Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Идентификация виноградных вин 12
1.2 Методы определения химического состава виноградных вин 15
1.2.1 Контроль качества виноградных вин методами принятыми и введенными в действие ГОССТАНДАРТОМ России !5
1.2.2 Идентификация винодельческой продукции методами хроматографии 18
1.3 Классификация вин 24
1.4 Химический состав виноградных вин 26
1.4.1 Органические кислоты 26
1.4.2 Углеводы 34
1.4.3 Фенольные соединения 37
1.4.4 Спирты 39
1.5 Основы технологии производства виноградных вин 41
1.5.1 Особенности производства отдельных групп виноградных вин 43
1.6 Биохимические процессы, протекающие на разных стадиях приготовления вина 47
1.6.1 Стадия ферментации 48
1.6.2 Стадия брожения 48
1.6.3 Формирование вина 54
1.6.4 Созревание вина при выдержке 54
1.6.5 Старение и отмирание вина .56
Глава 2. Экспериментальная часть 50
2.1. Материалы и методы исследования 59
2.1.1 Материалы исследования 59
2.1.2 Физико-химические методы исследования 61
2.1.3 Хроматографические методы исследования 63
2.1.3.1 Определение органических кислот, Сахаров и многоатомных спиртов методом ИЭХ 63
2.1.3.2 Определение высших спиртов и альдегидов методом газожидкостной хроматографии 65
2.1.3.3 Определение сложных эфиров методом газожидкостной 'хроматографии 67
2.1.4. Микробиологические методы исследования 68
2.1.5. Постановка экспериментов 68
2.2 Результаты и обсуждение 7!
2.2.1 Подбор оптимальных условий хроматографического разделения органических кислот 71
2.2.1.1 Разделение алифатических кислот 71
2.2.1.2 Разделение ароматических кислот 80
2.2.2 Хроматографические параметры и метрологические характеристики разделения органических кислот методом ИЭХ 85
2.2.3 Одновременное определение органических кислот, Сахаров и многоатомных спиртов методом ИЭХ 93
2.2.4 Определение превалирующих видов несоответствия виноградных вин требованиям ГОСТ 7208-93 98
2.2.5 Определение содержания органических кислот в виноградных винах методом ИЭХ 101
2.2.5.1 Содержание основных алифатических кислот в винах различных классификационных групп 104
2.2.5.2 Содержание некоторых ароматических и сильноудерживаемых алифатических кислот в винах 125
2.2.6 Одновременное определение органических кислот, Сахаров и многоатомных спиртов в винах методом ИЭХ 120
2.2.7 Биотрансформация основных компонентов обедненною разбавлением сусла в процессе спиртового брожения 135
2.2.8 Биотрансформация основных компонентов петиотизованного сусла в процессе спиртового брожения 146
2.2.0 Использование ИЭХ для изучения влияния технологических факторов на биотрансформацию основных метаболигов в процессе спиртового брожения 162
2.2.10 Математическое описание образования летучих кислот в процессе спиртового брожения в зависимости от температуры, штамма и величины задаваемых дрожжей 180
2.2.1 I Расчет экономической эффективности внедрения метода ИЭХ в лабораторную практику для анализа органических кислот в виноградных винах 106
Выводы 205
Список литературы 207
Приложения
- Контроль качества виноградных вин методами принятыми и введенными в действие ГОССТАНДАРТОМ России
- Основы технологии производства виноградных вин
- Хроматографические методы исследования
- Хроматографические параметры и метрологические характеристики разделения органических кислот методом ИЭХ
Введение к работе
Актуальность темы. Среди современных проблем охраны здоровья населения России проблема правильного питания человека, защита его здоровья путем предотвращения поступления в организм некачественных пищевых продуктов, занимает особое место. Качество и безопасность продуктов питания отнесены к основным факторам, определяющим здоровье нации и сохранение ее генофонда. Вино на протяжении многих веков является неотъемлемой частью питания человека. В связи с этим проблема контроля качества виноградных вин приобрела особую актуальность, так как основными критериями продовольственной безопасности России являются не только степень удовлетворения потребностей населения в продуктах питания, но и соответствие этих продуктов предъявляемым к ним требованиям.
Развитие техники, разработка новых и совершенствование традиционных технологий способствовали насыщению рынка вспомогательными материалами, применение которых обеспечивает достижение в фальсифицированной продукции вкуса, окраски и аромата, близких к соответствующим показателям в натуральных винах. В связи с этим для определения качества винодельческой продукции необходимо внедрять новые методы контроля различных химических соединений, отвечающие последним достижениям науки и техники, так как по результатам многих исследований фальсифицированные вина по физико-химические показатели могут полностью соответствовать требованиям действующих стандартов.
Виноградные вина имеют в своем составе множество соединений различных классов, проходящие в процессе изготовления сложные биохимические превращения. Одним из классов соединений, входящих в состав винограда и вина, играющих важную роль в обмене веществ виноградного растения, активно участвующих в процессах, проходящих
7 при изготовлении и влияющих на органолептические свойства готовой продукции, являются органические кислоты, состав которых может быть выбран одним из возможных критериев качества. В связи с этим представляет интерес разработка нового подхода к оценке качества виноградных вин по составу органических кислот.
Одним из основных этапов в процессе образования вина является спиртовое брожение, от условий и способов проведения которого во многом зависит качество и типичность вин. Актуальным является изучение влияния различных технологических факторов на механизм превращения органических кислот. Знание этих механизмов позволит правильно управлять технологическими операциями на любой стадии, открывать новые пути интенсификации винодельческого производства, более рационально использовать сырье, улучшать качество продукции, а так же повышать эффективность послепроизводственного контроля продукции с целью преградить путь некачественному товару на стол потребителя.
Технология производства и качество вин взаимосвязаны, поэтому проблему качества необходимо решать комплексно. Решение этих задач невозможно без применения информативных, высокоэффективных аналитических методов. Одним из таких методов является ионоэксклюзионная хроматография (ИЭХ), новый вид жидкостной хроматографии. Важной задачей является подбор и разработка таких хроматографических условий, которые позволят использовать ИЭХ в "рутинной" лабораторной практике для анализа виноградных вин.
Помимо разработки новых аналитических методов контроля качества виноградных вин необходимо создание нормативной базы допустимого биохимического состава соединений различных классов в винах, в том числе органических кислот, и изучение тех превращений, которые они претерпевают на различных этапах производства, знание
8 которых будет способствовать эффективнее управлять качеством готовой продукции.
Цель и задачи исследования. Главная цель диссертационной работы состояла в адаптации метода ИЭХ к оценке качества винофадных вин на основе определения качественного и количественного состава органических кислот и в изучении влияния различных технологических факторов на превращения главных метаболитов дрожжей в процессе спиртового брожения с использованием указанного метода. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: -изучение влияния матрицы вина на хроматофафическое определение кислот и подбор оптимальных условий разделения алифатических и ароматических органических кислот, входящих в состав винофадных вин; -метрологическая оценка метода ИЭХ при определении состава органических кислот в винофадных винах в подобранных оптимальных условиях;
-апробация коммерческой хроматофафической колонки для одновременного определения в винофадных винах кислот, Сахаров и спиртов;
-изучение рынка винодельческой продукции с целью установления превалирующих видов фальсификации;
-создание базы данных о вариациях состава органических кислот в готовых винофадных винах различных классификационных групп; -изучение возможности инструментального подтверждения низкой органолептической оценки виноградных вин;
-исследование влияния некоторых видов фальсификации (разбавление и петиотизация) на физико-химические показатели виноматериалов и трансформацию основных метаболитов в процессе спиртового брожения;
9 -использование метода ИЭХ для изучения биохимических трансформаций основных метаболитов в зависимости от применяемого штамма дрожжей и некоторых технологических параметров процесса брожения.
Научная новизна работы. Для экспериментального и теоретического обоснования оценки качества виноградных вин путем исследования и анализа состава и биотрансформации органических кислот, было произведено следующее:
-впервые в качестве критерия идентификации вин различных классификационных групп использован состав органических кислот; -для анализа состава органических кислот в виноградных винах применен метод ИЭХ;
-впервые подобраны оптимальные условия их хроматографического разделения, позволяющие применять ИЭХ для рутинных лабораторных исследований и устранять мешающее влияние матрицы вина; -установлены вариации содержания органических кислот в винах различных групп;
-представлена возможность инструментального подтверждения низкой органолептической оценки вин, показана разница в составе основных органических кислот качественной и фальсифицированной продукции; -впервые проведена сравнительна оценка штаммов дрожжей, использующихся в винодельческом производстве, по некоторым физиологическим и технологическим параметрам;
-выявлены зависимости в изменении содержания основных органических кислот, высших спиртов и углеводов при таких видах фальсификации, связанных с изменением состава виноградного сусла, как разбавление и петиотизация;
-установлены закономерности в образовании основных органических кислот, высших спиртов и ацетальдегида в процессе спиртового брожения
10 в зависимости от температуры брожения и величины первоначального засева 5 штаммов дрожжей;
-впервые предложено математическое описание процесса образования летучих кислот в виноматериалах в зависимости от технологических параметров спиртового брожения.
Практическая значимость и реализация результатов работы. В
результате проведенных исследований предложен новый подход к оценке
качества виноматериалов и виноградных вин на основе исследования
состава органических кислот. Разработаны оптимальные условия
ионоэксклюзионного хроматографического разделения органических
кислот в виноградных винах, обладающего следующими преимуществами:
отсутствие пробоподготовки, малое время анализа, отсутствие
мешающего влияния неорганических ионов.
Разработан стандарт предприятия СТ ЭАА "Экоаналитика" 01-2003 "Вина виноградные. Ионоэксклюзионный метод определения содержания основных алифатических кислот" [ГОСТ Р 1.5-2002].
Установлен состав 8 основных органических кислот в 108 образцах отечественных и зарубежных вин с использованием метода ИЭХ. На основании анализа 74 образцов создана база данных о возможных вариациях состава органических кислот в винах 8 различных классификационных групп, имеющая практическое значение для эффективного проведения процедуры идентификации.
Предлагаемый подход к идентификации виноградных вин по качественному и количественному составу органических кислот был успешно реализован в условиях Аналитического Центра МГУ им. М.В. Ломоносова и ЗАО "БиоХимМакСТ".
Дана оценка экономической эффективности внедрения метода ИЭХ. Показано, что внедрение ИЭХ является экономически более эффективным по сравнению с методами газовой и тонкослойной хроматографии, и,
следовательно, доступным для большего числа аналитических
лабораторий, занимающихся контролем винодельческой продукции.
Изучены превращения основных метаболитов дрожжей, в том числе органических кислот, методом ИЭХ, в зависимости от технологического режима сбраживания сусла. Проведен комплексный анализ химического состава виноматериалов и их органолептических свойств в зависимости от штамма дрожжей, их концентрации и температуры брожения.
Предложено математическое описание процесса образования дрожжами летучих кислот, существенно влияющих на вкус и букет напитка, в зависимости от условий спиртового брожения, на основе которого возможно прогнозирование содержания этих кислот в виноматериале при подборе оптимальных технологических режимов.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и конгрессах: Юбилейной международной научно-практической конференции "Пищевые продукты XXI века" (Москва, 2001); Международном конгрессе Euroanalysis-12 (8 to 13 September 2002, Dortmund, Germany); Всероссийской научно-технической конференции-выставке "Качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов питания" (Москва, 2002); Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003); 5-ой Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2003" с международным участием (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научно-технической конференции-выставке "Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации" (Москва, 2003); 2-ом Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей, в которых отражены основные ее положения.
Контроль качества виноградных вин методами принятыми и введенными в действие ГОССТАНДАРТОМ России
Качество продукции - это совокупность свойств, способных удовлетворить определенные потребности человека в соответствии со своим назначением [ГОСТ 15467-70]. Они характеризуются признаками продукции (цвет, аромат, вкус, игристые свойства, типичность) и параметрами продукции (количественное содержание кислот, Сахаров и пр.). При контроле качества тихих виноградных вин первым "шагом" является идентификация по документации [Правила проведения сертификации продовольственного сырья, 1999]. При удовлетворительных результатах идентификации по документации переходят к органолептической оценке. Винодельческую продукцию можно оценивать по десяти бальной системе. Основные элементы вина и их предельная оценка следующие: прозрачность - 0,5 балла; цвет - 0,5; букет - 3,0; вкус - 5,0; типичность - 1,0. Для различных групп и типов вин установлены дегустационные оценки, ниже которых продукция не разрешается к выпуску и реализации [Позняковский В.М., 2001]. После проведения органолептической оценки переходят к определению физико-химических показателей [Валуйко Г.Г., 1980; Мержаниан А.А., 1981; Дорохова Е.Н., Прохорова Г.В., 1991]. В государственных стандартах России [ГОСТ 7208-93, ГОСТ Р 51157-98] нормируются следующие физико-химические показатели: полнота налива, объемная доля этилового спирта, массовая концентрация Сахаров, титруемых и летучих кислот, общей сернистой кислоты, приведенного экстракта (для некоторых типов вин), железа и меди (для натуральных вин). Содержание токсичных элементов не должно превышать установленные уровни [СанПиН 2.3.2.1078-01]. Перечень показателей, устанавливаемых ГОСТом, для контроля качества виноградных вин, не всегда позволяет определить фальсифицированную продукцию, так как основные физико-химические показатели в ней могут быть доведены до заявленной кондиции. В дополнении к имеющимся на сегодняшний день методам для усовершенствования контроля качества винодельческой продукции необходимо введение в практику современных аналитических методов, в том чисел хроматографических, позволяющих определять соединения различных классов, содержание которых может являться идентификационным признаком.
Использование хроматографических методов анализа позволяет установить многие виды фальсификации виноградных вин [Багатурия И.Ш. и др., 2001; Sirbiladze A., Shatirishvili Sh., Shatirishvili I., 2000]. Анализ высших спиртов (по летучести до изоамилового), альдегидов (ацетальдегида, пропионового, масляного, валерианового и др.), эфиров (по летучести до этиловых эфиров жирных кислот Сю-Сп), составляющих букет вина, методами газовой хроматографии с использованием парофазного пробоотборника или с предварительным выделением летучей фракции дистилляцией, позволяет обнаружить разбавление вина, в том числе спиртом ректификованным, и подделку букета, а так же отличить искусственные вина от натуральных [Падалкина B.C., 1981].
Анализ ограничено летучих (секвитерпены, сложные эфиры высших кислот, фенольные соединения - гидроксибензальдегид, сиреневый альдегид и др.) и нелетучих соединений, влияющих на вкусовые ощущения и вносящих незначительный вклад в букет, дополняет характеристику вин при экспертизе на подлинность [Петров А.П. и др, 2001]. Нелетучие в обычных условиях вещества, возможно определять в условиях газовой хроматографии на неполярной колонке.
Фальсификацию марки и наименования можно устанавливать методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии с капиллярными колонками на силоксановых фазах, или методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонках с обращенофазовыми сорбентами. Предварительно вина экстрагируют органическими растворителями [Абрамов Ш.А., Власов O.K., Даудова К.Н., 2003]. Состав фенольных соединений используют для дифференциации видов виноградного уксуса и сортов вина [Cappielo A. et al., 1999]. Метод спектрофотометрии в УФ- и видимом диапазоне применяют при суммарной оценке содержания полифенолов и танинов [Савчук С.А. и др., 2000].
Анализ аминокислот, играющих особую роль в формировании вкуса вин [Агеева Н.М., Ажогина В.А., 1995; Постная А.Н., Яблонко Н.В., 1995; Ninoshvili I., Shatirishvili Sh., 2000; Kosir Iztok J., Kidric Jurkica, 2001], обычно проводят методами высокоэффективной жидкостной хроматографии на специальных аминокислотных анализаторах. Так же после получения летучих производных аминокислот возможен анализ методом газовой хроматографии на силоксановых колонках [Carnevillier V. et al., 1999; Carnevillier V. et al. 1998; Шатиришвили Ш.И., Андроникашвили Т.Г., 1995].
Добавление глицерина и диэтиленгликоля определяют методом газовой хроматографии с применением полярных фаз и высокоэффективной жидкостной хроматографией на ионообменных колонках с диодноматричным детектором.
Состав органических кислот и Сахаров является еще одним идентификационным признаком определенных марок вин [Пивоваров Ю.В. и др, 2001; Gallart М. et al., 1997; De Toledo B.M., Mascia C.H., 2000; Schatirisvili Sc, Ninoshvili I., 2000]. В литературе имеются сведения об определении на ионообменных колонках органических кислот [Blake I.D., Clarke M.L., Richards G.N., 1987] и полного углеводного состава, включая моно- и олигосахариды и углеводоспирты (маннитол, сорбитол) с УФ- и рефрактометрической регистрацией [Chen ZuL., Adams М.А., 1999; Araujo A.M. etal., 2000].
Основы технологии производства виноградных вин
Сырьем для винодельческой промышленности является виноград технических сортов вида Vitis vinifera [ГОСТ 24433-80; ОСТ 10-66-87; Кострикин И.А. и др., 2001]. Виноград собирают в период технической зрелости, когда достигнуто необходимое для производства вина данного типа содержание кислот и Сахаров [Смирнов К.В. и др., 1987]. Виноград перерабатывают на сусло по двум основным способам: по белому способу - с быстрым отделением сусла от мезги [Саришвили Н.Г., Панасюк А.П. и др., 2000] и по красному - с брожением или настаиванием на мезге [Вакарчук Л.Т., 1991; Зайчик Ц.Р., 2001]. Для получения вин различных типов применяют ряд специальных и технологических приемов. К специальным приемам относится подбор сортов винограда [Гугучкина А.А., Агеева Н.М., Гугучкина Т.И., 2001], увяливание, замораживание, использование винограда, пораженного грибом Botritis cinerea.
В пораженном винограде содержание Сахаров увеличивается до 50 %, уменьшается соотношение глюкозы и фруктозы и содержание органических кислот на половину, в сравнении с их содержанием в винограде до поражения. Гриб под действием глюкозооксидазы расходует глюкозу, в результате чего образуется лимонная кислота или же образуется глюконовая кислота в концентрации от 1 до 2 г/дм . Так же в таком винограде обнаружена слизевая кислота в количествах до 2 г/дм , образующаяся при ферментативном окислении галактуроновой кислоты. Гриб потребляет органические кислоты в два раза интенсивнее, чем сахара, образует глицерин и другие многоатомные спирты [Риберо-Гайон Ж. и др., 1980].
К технологическим приемам относятся: настаивание на мезге, в процессе которого не только происходит экстрагирование, но и образование фенолов; нагревание; спиртование; применение особых рас дрожжей; выдержка вин в специальных условиях (например, при контакте с воздухом или дрожжевым осадком); насыщение вин углекислым газом; ароматизация (например, настоями растений) [Трофимченко А.В., 1974].
Вина натуральные получают в результате полного или частичного сбраживания сахара, содержащегося в сусле, без добавления спирта. Схема производства вин этой группы приведена на рис. 3. Вино виноградное оригинальное получают путем полного или частичного сбраживания свежего виноградного сусла, мезги или восстановленного виноградного сусла с использованием пищевой вкусоароматической добавки или без нее. Натуральные белые сухие вина получают из винограда с содержанием сахара 18-20 % и титруемой кислотностью 7-9 г/дм3. При получении сусла используют мягкий режим обработки, исключающий измельчения гребней и кожицы. Сусло сбраживают при температуре 14-18С с последующим быстрым снятием с дрожжей. В белых винах не допускаются тона окисленности, поэтому на всех технологических стадиях производства виноматериал предохраняют от окисления кислородом воздуха [Валуйко Г.Г., 1985]. Натуральные красные сухие вина имеют большую экстрактивность, высокое содержание фенольных веществ [Malcolm А., 1996]. Виноград перерабатывают по красному способу (рис. 3 схема 1, 2, 3).
Натуральные полусухие и полусладкие вина получают при частичном сбраживании Сахаров сусла или мезги, либо купажированием сухих виноматериалов с консервированным суслом без внесения спирта. Используют виноград белых, розовых и красных сортов сахаристостью 20-22 %, с титруемой кислотностью 6-10 г/дм3 [Кишковский З.Н., Мержаниан А.А., 1979].
Специальные вина - крепкие, десертные и ликерные - получают полным или неполным сбраживанием сусла или мезги с добавлением этилового спирта (рис. 4). Допускается использование концентрата виноградного сока или мистеля. При получении вин типа портвейна и мадеры переработку винограда ведут по красному способу [Но P. et al., 1999]. Формирование вкуса и букета вин типа мадеры и портвейна связано с окислительными процессами, происходящими при нагревании вина и доступе кислорода. В случае мадеры эти процессы протекают более глубоко [Родопуло А.К., 1962].
Херес вырабатывают из хересных сортов винограда с сахаристостью 18-23 % [Тимуш А.И., 1986]. Виноград перерабатывают по белому способу. Одна из особенностей производства хереса - гипсование, придающее готовому вину специфический вкус [Moyano L. et al., 2002]. Окисление компонентов в виноматериале, в том числе и глубокое окисление органических кислот, происходит биохимическим путем при участии хересных дрожжей Saccharomyces oviformis var. cheresiensis, способных образовывать на поверхности вина пленку. Основными процессами при созревании вина под хересной пленкой являются окислительно-восстановительные и автолитические [Саенко Н.Ф., 1964].
Для процесса хересования характерно снижение содержания летучих кислот (до 90 %), нелетучих органических кислот (на 10- 30 %), общего и аминного азота, фенольных соединений, витаминов [Руссу Е.И., Мунтян Л.И., 1991]. Вместе с тем возрастает содержание некоторых органических кислот - гликолевой, фумаровой, щавелевой, а так же простых и сложных эфиров [Шур И.М., 1970]. Марсала - купажное вино, получаемое смешиванием в разных соотношениях исходных материалов: основного белого виноматериала, спиртованного или сульфититрованного сусла и спирта. Вина токайского типа получают из ягод винограда, пораженных "благородной гнилью", увяленных и заизюмленных на кустах. Токайские вина имеют полный, маслянистый вкус, с тоном ржаной корочки, аромат с тонами айвы или сушеной дыни. Малага - ликерное купажное вино. Готовят из смеси виноматериалов и сусел различной крепости, содержания сахара и цвета, с последующей выдержкой в полных бочках не менее 3 лет. Вина типа кагор готовят из красных сортов винограда с сахаристостью 22-26 %. Виноград перерабатывают по красному способу с нагреванием мезги до 55-75С. После самоохлаждения сусло подбраживают на мезге с последующим спиртованием до нужной крепости. Вина имеют полный, бархатистый вкус, с тонами шоколада и чернослива.
Хроматографические методы исследования
В работе показана и реализована возможность применения одного из современных хроматографических методов - ионоэксклюзионной хроматографии, для определения химического состава сусел, виноматериалов и виноградных вин. Хроматографическое определение органических кислот, Сахаров и многоатомных спиртов проводилось на жидкостных ионных хроматографах - "Цвет 3006" с кондуктометрическим детектором (Россия) и "Kontron instruments" (Италия) со спектрофотометрическим детектором "Kontron 430А" и насосом "Kontron 422".
Ввод пробы в хроматограф осуществлялся через шестиходовой кран-дозатор. Объем вводимой пробы в таком случае определяется объемом дозирующей петли в кране. В работе была использована дозирующая петля объемом 100 мкл. В ИЭХ максимально возможный объем петли - 100 мкл, минимально возможный - 50 мкл, так как чувствительность кондуктометрического детектора для меньших объемов не достаточна. Использование петель объемом более 100 мкл приводит к размыванию заднего и переднего фронтов хроматограммы.
Выбор сорбента основывается на том, что в ИЭХ, как правило, используют катионообменники высокой емкости с малой степенью сшивки, благодаря чему обеспечивается наилучшая диффузия внутри зерна. Малая степень сшивки позволяет сорбенту не зависимо от ионообменных групп сорбировать кислоты в молекулярной форме за счет необменных видов сорбции. Для ИЭХ, в основном, используют сорбенты, имеющие сшивку 2-5 %. Сшивка менее 2 % приводит к тому, что при рабочем давлении в колонке 25-100 ати сорбент обладает повышенной подвижностью, что отрицательно сказывается на хроматографическом разделении. Сшивка более 5 % для макропористых сорбентов не дает удовлетворительной селективности разделения.
Для хроматографического разделения в работе использовались следующие сорбенты: Aminex Q-15S (Bio Rad), Aminex H+ 50Wx4 (Bio Rad), AG-50Wx2 (Bio Rad), Aminex SB-Blend Q-60 (Bio Rad), Dowex-50Wx4 (Supelco), а так же фирменная колонка Aminex НРХ-87Н (Bio Rad).
Одновременное определение Сахаров, спиртов и органических кислот проводилось со спектрофотометрическим детектированием на хроматографе "Kontron instruments". Для разделения использовали фирменную колонку "Aminex НРХ-87Н" (Bio Rad), размером 7,8 300 мм, предназначенную для разделения кислот и Сахаров.
Качественное определение кислот, а так же Сахаров и многоатомных спиртов в винах, во всех исследованиях осуществляли по времени удерживания индивидуальных соединений, при этом концентрации модельного раствора и анализируемой пробы были примерно одинаковыми. В реальных объектах время удерживания отдельных предварительно идентифицированных соединений подтверждали методом добавок. При добавлении к определяемому соединению модельного аналога высота пика увеличивается в том случае, если они идентичны (пример: первый раз вводилось в хроматограф одно из вин, затем в 1 см3 этого же вина добавлялось несколько капель раствора яблочной кислоты и полученная смесь вводилась в хроматограф, по увеличению высоты соответствующего пика идентифицировалась яблочная кислота). В противном случае, на хроматограмме будет замечен дополнительный пик. Даже если два соединения имеют очень близкое время удерживания, при их смешивании на хроматограмме заметны два пика. В реальных образцах большинство пиков имело узкую симметричную форму. Определение концентраций кислот с таким хроматографическим профилем проводили сравнением высот пиков опытных образцов с высотами пиков модельной смеси. Для количественного определения сильноудерживаемых соединений (ароматические кислоты), дающих пики более широкой формы, проводили сравнение площадей пиков в реальном объекте с площадью пиков модельной смеси. При выбранных оптимальных условиях хроматографирования были построены градуировочные графики логарифмической зависимости концентрации определяемого соединения от высоты или площади хроматографического пика. На рис. 6 приведены градуировочные графики для некоторых кислот.Логарифмическая зависимость высоты (площади) хроматографическото пика от концнетрации (MI/ДМ куб.) для некоторых алифатических (условия построения - прибор "Цвет 3006", сорбент Aminex QI5S, колонка 8x300 мм; элюент - 5,0 мМ бензойная кислота, скорость подачи 0,7 смЗ/мин.) и ароматических (условия построения - прибор "Konlron inslrumonls", длина волны детектирования Х= 210 им, сорбент Aminex Q15S, колонка 6х 150 мм; злюент - 20,0 мМ серная кислота, скорость подачи 0,8 смЗ/мии) кислот-. Исследования проводили на хроматографе "Цвет-100" с пламенно-ионизационным детектором. Твердый носитель - хроматон N-AW-DMCS 0.20-0.25 мм, неподвижная фаза - полиэтиленгликоль-300, 15 % к массе наполнителя, колонка: длина - 3 м, диаметр - 0,041 м, температура термостата 75 С, температура испарителя - 150 С, расход гелия - 2,5 дм /ч, расход воздуха - 200 дм /ч, расход водорода - 2,5 дм/ч. Чувствительность режима соответствовала расчетной шкале по току (0-5) 10_nA,
Идентифицирование веществ проводили по времени удерживания, количественное определение - методом калибровочных кривых по площади пиков [Великая, Суходол, 1983]. Погрешность определения не превышала 5 %.
Хроматографические параметры и метрологические характеристики разделения органических кислот методом ИЭХ
Для оценки возможности применения ИЭХ для анализа виноградных вин и виноматериалов при подобранных оптимальных условиях были определены некоторые хроматографические параметры и метрологические характеристики [Сычев С.Н., 2000; Золотов Ю.А., 2002], представленные в таблице 10.
Эффективность хроматографической колонки размером 8 300 мм (определение алифатических кислот) варьировала для разных соединений от 555 до 1248 т.т. (теоретических тарелок), для колонки 6x150 мм (определение ароматических кислот) - от 490 до 1542 т.т. Как показывают приведенные в таблице 10 данные, не достигнуто полного разрешения следующих пар кислот с близкими временами удерживания: лимонной и винной, янтарной и уксусной, валериановой и галловой. Однако при анализе реального объекта пики указанных кислот хотя и не дают полного разделения ("до подошвы"), но и не перекрывают друг друга, что дает возможность их качественного и количественного определения.
Так же было установлено взаимное мешающее влияние для определения алифатических кислот. Исследование проводили как на модельных смесях пар кислот, так и на реальном объекте.
Взаимное мешающее влияние кислот с близкими временами удерживания возникает в тех случаях, когда концентрация (избыток) одной кислоты превосходит концентрацию другой. Было изучено влияние: винной кислоты на яблочную; яблочной на молочную и винную; молочной на яблочную и уксусную; уксусной на молочную. Было установлено, что определению винной кислоты не мешает 16-кратный избыток яблочной (для модельной смеси и реального объекта); определению яблочной - 80 кратный избыток винной и 100 кратный избыток молочной (модельный раствор), 15- кратный избыток винной и20-кратный избыток молочной (реальный объект); определение молочной кислоты не мешает 30-кратный избыток яблочной и 100-кратный избыток уксусной (модельная смесь), 8-кратный избыток винной и 16-кратный избыток уксусной (реальный объект); определению уксусной кислоты не мешает 30 кратный избыток молочной (модельная смесь), 6-кратный избыток молочной (реальный объект).
Полученные результаты показывают, что мешающее влияние кислот в модельной смеси и реальном объекте различны, что объясняется влиянием матрицы вина на хроматографическое разделение определяемых компонентов. Однако, в виноградных винах соотношения концентраций кислот, выходящих при хроматографическом разделении друг за другом, ниже, чем установленные мешающие значения, следовательно, отрицательное влияние кислот друг на друга практически отсутствует. Для определения возможности применения метода в анализах винодельческой продукции была проведена оценка воспроизводимости результатов анализа по высотам пиков кислот и по временам удерживания. Для этого пробы анализируемого вина вводились в хроматографическую систему 5 раз, при этом проводились измерения соответствующих величин. Полученные данные с последующей обработкой методами математической статистики занесены в таблицы 11, 12[ДерффельК., 1994]. Был произведен расчет погрешности метода ИЭХ. Контроль погрешности результатов измерений осуществляли с применением метода добавок, в сравнении разности рассчитанного ("введено") и практического ("найдено") содержания определяемой кислоты в двух винах с известной добавкой, а так же при разбавлении проб. В качестве добавки были использованы индивидуальные растворы каждой исследуемой кислоты. Концентрации индивидуальных растворов алифатических кислот составляли 1 г/дм , концентрации растворов ароматических кислот составляли 200 мг/дм . Разбавление вина проводили дистиллированной водой в 2 раза. При внесении добавки ее объем был равен объему вина. Результаты представлены в таблице 13. По полученным данным погрешность метода ИЭХ при оптимальных условиях для алифатических кислот колеблется в пределах 2,7-3,6 %, для ароматических кислот - 1,3-1,9 %. Таким образом, исходя из максимальных значений погрешности была принята следующая точность предлагаемого метода измерения: для алифатических кислот (при определении с кондуктометрическим детектированием) - 4 %, для ароматических кислот (спектрофотометрическое детектирование) - 2 %.
Для проверки точности определения концентраций алифатических кислот использовали анализ образцов независимыми методами. Результаты определения концентраций алифатических кислот в винах были проверены методом капиллярного электрофореза (для яблочной и янтарной кислот) и методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) (для уксусной, пропионовой и масляной кислот).
Разделение кислот методом капиллярного электрофореза (КЭФ) проводили с использованием системы "Капель-103" (НПФ АП "Люмэкс", Россия) при следующих условиях: ведущий электролит 20 мМ фосфатный буфер; ввод пробы гидродинамический, 20 сек; фотометрический детектор с фиксированной длиной волны 229 нм; напряжение 25 кВ; кварцевый капилляр 75 мкм, 60/70 см; температура 20С. Минимально определяемая концентрация кислот - 1 мг/дм3. Разделение кислот методом ГЖХ проводили на хроматографе "Chrom-5" (Чехия) с пламенно-ионизационным детектором. Колонка 1,1 м х Змм, заполненная силанизированным хромосорбом W с 6% неподвижной фазой SE 30. Начальная температура колонки 80 С, конечная 260 С. Газ-носитель гелий, скорость 40 см /мин.
Полученные результаты были проанализированы методами математической статистики. Из данных таблицы 14 следует, что расхождение между дисперсиями двух методов незначимо, F эксп F крит (F Крит= 6,4; Р=0,95, п =5) [Золотов Ю.А., 2000]. Так как t3KCn tKpMT (tKpi1T=3,36 при Р=0,99, f = 8), то расхождение между средними незначимо и можно считать две выборки результатов измерений независимыми методами одной выборочной совокупностью с числом результатов ni+n2=10, что подтверждает истинность данных, полученных методом ИЭХ.
Похожие диссертации на Оценка качества виноградных вин на основе определения органических кислот методом ионоэксклюзивной хроматографии
