- Разработка условий получения очищенного ферментного препарата липазы
- Изучение возможности совместного использования микроорганизмов различных видов
Введение к работе
Актуальность работы. Колбасные изделия традиционно пользуются высоким потребительским спросом. В настоящее время при постоянно нарастающей конкуренции актуальной проблемой является разработка и внедрение новых технологий, ориентированных на интенсификацию комплекса сложных биохимических превращений, которые протекают в мясном сырье при производстве колбасных изделий, и позволяющих выработать продукты со специфическим вкусом и ароматом.
Одним из путей решения такой проблемы является биотехнологический принцип модификации мясного сырья - направленное регулирование хода биохимических, физико-химических и микробиологических процессов, в результате которых формируется структура, цвет и вкусоароматические характеристики готового продукта.
Действие микроорганизмов связано с их способностью продуцировать в мясе специфические биологически активные вещества: органические кислоты, бактериоцины, ферменты, витамины, которые способствуют улучшению санитарно-микробиологических, органолептических показателей готового продукта и позволяют интенсифицировать технологический процесс.
Пути улучшения вкусовых, и ароматических свойств мясных продуктов, ускорения процесса созревания и подавления роста нежелательной микрофлоры разрабатывались рядом ученых: Л. В. Антиповой, В. М. Бондаренко, А. Н. Габараевым, В. Б. Крыловой, Л. С. Кудряшовым, И. А. Роговым, Н. Г. Машенцевой, В. В. Хорольским, Э. Шиффнером и другими отечественными и зарубежными учеными.
В мясной промышленности до последнего времени используют штаммы микроорганизмов молочнокислых бактерий и микрококков. Молочнокислые бактерии обладают исключительно лабильным метаболизмом, способны приспосабливаться к изменению среды благодаря вариабельному приспособительному обмену. При внесении их в колбасный фарш в виде бактериальных заквасок продукты метаболизма этих бактерий формируют аромат изделия.
Важная роль в формировании аромата мясных продуктов принадлежит ферментации жиров, в процессе которой образуются ди- и моноглицериды, летучие жирные кислоты (уксусная, масляная, капроновая и др.) и продукты их распада (альдегиды, кетоны, метилкетоны, эфиры, спирты). Данный процесс осуществляется микрококками, лактобациллами, дрожжами и мицели-альными грибами, синтезирующими липолитические и другие ферменты, которые участвуют в превращениях жиров.
Образующиеся летучие низкомолекулярные жирные кислоты могут окисляться до перекисей, которые под действием каталазной активности
микрококков превращаются в карбоксильные соединения, способствующие вкусообразованию продукта.
На основании вышеизложенного следует, что включение липазы в композицию микроорганизмов для производства сырокопченых колбас является весьма перспективным с точки зрения создания характерного вкуса, аромата и консистенции данного вида продукта. Перспективность такого рода исследований объясняется и тем, что липолитические и протеолитические ферменты принимают участие также в ускорении созревания колбас. Однако в отечественной практике такие исследования практически отсутствуют. В связи с этим вопросы, связанные с практическим применением липазы в технологии сырокопченых колбас, вызывают значительный интерес.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы было получение фермента липазы, изучение ее биохимических и физико-химических свойств, обоснование и разработка технологии производства сырокопченых колбас с применением композиции из стартовых культур и ли-политического фермента.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
исследование условий биосинтеза липазы Yarrowia lipolytica Y-1711;
разработка эффективного способа выделения и очистки ферментного препарата липазы, определение физико-химических свойств и субстратной специфичности фермента;
выбор и обоснование целесообразности использования композиции из бактериальных стартовых культур и липазы для производства сырокопченых колбас;
исследование влияния технологических параметров на активность композиции из стартовых культур и липазы;
исследование изменения аромата модельного фарша с использованием композиции стартовых культур и ферментного препарата липазы;
определение условий и обоснование режимов производства сырокопченой колбасы с применением липазы и стартовых культур микроорганизмов; оценка качественных показателей готового мясного изделия;
разработка проекта нормативной документации на композицию из стартовых культур микроорганизмов и липазы и производственная апробация технологии.
Научная новизна. Изучены физиолого-биохимические особенности дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711 и условия их рационального культивирования при биосинтезе липазы.
На основании теоретических обобщений и экспериментальных исследований впервые обоснована целесообразность использования композиции из стартовых культур микроорганизмов и дрожжевой липазы при производстве сырокопченых колбас.
Получены новые данные о влиянии композиции на процесс ароматооб-разования при производстве сырокопченых колбас.
Установлен характер изменений микробиологических, физико-химических, органолептических показателей формирования структуры в процессе производства сырокопченых колбас под влиянием стартовых бактериальных культур и липазы.
Практическая значимость работы. Получен новый ферментный препарат, установлены оптимальные условия ферментативного гидролиза жиров растительного и животного происхождения: температура, рН, длительность процесса и дозировка препарата. Определена субстратная специфичность липазы дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711, что позволяет рекомендовать данный ферментный препарат для интенсификации процесса производства сырокопченых колбас.
Разработана композиция из молочнокислых бактерий и ферментного препарата липазы «Липолитин ГЮх», установлено ее положительное влияние на функционально-технологические свойства мясного сырья. Разработаны рекомендации по использованию композиции из молочнокислых бактерий и ферментного препарата липазы «Липолитин ГЮх» при производстве сырокопченых колбас. Изучено изменение вкусоароматических характеристик в процессе созревания мясного фарша.
Результаты апробированы на ОАО «Комбинат мясной Калачеевский».
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы представлены и обсуждены в период 2005 - 2009 г.г. на ежегодных отчетных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии; международных и всероссийских научно-технических конференциях: «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2005); «Экстракция органических соединений ЭОС» (Воронеж, 2005); «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2006); «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); «Биотехнология и современность» (С.-Петербург, 2006); «Пищевые технологии» (Казань, 2006); «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов» (Улан-Удэ, 2006); «Наукоемкие химические технологии» (Самара, 2006); «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (Воронеж, 2009). Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 23 работы, в том числе три в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, трех экспериментальных глав, выводов, списка использованных источников и приложения. Работа содержит 154 страниц машинописного текста, 19 таблицы, 37 рисунков. Библиография включает 121 наименование.
Получение очищенных препаратов липазы и их физико-химические свойства
Изучение процесса биосинтеза ферментов дает возможность повышать выход ферментов с помощью методов физиологического воздействия. Природа биосинтеза ферментов зависит от вида продуцентов, наличия в них транспортных средств, потребления тех или иных питательных веществ.
Питательные среды, используемые при выращивании микроорганизмов, определяют синтез ферментов. Изучение физиолого-биохимических особенностей роста продуцента, а также условий, стимулирующих биосинтез фермента, позволяет выбрать питательные среды для промышленного применения.
Для развития микроорганизмов и синтеза ими биосинтетически активных веществ важнейшая роль принадлежит углероду и азоту .
Важным фактором, определяющим интенсивность накопления липаз микроорганизмами, является источник азота в среде выращивания. Известно, что большинство липаз используют для построения клеток и образования ферментов самые разнообразные источники азота, как органические, так и минеральные. Однако уровень липазной активности на этих источниках различен и определяется индивидуальными особенностями культуры [37].
При изучении влияния источников азота на биосинтез липазы грибом Rhizopus oryzae показано, что аммонийные соли оказывали положительное действие на липазную активность, а нитраты снижали уровень активности в 25 раз. Наибольшая активность липаз Rhizopus oryzae обнаруживалась на средах, богатых сложными органическими веществами, и, в первую очередь, на средах, содержащих соевую муку. Лучший результат наблюдался при использовании соевой муки в сочетании с кукурузным экстрактом.
Аммонийные соли также положительно влияют и на биосинтез липазы Candida paralipolytica 739. При замене аммонийного азота на нитратный образование липазы культурой дрожжей значительно снижается.
Стимулирующее действие соевой муки на биосинтез липаз обнаружено у многих микроорганизмов: бактерий Pseudomonas, грибов Prizopus, Ми-cor, Penicillium и некоторых дрожжей. Активный синтез липаз на средах с соевой мукой одни исследователи объясняют действием ее липидного компонента, другие - определенной ее фракцией, содержащей белок и углеводы.
Максимальный синтез липаз у некоторых дрожжевых организмов наблюдался на средах, содержащих в качестве источника азота мочевину или другие формы аммонийного азота.
Возможна замена дефицитных компонентов, таких, как соевая мука, кукурузный экстракт, более доступными и недорогими источниками азота. В качестве основного компонента среды могут служить отходы различных производств, в частности, молочная сыворотка, экстракт хлопкового шрота. Для удешевления питательной среды при выращивании продуцента грибной липазы в производственных условиях установлена возможность замены дрожжевого автолизата экстрактом кормовых дрожжей или настоем хлопкового шрота без снижения активности липазы [20].
На основании изложенного очевидно, что уровень липазной активности в значительной степени определяется наличием азота в среде, причем характер его действия зависит от индивидуальных особенностей продуцента.
В качестве источников углерода для продуцентов липазы применяют сложные органические соединения, такие, как растворимый крахмал, рисовые отруби или сахар. Обнаружены существенные различия в действии этих субстратов на липазную активность не только представителей разных родов, но и видов одного рода.
Стимулирующее действие глюкозы на образование липазы наблюдалось у микробактерий и актиномицетов. В качестве источника углерода глюкозу обычно используют в концентрации 2 - 5 %, дальнейшее повышение ее содержания, как правило, ингибирует синтез фермента.
В ряде изданий отмечено действие цитрата на образование фермента, причем оно проявлялось по-разному у различных продуцентов. Цитрат стимулирует синтез липазы грибами Aspergillus wentii и бактериями Alcaligenes, но оказывает репрессирующее действие на накопление фермента Pseudomonas aurantiaca [ЗО].
Некоторые авторы для увеличения выхода липазы используют в качестве источника углерода углеводы в комбинации с жирами, которые рассматриваются как индукторы синтеза ферментов. По мнению большинства исследователей, микробные липазы - индуцированные ферменты. Индукторами обычно являются субстраты, на которые действует данный фермент или продукты его гидролиза, а также некоторые аналоги этих субстратов. При биосинтезе липаз в качестве индукторов микроорганизмы используют природные жиры растительного или животного происхождения (растительные масла, кашалотовый и свиной жиры, синтетические триглицериды, жирные кислоты) и некоторые ПАВ - желчные кислоты и их соли.
Культивирование дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711
В последние годы были описаны штаммы, которые по некоторым свойствам отличаются от типичных. Они подвижны, восстанавливают нитраты в нитриты, образуют споры, каталазоположительны.
По форме клеток молочнокислые бактерии - палочки и кокки. Размеры их варьируют у отдельных видов.
Длина клеток у различных культур одних и тех же видов молочнокислых бактерий зависит в определенной степени от состава среды, присутствия кислорода, способа инкубации. Существенное влияние на форму клеток оказывает присутствие в среде некоторых витаминов. Удлинение формы клеток, их истончение и грануляцию наблюдали Педерсон и Албери [58] при культивировании отдельных молочнокислых бактерий на средах с высокой активной кислотностью (рН 3,7), при значительном содержании поваренной соли (до 6%), при температурах, намного превышающих оптимальные (45 С вместо 18 С). Такие же длинные, тонкие, гранулированные палочки нередко выделяются и из бродящих овощей, рассолов, вин, су сел, томатных продуктов.
На форму клеток значительное влияние могут оказывать ионизирующие излучения. Измененные клетки молочнокислых бактерий появляются и при добавлении в среду веществ, снижающих поверхностное натяжение, а также антибиотиков.
Ультраструктура клеток молочнокислых бактерий и ряда других грам-положительных бактерий во многом схожа [28]. Так, клеточная стенка лак-тобацилл представляет собой относительно электронно-плотный гомогенный слой толщиной 15 - 60 ммк.
Молочнокислые бактерии размножаются делением перегородкой. Если клетки делятся в одной плоскости, это приводит к образованию цепочек; когда же деление идет в двух плоскостях, образуются так называемые тетрады, характерные для молочнокислых бактерий рода Pediococcus. Молочнокислые бактерии неподвижны. Следует однако отметить, что имеется ряд сообщений о нахождении подвижных форм; к таким бактериям относятся Lactobacillus salivarius, Lac. ruminis.
Отдельные исследователи нередко весьма противоречиво описывали форму колоний различных видов молочнокислых бактерий. Еще в 1919 г. ученые утверждали, что истинные молочнокислые бактерии на желатиновых и агаризованных средах образуют мелкие колонии без выраженного поверхностного роста. С. А. Королев (1932) показал, что это утверждение неточно, так как все виды рода Streptococcus образуют поверхностные колонии, хотя и мелкие. Однако он указывал, что большая часть палочек их не образует. По данным О. К. Палладиной (1941), прибавление в среду веществ, обладающих восстановительными свойствами, например, 0,2% цис-теина, содействует образованию у молочнокислых палочковидных бактерий типичных поверхностных шероховатых форм колоний.
Ряд исследователей приводит описание поверхностных колоний почти всех видов коккообразных и палочковидных молочнокислых бактерий. Термофильные молочнокислые палочки (подрод Thermobacteriuni) образуют шероховатые колонии; мезофильные (подрод Streptobacterium), как правило, гладкие, причем эти формы колоний коррелируют с иными признаками бактерий указанных подродов - способностью расти при определенной температуре и образовывать длинные, часто нитевидные или же короткие клетки. Нередко можно наблюдать, что в культуре наряду с шероховатыми колониями имеются и гладкие, хотя последние со временем превращаются в шероховатые.
Молочнокислые бактерии обладают определенной протеолитической активностью, обусловливаемой действием протеиназ и пептидаз.
Протеолитическую активность проявляют как кокковые формы, так и термофильные палочки и стрептобактерии. В процессе протеолиза белков молока, особенно в начале культивирования штаммов в молоке, происходит накопление главным образом аминокислот (аспарагиновой кислоты, глицина, серина, глутаминовой кислоты, треонина, тирозина, валина, изолейцина, а также пептидов [58]. Молочнокислые палочковидные бактерии обладают большей протеолитической активностью, чем кокковые формы.
Протеолитическую активность молочнокислых бактерий оценивают по накоплению в среде амин ного, общего растворимого и небелкового растворимого азота Гидролиз белков молока молочнокислыми бактериями осуществляется с помощью внеклеточных и внутриклеточных протеаз. Существенную роль в процессе гидролиза казеина играют внутриклеточные про-теазы и других молочнокислых бактерий. У молочнокислых бактерий обнаружены протеазы, разрушающие пептиды.
Известно, что отсутствие способности образовывать каталазу является характерным признаком молочнокислых бактерий. Однако, особенно за последние годы, ряд авторов сообщил об обнаружении каталазной активности у различных видов молочнокислых бактерий.
Источником энергии для молочнокислых бактерий служит молочнокислое брожение. Молочнокислые бактерии по характеру продуктов сбраживания гексоз (глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза), дисахаридов (лактоза, мальтоза, сахароза) и полисахаридов (декстрин, крахмал), согласно терминологии, предложенной Клюйвером и Донкером (Квасников), относят к гомоферментативным или гетероферментативным. Гомоферментативные в результате брожения образуют, главным образом, молочную кислоту и лишь ничтожные количества фумаровой и янтарной, летучих кислот, этилового спирта и углекислоты. Гетероферментативные же образуют значительно большие количества уксусной кислоты, этилового спирта, углекислого газа и иных побочных продуктов и используют на это до 50% сбраживаемых гексоз.
Разработка условий получения очищенного ферментного препарата липазы
Активный биосинтез фермента начинался через 24 через после культивирования, на рис. 3.7 видно, что в период от 36 до 72 часов липолитиче-ская активность резко возрастает, что совпадает с фазой селективного роста продуцента (логарифмической фазой). Максимальный биосинтез фермента наблюдался к 70 - 74 часам культивирования.
При увеличении времени культивирования отмечалось уменьшение липолитической активности, что связано с переходом продуцента к фазе отмирания, когда превалирует процесс отмирания клеток.
Активная кислотность среды. На скорость роста продуцента оказывает большое влияние активная кислотность среды при глубинном культивировании продуцентов липаз. Исследование влияния исходного значения величины рН среды дрожжей Yarrowia lipolytica Y-1711 на биосинтез липазы показало, что данный продуцент проявляет способность к росту в широком диапазоне значений величины рН от 3,0 до 8,5. Было установлено, что максимальный биосинтез фермента наблюдался при рН 7,2 - 7,5.
Влияние начального значения рН на синтез липаз Yarrowia lipolytica Y-1711: где А — активность фермента, % от максимальной Отклонение величины рН питательной среды от оптимальных для синтеза ферментов значений как в кислую, так и в щелочную сторону влечет за собой снижение синтеза фермента (рис. 3.8).
Температура кхтыпивироеаиия. Температура оказывает большое влияние на скорость биосинтеза ферментов при выращивании различных микроорганизмов.
На рис. 3.9 показано влияние температуры на биосинтез липаз Yarrowia lipolytica Y-1711. Культивирование проводили при начальном значении активности кислотности питательной среды, равном 7,2 - 7,5. Снижение температуры культивирования до 25 С приводило к уменьшению синтеза фермента на 25 % , повышение температуры до 40 С в значительной степени угнетало синтез ферментов, активность которых достигала лишь 20 %. При дальнейшем увеличении температуры рост культур отсутствовал. Температура 33 С обеспечивала наибольшее накопление фермента в культу-ральной жидкости.
Влияние температуры культивирования на биосинтез липаз Yarrowia lipolytica Y-l 711, А — активность фермента, % от максимальной Аэрация процесса. Аэробные условия культивирования создавали, помещая колбы на круговую качалку со скоростью 220 мин "\ Интенсивность аэрации культивирования Yarrowia lipolytica варьировали изменением объ-ема питательной среды в качал очных колбах вместимостью 750 см при соотношении 1:1, 1:2, 1:3 (объем качалочных колб : среда) и т.д.
Максимальный биосинтез фермента был получен при соотношении 0,7 объема воздуха на 1 объем среды, что соответствовало 200 см" среды (рис.3.10).
Количество посевного материала. Качество и количество посевного материала в значительной мере определяют результат культивирования микроорганизмов - продуцентов липаз. Посевного материала должно быть достаточно, чтобы обеспечить быстрое развитие микроорганизмов в пита тельной среде. Количество посевного материала варьировалось от 1 до 7 % к общему объему среды.
Выделение и очистка целевого фермента включает несколько стадий, в процессе которых происходит повышение доли активного белка в общей массе препарата. Схема получения очищенного препарата включает в себя несколько стадий: культивирование микроорганизмов, выделение целевого фермента, освобождение от нерастворимых веществ и сопутствующих растворимых соединений и ферментов концентрированием. В зависимости от свойств целевого фермента каждая стадия определяется конкретными условиями, методами и аппаратурным оформлением [48].
Для получения ферментных препаратов широко применяют осаждение органическими растворителями - этанолом, ацетоном, изопропанолом. Использование растворителей объясняется тем, что они легко удаляются из препаратов в процессе сушки, а также экономически выгодны, но так как ферментный препарат будет применен в пищевой промышленности, то использование в качестве растворителей ацетона и изопропанола может привести к нежелательным последствиям.
Для изучения условий осаждения на полноту осаждения липазы мы использовали этиловый спирт с массовой долей 96,5 %. В табл. 3.1 представлены данные о влиянии концентрации растворителя на осаждение фермента.
Соотношениеобъемов куль-туральнойжидкости ирастворителей Выход ферментного препарата, мг/см Липолитическая активность, Е/г Содержание белка, мг/см3 Удельная
Как видно из табл. 3.4, максимальной активностью обладал препарат, осажденный этиловым спиртом в соотношении 1:3,0. Добавление этилового спирта к надосадочной жидкости приводило к образованию рыхлого осадка серо-белого цвета, который хорошо растворялся. При увеличении концентрации этилового спирта для осаждения липазы Yarrowia lipolytica Y-1711 активность уменьшалась, так как в осадок выпадают неактивные белки.
Отделение супернатанта от осадка осуществляли на рефрижераторной центрифуге ЦЛР-1 (Россия) при частоте вращения 1500 g.
Активность липазы при осаждении зависит от ряда факторов, в частности, от наличия сопутствующих веществ и количественного содержания самого фермента в экстракте. Существенное влияние оказывают также рН и температура. В этой связи нами изучено влияние рН на активность липазы при осаждении. Осаждение проводили этиловым спиртом в соотношении 1 : 3 при температуре 4-5 С (рис. 3.12).
Изучение возможности совместного использования микроорганизмов различных видов
Среди микроорганизмов, так же, как и в любой другой биологической среде, существуют различные типы взаимоотношений, в том числе симбиоз и антагонизм [92].
Антагонизм впервые отмечен Л. Пастером в 1877 г. Наиболее резко антагонизм проявляется среди актиномицетов, плесневых грибов, бактерий, наблюдается также среди дрожжей, водорослей и простейших. Механизм антагонизма различен и во многих случаях не ясен. Чаще всего антагонисты действуют на конкурентов продуктами обмена веществ, в т.ч. антибиотиками, либо вытесняют их вследствие более интенсивного размножения или преимущественного потребления питательных веществ. Под влиянием антагонистов у микроорганизмов могут нарушаться отдельные звенья обмена веществ. Существует антагонизм между дрожжами и молочнокислыми бактериями, степень которого зависит от видового состава микроорганизмов [58].
В основном в промышленности применяют многоштаммовые бактериальные препараты, поэтому задача отбора микроорганизмов состоит в выборе оптимальных по функциональным свойствам для конкретного продукта штаммов, а также штаммов, обладающих взаимной совместимостью. В связи с этим была изучена способность к совместному росту и размножению штаммов молочнокислых и бифидобактерий, а также дрожжей [10].
На примере штаммов, относящихся к Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Bifidombacterium bifidum, было изучено отсутствие антагонизма между этими микроорганизмами методом перпендикулярных штрихов (рис. 4.5). Bifidombacterium bifidum Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus plantarum На рисунке 4.5 видно, что при одновременном культивировании исследуемых штаммов друг с другом негативного влияния на их морфологию и рост обнаружено не было. Культуры молочнокислых бактерий не видоизменены, морфология колоний соответствует морфологии при их индивидуальном посеве на отдельные среды. В области соприкосновения штаммов молочнокислых бактерий наблюдается однородный и равномерный рост. Полученные данные позволяют сделать вывод, что взаимоотношения между исследуемыми штаммами не являются антагонистическими.
Существуют немногочисленные данные об активации молочнокислых бактерий ферментными препаратами [58]. В этой связи в дальнейших исследованиях изучали влияние дрожжевой липазы на развитие молочнокислых бактерий в модельном фарше [58]. 12 18 24 30 36 Время, ч - контроль, модельный фарш с молочнокислыми бактериями, без фермента - опыт, модельный фарш с молочнокислыми бактериями и с ферментным препаратом липазы (Липолитин Г10х). Рис. 4.5 - Влияние ферментного препарата липазы на количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий Из рис. 4.6 видно, что обработка ферментным препаратом стимулирует рост молочнокислых бактерий, что говорит о целесообразности применения липазы в технологии мясных изделий.
Применение ферментных препаратов в мясной промышленности возможно и для улучшения вкуса, аромата и внешнего вида готового продукта. В этой связи в модельный фарш, наряду с молочнокислыми бактериями: Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Bifidumbacterium bifidum, -добавляли ферментный препарат липазы "Липолитин ГЮх", т.к. участие липазы в процессе протеолиза, липолиза и последующих биохимических превращениях приводит к образованию альдегидов, аминокислот, которые являются составляющими аромата [40, 58].
В ходе создания композиции были проведены исследования по поиску оптимальных соотношений выбранных микроорганизмов. В таблице 4.1 представлены различные соотношения бактерий и липазы дрожжей (Липолитин ГЮх).
Влияние различных соотношений на характеристики мясного продукта Lactobacil lus bulgaricus Lactobacil lus plantarum Bifidumbac terium bifidum Липолитин Г 1 Ox Характеристики модельного фарша Масса, г/ кг мясного сырья рн Органолеп-тическиепоказатели Консистенция контроль - + 1 1 1 0 + - + В ходе проведенных исследований было выявлено, что оптимальным соотношением микроорганизмов является соотношение 1:1:1: 0,5. При данном соотношении происходил равномерный рост микроорганизмов, наблюдалось оптимальное снижение рН, цветообразование и характерный для колбас цвет и запах. Важной характеристикой при выборе состава композиции является протеолитическая активность. Наличие молочной кислоты в молочнокислых бактериях способствует лучшему усвоению кальция, снижающего аллергическую «настроенность» организма. Кроме того, в ферментированных продуктах под действием микроорганизмов заквасок происходит протеолиз с образованием низкомолекулярных азотистых веществ, что уменьшает аллергенные свойства продукта. Поэтому для создания продуктов противоал-лергенной направленности целесообразно использовать культуры с наибольшей протеолитической активностью.
Протеолитическую активность определяли по сумме трех свободных аминокислот: тирозина, триптофана и цистеина в пересчете на тирозин. Для этого использовали метод Ансона, описанный в главе 2.
