Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 12
1.1 Особенности биотехнологического процесса как объекта оптимизации 12
1.2 Математическое моделирование микробиологических процессов 13
1.3 Оптимизация продолжительности цикла периодического процесса биосинтеза 21
1.4 Оптимальное управление процессами биосинтеза на основе математических моделей 24
1.5 Химический анализ как информационный процесс 30
1.6 Использование тонкослойной хроматографии 34
1.7 Постановка задач диссертационной работы 36
ГЛАВА 2. Описание метода тонкослойной хроматографии. примеры качественного и количественного методов детектирования 37
2.1 Использование метода ТСХ для анализа 37
2.2 Применяемое оборудование и материалы в исследовании 38
2.3 Проведение анализа методом тонкослойной хроматографии 41
2.3.1 Нанесение пробы и получение хроматограмм 41
2.3.2. Обзор методов детектирования в тонкослойной хроматографии 43
2.3.2.1 Электрохимические методы 43
2.3.2.2 Ядерно-физические методы 45
2.3.2.3. Оптические методы 46
2.4 Количественный анализ антибиотиков (эритромицинов) методом ТСХ 50
2.5 Количественный анализ пищевых красителей методом ТСХ 57
2.6 Выводы 58
ГЛАВА 3. Разработанная методика детектирования 59
3.1 Получение модели 59
3.2 Программно-технический комплекс, реализующий разработанную методику 67
3.2.1 Выбор цветовой составляющей 67
3.2.2 Созданное программное обеспечение «Chromatography» 69
3.3 Выводы 78
ГЛАВА 4. Обоснование предложенной методики. Результаты применения 79
4.1 Обоснование предлагаемой методики 79
4.2 Результат применения методики М9 для антибиотиков 83
4.3 Результат применения методики М9 для аминокислот 83
4.4 Результат применения методики М9 для Сахаров 87
4.4.1 Глюкоза 87
4.4.3 Мальтоза 90
4.5 Выводы 93
ГЛАВА 5. Адаптивное управление процессом биосинтеза лизина 94
5.1 Стадии процесса биосинтеза лизина 94
5.2 Автоматизация процесса биосинтеза 97
5.3 Технические решения, принятые при построении АСУТП биотехнологическим производством лизина 109
5.4 Оптимизация стадии окончания процесса биосинтеза 114
5.5 Выводы 119
Заключение 120
Список литературы 121
Список опубликованных работ 132
Приложения 133
- Математическое моделирование микробиологических процессов
- Применяемое оборудование и материалы в исследовании
- Созданное программное обеспечение «Chromatography»
- Результат применения методики М9 для аминокислот
Введение к работе
Получение таких продуктов, как антибиотики, ферменты, аминокислоты, кормовые белки, с использованием микробиологического синтеза широко применяется в современном производстве. Интеграция естественных и инженерных наук позволяет наиболее полно реализовать возможности живых организмов. Технология производства этих веществ хорошо отработана, получение их микробиологическим путём не только экономически выгодно, но и более безопасно, нежели с использованием химического синтеза.
Биотехнологические производства бурно развивались в СССР до середины 80-х годов, микробиологический синтез имел широкое распространение. После распада Советского Союза данная отрасль промышленности пришла в полный упадок. Только в конце 90-х годов начало возобновляться данное производство, ввиду возросшего интереса к различного вида белкам, аминокислотам и ферментам.
Среди комплекса основных задач, решаемых на биотехнологических производствах для обеспечения их эффективной и бесперебойной работы, особое место занимают задачи автоматизации как производства в целом, так и отдельных его участков. Основным образующим и энергоемким является отдел ферментации, состоящий из батареи аппаратов называемых биореакторами.
Назначением всякого биореактора (рис. 1.1) является создание оптимальных условий для жизнедеятельности культивируемых в нём клеток и микроорганизмов, а именно обеспечение аэрации, подвод питания и отвод метаболитов путём равномерного перемешивания газовой и жидкой-составляющих содержимого аппарата. Такие показатели как, рН, давление, концентрация растворенного кислорода рОг, температура являются косвенными показателями процесса биологического синтеза. Основным прямым параметром, объективно характеризующим ход процесса биосинтеза, является концентрация целевого вещества в культуральнои жидкости. Своевременная корректировка процесса с учётом оперативно получаемой информации об основных показателях состояния процесса позволит достичь оптимального соотношения между себестоимостью и качеством готовой продукции, решить чрезвычайно важную задачу экономии энергоресурсов за счет оптимизации всех стадий процесса. Обеспечить высокую скорость анализа продуктов биологического синтеза с необходимой точностью позволяет метод тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Рис. 1.1. Схема биореактора 1. Емкость; 2. Контур нагрева; 3. Механическая мешалка; 4. Подача воздуха; 5. Аэрация; 6. Порты; 7. Смотровые окна; 8. Выход воздуха; 9. Засев; 10. Отбор образцов; 11. Слив;
12. Залив среды
Метод ТСХ позволяет разделять до нескольких десятков компонентов и поэтому находит широкое применение для анализа состава продуктов микробиологического синтеза, которые представляют собой сложную смесь близко родственных по своей структуре веществ.
Важным достоинством ТСХ по сравнению со значительно более дорогостоящей колоночной хроматографией является возможность анализа загрязненных проб и, таким образом, резкое упрощение пробоподготовки при анализе реальных, в первую очередь природных, объектов [1].
Одним из основных способов детектирования в ТСХ, наряду с традиционными фотометрическим (в отраженном или проходящем свете) и флуориметрическим методами, возрастающую роль начинают играть масс-спектрометрические методы детектирования — главным образом с лазерной десорбцией-ионизацией. Для фотометрического детектирования все больше используется сканирующая лазерная денситометрия, в том числе с применением оптоволоконной техники.
Не менее важной задачей является подбор среды и сравнение эффективности различных штаммов на них. Для анализа полученных культуральных жидкостей также используется метод тонкослойной хроматографии.
Таким образом, для оптимального управления процессом биосинтеза в промышленных ферментёрах и проведения экспериментов на исследовательских установках необходимо иметь метод анализа культуральной жидкости на такие антибиотики, как эритромицины, низин; аминокислоты - лизин, лейцин, триптофан, серии; сахара - глюкоза, мальтоза, лактоза, обладающий следующими характеристиками: время анализа не должно превышать 1 час; одновременный анализ нескольких проб; не должно сказываться влияние примесей; способность определять наличие вещества в малых количествах, порядка 100 нг; погрешность анализа не должна превышать 5 %; низкая стоимость проведения анализа; простота проведения анализа.
Метод ТСХ вполне удовлетворяет всем заявленным требованиям, кроме точности анализа - в настоящее время методы детектирования обладают существенной погрешностью, что приводит к использованию ТСХ для полуколичественного или качественного анализа.
В соответствии с вышеизложенным и учитывая, что концентрация целевого вещества в культуральной жидкости является основным прямым параметром, одной из основных задач работы является усовершенствование методики экспресс-анализа в процессах биосинтеза методом тонкослойной хроматографии и её внедрение в структуру АСУТП сложным биотехнологическим производством на базе современной вычислительной техники.
В данной работе будет рассмотренно применение усовершествованного метода детектирования анализа при помощи тонкослойной хроматографии для управления процессом биосинтеза аминокислот на примере L-лизина. Аминокислоты — это любые органические кислоты, в состав молекулы которых входит аминогруппа, хотя чаще всего под этим названием подразумевают а-аминокислоты вследствие их исключительного значения как составляющей части биополимеров — белков. Незаменимыми называются а-аминокислоты, которые не могут быть синтезированы организмом из веществ, поступающих с пищей в количествах, необходимых для поддержания жизнедеятельности. К незаменимым для человека аминокислотам относятся лейцин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин.
По химическим свойствам лизин - а-аминокислота с сильными основными свойствами, обусловленными є-аминогруппой. С кислотами дает два ряда солей, например с соляной кислотой — гидрохлорид и дигидрохлорид. Образует нерастворимые соли с пикриновой и фосфорномолибденовой кислотами. н н L-лизин (рис. 1.2) - необходимый компонент пищи для м"~^—сч человека и животных (незаменимая аминокислота). н сн2 он
Встречается во всех организмах в составе молекул белков и сн2 пептидов, входит в состав активных центров ферментов,
I 2 например аминотрансфераз в больших количествах содержится в гистонах и протаминах. Его содержание в Рис. 1,2. Структурная продуктах (на сухую массу) составляет: в пшеничной муке формула 159%, говядине 10%, коровьем молоке 8,7%. Биосинтез лизина: L-лизина из аспарагиновой и пировиноградной кислот через 2,6-диаминопимелиновую кислоту (декарбосилирование которой приводит к L-лизину) или из а-аминоадипиновой кислоты; последняя образуется также при распаде L-лизина в организме.
Получают L-лизин микробиологически или из гидролизатов белков путем осаждения в виде пикрата. Синтетически лизин получают аминированием а-галогенкапролактама. В спектре ПМР L-лизин в D20 химические сдвиги (в м.д.) 3,762 (а-Н), 1,91 ф-Н), 1,393 (у-Н), 1,732 (8-Н), 2,649 (є-Н). Лизин применяют как кормовую добавку для восполнения дефицита этой аминокислоты в растительных белках; используют также в синтезе пептидов, в смеси с другими аминокислотами — для составления питательных сред.
Несмотря на большую историю промышленного биосинтеза лизина, предлагаются новые технологические способы улучшения технологии синтеза, выделения и очистки лизина. Например, в работе [21] разработан метод получения L-лизина гидрохлорида, пригодного для использования в качестве пищевой добавки, а также способ электродиализной конверсии гидрохлорида лизина в лизин основной. Приведены испытания, по добавлению лизина гидрохлорида в муку и хлеб при выпечке, которые показали повышение биологической ценности муки и хлеба. Для оптимизации разработанных мембранно-сорбционных технологий очистки и концентрирования аминокислот на основе теоретических и экспериментальных разработок получены сведения о механизмах процессов, происходящих в электромембранных системах, включающих в себя растворы аминокислот. Разработаны новые методики и построены адекватные математические модели.
Использование широко распространенной компьютерной техники позволяет существенно улучшить традиционные методы химического анализа, повысить его точность и оперативность. Используя более точные данные о ходе процесса возможно его моделировать и рассчитывать оптимальные расходы подпиток и время их внесения, время передачи ферментационной среды на стадию выделения, что позволит уменьшить расходы на исходные субстанции, снизить нагрузку на системы нано- и ультрафильтрации, уменьшить расход воды и реагентов на их чистку и регенерацию.
Математическое моделирование микробиологических процессов
Получают L-лизин микробиологически или из гидролизатов белков путем осаждения в виде пикрата. Синтетически лизин получают аминированием а-галогенкапролактама. В спектре ПМР L-лизин в D20 химические сдвиги (в м.д.) 3,762 (а-Н), 1,91 ф-Н), 1,393 (у-Н), 1,732 (8-Н), 2,649 (є-Н). Лизин применяют как кормовую добавку для восполнения дефицита этой аминокислоты в растительных белках; используют также в синтезе пептидов, в смеси с другими аминокислотами — для составления питательных сред.
Несмотря на большую историю промышленного биосинтеза лизина, предлагаются новые технологические способы улучшения технологии синтеза, выделения и очистки лизина. Например, в работе [21] разработан метод получения L-лизина гидрохлорида, пригодного для использования в качестве пищевой добавки, а также способ электродиализной конверсии гидрохлорида лизина в лизин основной. Приведены испытания, по добавлению лизина гидрохлорида в муку и хлеб при выпечке, которые показали повышение биологической ценности муки и хлеба. Для оптимизации разработанных мембранно-сорбционных технологий очистки и концентрирования аминокислот на основе теоретических и экспериментальных разработок получены сведения о механизмах процессов, происходящих в электромембранных системах, включающих в себя растворы аминокислот. Разработаны новые методики и построены адекватные математические модели.
Использование широко распространенной компьютерной техники позволяет существенно улучшить традиционные методы химического анализа, повысить его точность и оперативность. Используя более точные данные о ходе процесса возможно его моделировать и рассчитывать оптимальные расходы подпиток и время их внесения, время передачи ферментационной среды на стадию выделения, что позволит уменьшить расходы на исходные субстанции, снизить нагрузку на системы нано- и ультрафильтрации, уменьшить расход воды и реагентов на их чистку и регенерацию.
В настоящее время основную номенклатуру продуктов микробиологического синтеза получают с помощью периодических процессов ферментации (ГШФ), которые являются наиболее массовыми объектами управления в медицинской и микробиологической промышленности. Основными причинами, вынуждающими использовать в промышленных условиях менее экономичный периодический процесс ферментации, являются невозможность поддержания ауксотрофной монокультуры, равно как и обеспечение асептики в течение длительного времени. (аминокислоты, антибиотики), либо сравнительно небольшие объемы производства и необходимость частой перестройки процесса для получения разных продуктов (ферментные препараты). Высокие требования предъявляются к надежности и эффективности функционирования оборудования биотехнологического синтеза. В этих условиях является необходимым применение автоматизированных систем управления ГШФ, построенных на основе управляющей вычислительной техники. Одной из главных особенностей ГШФ по сравнению, например, с химико-технологическими процессами, является их низкая воспроизводимость, обусловленная наличием биологического действующего начала. Из-за этого применение традиционных автоматических систем регулирования- и программного управления ГШФ во многих случаях оказывается недостаточно эффективным. Существенная нестабильность хода ферментации, вызванная влиянием целого ряда факторов, является преградой к получению математического описания, пригодного для целей автоматического управления. Последнее обстоятельство обусловливает необходимость корректировки параметров модели для каждого конкретного процесса. Управление объектами с изменчивыми свойствами осуществляется с применением адаптивных систем управления, которые учитывают характеристики конкретной популяции микроорганизмов, сформировавшейся в данном ППФ, и позволяют с наибольшим эффектом использовать ее потенциальные возможности. Система обеспечения процесса культивирования представляет собой сумму технических устройств, обеспечивающих поддержание (или изменение по заданной программе) выбранных условий культивирования. Система информации - необходимое звено для реализации обратной связи при ведении технологического процесса — включает в себя датчики, средства преобразования сигналов и устройства для проведения анализов. Взаимодействие этих двух систем может осуществляться либо в замкнутом контуре (частично или полностью), либо с участием, в качестве элемента системы, оператора. В последние годы наблюдается большое число публикаций, монографий, учебных пособий и справочников по проблемам биотехнологических производств, написанных авторами из Японии, Индии и Китая, см., например, работы [111, 115]. Развитие математического моделирования микробиологических процессов позволило поставить и решить ряд теоретических и практических задач. Для описания скорости роста биомассы используется такая характеристика, как общая скорость роста - Qx. Больший интерес для характеристики интенсивности роста представляет не величина Qx, а удельная скорость роста в пересчете на единицу биомассы (рост биомассы пропорционален концентрации клеток). Она обозначается ц\ Первым и важнейшим результатом, полученным в этой моделирования, следует считать создание модели роста Моно [26], см. табл. 1.1. В этом уравнении [лт — максимальная удельная скорость роста микроорганизмов при S —кх , Ks -константа полунасыщения, численно равная концентрации субстрата, при которой /л = 1/2 //„,. Модель Моно не всегда соответствует реальным процессам, но позволяет оценить наиболее общие закономерности непрерывного культивирования. Благодаря простоте этой модели удалось получить наглядные формулы, описывающие зависимость концентраций биомассы и лимитирующего субстрата и продуктивности от скорости подачи питательных веществ в биохимический реактор — ферментёр. Оказалось возможным по данным периодического процесса переходить к непрерывному. Такой переход был бы невозможен без применения математических моделей и теории непрерывного культивирования, хотя в некоторых случаях потребовалось определенное усложнение моделей по сравнению с моделью Моно. А. Мозер [106] предложил уравнение, содержащее кинетический коэффициент К, представляющий число молекул субстрата, вступающих в реакцию на ферменте с образованием одной молекулы продукта. При К 1 уравнение позволяет учесть S-образный характер зависимости /л от S, а при К 1 - наоборот, более крутую зависимость ц от S при малых значениях концентрации субстрата; при К = 1 уравнение Мозера превращается в зависимость Моно.
Применяемое оборудование и материалы в исследовании
Существует ряд работ 70-х-80-х г.г. [100, 60, 51], в которых рассматриваются вопросы определения оптимальной длительности цикла процесса биосинтеза с учётом текущих значений показателей процесса — концентрации накопленного продукта и т.д. В частности, отмечается, что определение длительности периодического процесса целесообразно проводить из соображений технико-экономической эффективности. Чрезмерное затягивание процесса, так же как и его слишком раннее прекращение, приводит к непроизводительному использованию оборудования и повышению себестоимости продукции. В работе [86] указан способ определения оптимальной продолжительности ферментационного процесса, заключающийся в том, что на основании кривой изменения концентрации целевого продукта во времени строится кривая изменения его себестоимости и определяется длительность процесса, соответствующая минимуму себестоимости. Из-за значительных колебаний концентраций продукта от ферментации к ферментации возникает необходимость оперативного определения момента окончания для каждой конкретной загрузки. Для этого предполагается, имея текущую информацию о ходе процесса, экстраполировать зависимость себестоимости от времени. В работе [60] предполагается в качестве критерия оптимальности использовать прибыль от проведения серии ферментации в аппарате, что может дать лучшие экономические результаты, т.к. может оказаться выгодным не доводить до конца ферментации, в которых темп накопления целевого продукта значительно ниже, чем в «среднестатистической» загрузке. В работе В.В. Бирюкова, В.М. Кантере и Л.Е. Шнайдера [100] обобщается указанный подход к оптимизации на различные виды показателей эффективности и приводится алгоритм оперативного определения оптимального момента окончания периодического процесса, который легко адаптируется к разным критериям. Отмечается, что экспериментальные значения показателей хода процесса поступают с неизбежными ошибками и поэтому необходима их коррекция, для чего предлагается использовать алгоритмы линейного сглаживания.
В работе [51] дан анализ периодических процессов ферментации как объектов оптимального управления в реальном масштабе времени. Рассмотрена структура прибыли, как обобщающего технико-экономического показателя эффективности производственного процесса. Показано, что для производств, у которых при фиксированной цене продукции себестоимость снижается с увеличением производительности, прибыль растет с ростом производительности. Отмечено, что к таким производствам относится производство кормового концентрата лизина (ККЛ) и что для подобных производств в качестве глобального критерия оптимального управления может быть принята производительность. Поскольку целевой продукт образуется только на стадии ферментации, ее производительность совпадает с общей производительностью всего технологического комплекса (с учетом потерь на послеферментационных стадиях). С другой стороны, для технологических схем последовательной структуры, характерных для биотехнологического производства, общая производительность ограничена пропускной способностью стадии - «узкого места» производства, положение которой изменяется в зависимости от складывающейся производственной ситуации. Предполагая, что стадия ферментации является «узким местом» производства, где М - число активных биореакторов на плановом отрезке времени Г; gj - количество целевого продукта, синтезированное в 1-ом цикле обращения биореактора продолжительностью tf, Ui — управляющее воздействие, применяемое в 1-ом цикле обращения биореактора; N - число циклов обращения биореактора за плановый период, определяемое из соотношени Если «узким местом» производства является одна из послеферментационных стадий, то задача (1.10) дополняется следующим условием согласования производительности стадии ферментации с пропускной способностью узкого места: где V] - объём культуральнои жидкости, сливаемой из биореактора после завершения і-го цикла его обращения; F — пропускная способность стадии «узкого места» производства, пересчитанная на расход культуральнои жидкости.
Анализ целевой функции и состава вектора управляющих воздействий позволяет провести декомпозицию глобальной задачи (1.10)-(1.11) оптимального управления на четыре локальных задачи: управления вспомогательными стадиями цикла обращения биореактора; - координация работы биореакторов связанных общим сливным коллектором по минимизации внеплановых простоев при разгрузке; - оптимального управления отдельными процессами ферментации заданной продолжительности с учетом их индивидуальных особенностей; - определения оптимальной продолжительности процессов (задача координации). В качестве решения задач в работе [51] приводится сводный алгоритм оперативного управления работой технологического комплекса биореакторов циклического действия, который включает алгоритмы: 1. согласования производительности стадии ферментации с пропускной способностью стадии — узкого места производства; 2. оптимального управления текущими процессами ферментации на основе их оперативной классификации по индексу индивидуальных свойств; 3. координация работы биореакторов, связанных общим сливным коллектором; 4.координации работы посевных аппаратов и производственных биореакторов. Однако, во всех рассмотренных работах отмечается, что применение предлагаемых алгоритмов затруднено высокими погрешностями анализов культуральной жидкости на содержание целевого продукта. Кроме того, в указанных работах основное внимание сосредоточено на начале процесса биосинтеза, окончание процесса (доведение показателей ферментационной среды до требуемых для передачи на переработку показателей, алгоритма слива и т.д.) рассматривается недостаточно развёрнуто.
Созданное программное обеспечение «Chromatography»
В настоящей работе было обнаружено, что усовершенствовав этапы 5 и 6 анализа («Конечное определение» и «Оценка содержания определяемого компонента по калибровочной зависимости») можно перевести существенную часть погрешности из типа 3 в тип 2 и успешно её устранить.
В настоящее время для анализа различных биологических субстанций, в медицине активно используются биосенсоры. Они появились сравнительно недавно, см. монографию [14], но успешно применяются во многих областях медицины и биологии [42]. Например, в работе [5] разработана автоматизированная многоканальная биосенсорная установка на основе иммобилизованных микроорганизмов Gluconobacter oxydans и Pichia angusta для селективной оценки содержания глюкозы, метанола и этанола в смеси этих веществ. Применение технологии искусственных нейронных сетей для обработки экспериментальных данных позволило осуществить селективный анализ в диапазоне концентраций от 1,00 до 5,00 мМ по каждому из аналитов. Проведен анализ модельных смесей и реальных проб десертных вин. Показано, что при обработке данных с использованием нейронных сетей относительная ошибка определения концентрации компонентов находится в пределах 2-33% при оптимальной конфигурации сети. Данный метод предлагается для использования в биотехнологических процессах при производстве алкогольной продукции. Однако, как уже упоминалось, использование биосенсоров в промышленной биотехнологической практике сильно ограничено рядом факторов - они, как правило, не переносят режимов, стерилизации, обладают ограниченным сроком непрерывной работы (часы), ограничена номенклатура детектируемых соединений.
Интересным направлением является стабилизация показателей качества продукции, которые определяются с большим запаздыванием и погрешностью, на основе кластерного анализа и алгоритмической обработки множества параметров, косвенно влияющих на протекание процесса. Например, в работе [71] такой подход применяется для управления процессом стерилизации ПЭТ-бутылок с помощью озона.
Для контроля биологических свойств в последнее время часто предлагается использовать оптические методы — этому способствует распространённость и доступность довольно совершенной цифровой фото- и видеотехники, которая легко сопрягается с компьютером. В работах [45, 46] разработан оптический метод контроля биологической активности растворов ионного серебра и создана автоматизированная система контроля биологической активности растворов ионного серебра, используемых при создании лекарственных препаратов. В работе [73] предлагается метод автоматизированного измерения зерна микроструктуры топливных таблеток. В работе [98] предлагается использовать сканер и программу растровой обработки изображений для количественного определения сорбированных веществ.
В целом, обзор публикаций профильных журналов - «Автоматизация в промышленности» [117], «Современные технологии автоматизации» [123], «Автоматика и телемеханика» [124], Biotechnology Progress [127], «Приборы» [128], «Экологические системы и приборы» [133], «Промышленные АСУ и Контроллеры» [134], «Приборы и системы. Управление, контроль, диагностика» [135] показал интерес научной общественности к выбранной области исследования и не позволил найти разработки, помогающие решить сформулированные задачи работы. Обзор сайтов компаний и научно-исследовательских организаций, занимающихся проблемами биотехнологии, химическими анализами, разработкой аналитического оборудования [116, 118, 119, 121, 122, 125, 126, 130, 131] также не позволил выявить готовые решения и разработки для решения поставленных задач.
Тонкослойная хроматография широко используется для обзорного анализа в химических, производственных, медицинских, фармацевтических, биохимических и биологических лабораториях. Хотя в последние годы число публикаций по ТСХ невелико по сравнению с другими хроматографическими методами, но новые работы появляются достаточно регулярно, например, в работе [28] представлены результаты поиска оптимальных подвижных и неподвижных фаз, позволяющих осуществить эффективное отделение антибиотиков от сопутствующих им примесей, присутствующих в культуральной жидкости, методом тонкослойной хроматографии. Приведены разработанные в ГосНИИгенетика валидированные методики разделения и определения антибиотиков тилозина, вирджиниомицина и биалофоса, выполненные с помощью количественной тонкослойной (отечественные ТСХ-пластинки Сорбфил) и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Метод ТСХ может рассматриваться как модифицированный вариант колоночной жидкостной хроматографии. Очень часто эксперименты по тонкослойной хроматографии являются предварительным этапом разработки методик колоночной хроматографии, поскольку они более просты в выполнении и позволяют за короткое время опробовать большое число подвижных фаз и разнообразные условия разделения.
Анализ исследуемых соединений в ТСХ складывается из нескольких этапов: введения пробы в тонкослойную хроматографическую систему, разделения компонентов на тонком слое сорбента, качественной и количественной оценки результатов анализа. Детектирование в ТСХ осуществляется или непосредственно на слое (после окончания или в ходе процесса разделения), или после извлечения анализируемых веществ из слоя сорбента в газообразную или с помощью растворителей в жидкую фазу [12].
В тонкослойной хроматографии используют те же неподвижные фазы, что и в соответствующих методах колоночной ВЭЖХ — адсорбционной, распределительной (нормально-фазовой и обращенно-фазовой), ионообменной, молекулярно-эксклюзионной. Слой тонко измельченного носителя наносят на пластинки размерами 5x10, 10 х 20 или 20 х 20 см. Для стандартных пластинок толщина слоя носителя составляет 200-250 мкм, а размеры частиц носителя — 20 мкм и более. При длине разделяющего пути 12 см число теоретических тарелок может достигать 2000, а время разделения составлять порядка 25 мин.
Результат применения методики М9 для аминокислот
Одним из основных электрохимических методов является полярографический метод, основанный на измерении силы тока изменяющейся в зависимости от приложенного напряжения, в условиях, когда один из электродов имеет малую поверхность (поляризующийся электрод), а другой - большую (неполяризующийся электрод). Поляризующим катодом могут быть капли ртути, вытекающие из тонкого отверстия капиллярной трубки, а так же платиновый (вращающийся), графитовый, серебряный и другие. В полярографическую ячейку для количественного детектирования зоны анализируемого вещества можно переносить, не извлекая их со слоя сорбента. В этом методе сорбент не должен мешать полярографическому анализу, размер частиц подбирают такой, чтобы раствор электролита диффундировал через слой без затруднений. Недостаток этого метода - относительно высокая трудоемкость и длительность анализа: необходимость хорошего разделения анализируемых веществ и их локализации на слое сорбента.
Полярографические детекторы для ТСХ чувствительны к растворенному кислороду, в связи с чем его удаляют, предварительно продувая анализируемую пробу азотом. Показания детектора зависят также от природы электролита, особенностей хроматографической системы, скорости потока элюата и приложенного напряжения. Поэтому необходимо выбирать оптимальные условия анализа и поддерживать их постоянными. Для получения лучших результатов необходимо минимизировать мертвый объем детектора и по возможности уменьшить расстояние между электродами.
По сравнению с другими электрохимическими методами полярографический метод в ТСХ можно характеризовать как высокочувствительный, универсальный и селективный. В качестве другого количественного электрохимического метода используют различные варианты кондуктометрии. Кондуктометрия основана на измерении электропроводности анализируемых растворов, зависящей от природы электролита, его температуры и концентрации. Измерения можно проводить двумя методами: при постоянном напряжении на электроде и при включении измерительной ячейки в цепь переменного тока. В последнем случае различают низко- и высокочастотный методы. Низкочастотным методом анализируют растворы электролитов и неэлектролитов, которые образуют ионизованные комплексы (например, бораты Сахаров) а также непроводящих веществ в проводящих растворителях. В этом методе применяют токи частотой от 60 до 1000 Гц. Чувствительность метода ограничена помехами, возникающими вследствие колебания температуры из-за изменения проводимости раствора. Подобные колебания превышают подчас изменения температуры, вызванные вариацией состава раствора. Высокочастотный метод можно использовать для определения непроводящих, но поляризующих веществ. Он удобен тем. что можно не осуществлять прямого контакта электродов с определяемыми веществами: определяемое вещество, проходя между электродами, играющими роль обкладок конденсатора в контуре радиочастотного осциллятора, поглощает энергию, что приводит к изменению частоты колебаний. Этот метод использовали для определения различных органических веществ, в частности карбоновых кислот. Кулонометрический метод основан на измерении количества электричества, израсходованного на электролиз определяемого вещества при постоянном потенциале, который соответствует потенциалу выделения данного элемента. Для количественного определения должны отсутствовать вторичные реакции. Кулонометрические детекторы применяют в основном для детектирования состава растворов, полученных вымыванием анализируемых веществ из слоя сорбента. Метод отличается высокой точностью [12]. Потенциометрический метод основан на измерении потенциала электрода, погруженного в раствор, в зависимости от концентрации и температуры определяемой смеси. С помощью этого метода можно анализировать растворы, получающиеся после жидкостного извлечения вещества из слоя сорбента. Потенциометрия стала широко применяться после разработки ионоселективных электродов, позволяющих определять вещества с высокой селективностью и низким пределом обнаружения. Несмотря на все достоинства электрохимических методов, их не применяют пока широко в лабораторной практике для количественной оценки тонкослойных хроматограмм. но со временем, по-видимому, они будут использоваться наравне с оптическими и ядерно-физическими методами детектирования. Ядерно-физические методы детектирования в ТСХ основаны на регистрации элементарных частиц, испускаемых во время самопроизвольного распада неустойчивых изотопов одних химических элементов и превращения их в изотопы других элементов. Данные методы характеризуются высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью. С помощью меченых соединений можно эффективно оценивать хроматографические методики. Ядерно-физические методы детектирования можно использовать применительно к радиоактивным веществам. Для количественной оценки нерадиоактивных веществ в их состав нужно вводить радиоактивные метки или превращать эти вещества в радиоактивные. Ряд разновидностей описываемого метода требует значительных затрат времени в связи со статистическим характером радиоактивного распада. Сорбент, растворители, материалы подложек и самих детекторов не должны содержать радиоактивных веществ. В ряде случаев, возможно разложение самого анализируемого вещества под воздействием элементарных частиц. Однако, указанные методы детектирования характеризуются очень низким пределом обнаружения и высокой воспроизводимостью [97]. Предел обнаружения изменяется от метода к методу и в каждом из методов зависит от энергии элементарных частиц, условий хроматографического анализа и особенностей детектирующей системы. Оптические методы детектирования в ТСХ основаны на регистрации взаимодействия электромагнитного излучения с исследуемым веществом. Это взаимодействие можно рассматривать как процесс получения сигналов, содержащих качественную и количественную информацию о свойствах исследуемого вещества. Работа аппаратуры, используемой для оптического детектирования в ТСХ основана на следующем принципе: монохроматическое излучение пропускают через зону анализируемого вещества на тонком слое сорбента, соотношение интенсивностей падающего и регистрируемого (отраженного, прошедшего сквозь ТСХ-систему. флуоресцентного или получившегося в результате гашения флуоресценции) излучения фиксируется приборами. В ряде случаев также учитывается соотношение частот излучений. Оптические методы детектирования в ТСХ характеризуются высокой чувствительностью, многообразием способов осуществления и их комбинаций, возможностью качественного и количественного определения большого числа различных веществ [12].
Похожие диссертации на Управление процессом биосинтеза лизина с использованием контроля состава методом тонкослойной хроматографии
