Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы по проблеме регулирования метаболизма в клетках дрожжей s.cerevisiae 8
1.1.Энергетический обмен дрожжей 8
1.1.1 Гликолиз 8
1.1.2.Спиртовое брожение 9
1.1.3 .Аэробный метаболизм углеводов 10
І. ІАПастеровский эффект и механизмы его регулирования 11
1.1.5. Эффект Кребтри 13
1.2 Конструктивный обмен дрожжей 15
1.2.1. Углеводный обмен 15
1.2.1.1 Метаболизм углеводов дрожжами в процессе хлебопечения 18
1.2.2.0бмен азота 21
1.2.3 Минеральный обмен дрожжей 25
1.2.4.Витамины 26
1.3 Физико-химические параметры процессы, влияющие на метаболизм дрожжей 29
1.3.1 Влияние тоничности среды (осмотического давления) на микроорганизмы 29
1.3.2 Роль температуры и длительность процесса дозреваняи дрожжей 33
1.3.3.Влияние этилового спирта на дрожжи 35
1.3.4. Влияние рН-значение интенсивности колебаний 37
1.3.5 .Стрессы, преодолеваемые дрожжами в дрожжерастительном процессе 38
2. Объекты, материалы и методы исследования.40
2.1. Характеристика штаммов дрожжей 40
2.2.Материалы 40
2.2.1. Показатели качества мелассы 40
2.3 .Методы исследования 41
2.3.1. Методы определения физиологического состояния дрожжей 41
2.3.1.1. Определение состояния клеток (жизнеспособность) путем окрашивания метиленовым синим 41
2.3.2. Определение ферментативной активности дрожжей по интенсивности выделения СОг 43
2.3.2.1.Определение бродильной активности дрожжей газометрическим методом 43
2.3.3. Оценка интенсивности потребления Сахаров по скорости снижения коннцентрации ионов Н* в среде 45
2.3.4.Методика рассчета технологических режимов культивирования 46
2.3.5. Определение коэффициента прироста биомассы дрожжей 49
2.3.6. Определение экономического коэффициента (выход биомассы) 49
2.3.7. Определение содержания сухих веществ в клетках дрожжей 50
2.3.8. Определение содержания трегалозы в клетках 50
2.3.9. Определение количества растворенного в среде
кислорода 53
2.3.10. Статистическая обработка результатов опытов 53
З.Результаты и их обсуждение 54
3.1. Исследование влияния интенсивности аэрирования культуральной жидкости на метаболизм дрожжей 54
3.1.1. Бесприточный способ 54
3.1.2. Культивирование дрожжей в КСИА 61
3.2. Культивирование дрожжей с притоком питательных компонентов 63
3.2.1. Взаимосвязь метаболизма биотина и аэрации 63
3.2.2. Исследование влияния интенсивности аэрации на метаболизм дрожжей в аппарате с трубчатой воздухораспределительной системой 66
3.3. Исследование влияния тоничности среды на рост и бродильную активность хлебопекарных дрожжей 73
3.3.1. Простая периодическая культура 74
3.4. Исследование влияния обработки дрожжей поваренной солью на содержание сухих веществ в клетках 80
3.4.1.Исследование влияния поваренной соли на жизнеспособность дрожжей 80
3.4.2. Влияние поваренной соли на содержание сухих веществ в клетках и их бродильную активность 82
3.5. Влияние перепада температуры при культивировании дрожжей на их бродильную активность 88
4. Разработка технологии дрожжей, направленной на повышение выхода и бродильную активность клеток 93
4.1. Анализ технологии накопления биомассы хлебопекарных дрожжей, применяемой в АСР 93
4.1.1.Анализ технологии чистой культуры 93
4.2. Разработка технологии выращивания чистой культуры с высоким выходом биомассы 95
4.2.2. Технология чистой культуры для непосредственного использования в товарной стадии 97
4.3 .Технологическая схема выращивания товарных дрожжей в концентрированной среде, направленная на повышение бродильной активности 100
4.4. Повышение бродильной активности дрожжей 102
Выводы 103
Список литературы
- ІАПастеровский эффект и механизмы его регулирования
- Влияние тоничности среды (осмотического давления) на микроорганизмы
- Определение ферментативной активности дрожжей по интенсивности выделения СОг
- Культивирование дрожжей с притоком питательных компонентов
Введение к работе
Актуальность работы В настоящее время в Арабской Сирийской Республике (АСР) наблюдается интенсивный рост всех отраслей промышленности, в том числе и пищевой.
В частности, увеличивается выпуск и ассортимент хлебобулочных изделий, для изготовления которых требуется хлебопекарные дрожжи с высокой бродильной активностью. Это влечет за собой необходимость строительства новых заводов по выпуску коммерческих дрожжей и разработки более эффективных технологических схем, направленных на повышения выхода и качества выпускаемой продукции.
Существующие в АСР технологии характеризуются необоснованно длительным процессом накопления биомассы, особенно на первых стадиях технологического процесса, это сказывается на снижении общего выхода биомассы.
В России в течение последних 30 лет ведущими специалистами отрасли Палагиной Н.К., Розмановой Н.В. и Мелединой Т.В. даны подходы к разработке эффективных режимов культивирования дрожжей, однако в этих исследованиях нет сведений о влиянии различных стрессов на метаболизм дрожжей, которые претерпевают дрожжи в процессе выращивания и выделения их на брожении.
Поэтому исследования различного рода воздействий на дрожжи, таких как кислород, тоничность среды, колебания температур и разработка эффективной технологии выращивания дрожжей, учитывающей эти стрессовые факторы, является актуальной задачей. Цели и задачи исследований Целью работы являлось исследование влияния параметров процесса культивирования на закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей в аппаратах разной конструкции и разработка высокоэффективных технологий накопления биомассы.
Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:
исследовать влияние резких колебаний кислорода воздуха при выращивании дрожжей на их рост и размножение, а также бродильную активность клеток;
исследовать влияние тоничности среды на интенсивность размножения дрожжей в простой периодической культуре, и периодической культуре с притоком питательных компонентов и их бродильную активность;
изучить процессы, происходящие при искусственном повышении сухих веществ в клетках дрожжей;
исследовать влияние резких колебаний температуры при выращивании дрожжей на их рост и размножение, а также бродильную активность клеток;
разработать технологию хлебопекарных дрожжей с высокой бродильной активностью с учетом их реакции на стрессовые факторы.
Научная новизна.
- установлено, что при культивировании дрожжей по бесприточному
способу, на выход биомассы большее влияние оказывает кратность
разбавления мелассы, в то время как удельный расход воздуха имеет
второстепенное значение;
- показана взаимосвязь между концентрацией биотина в среде и удельным
расходом воздуха при культивировании дрожжей с притоком питательных
компонентов в регулировании выхода дрожжей и их бродильной
активности; - установлена взаимосвязь между физиологической
активностью клеток и стрессами, вызванными повышением тоничности
среды, концентрацией этанола в простой периодической культуре,
перепадом температур при культивировании дрожжей с притоком
питательных компонентов и обработкой коммерческих дрожжей
раствором хлорида натрия.
7 Практическая значимость. На основании изученных закономерностей размножения дрожжей разработана технология чистой культуры и коммерческих дрожжей, применение которой по сравнению с существующим в АСР регламентом, позволяет сократить число стадий, увеличить выход биомассы, снизить расход сырья на единицу продукции и сократить длительность процесса накопления биомассы дрожжей. Составлена технологическая инструкция по выращиванию чистой культуры и товарных дрожжей, которая прошла испытания на стендовой установке в лаборатории микробиологии, биохимии и технологии дрожжей Санкт-Петербургского института управления и пищевых технологий.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы, содержащего 106 источников. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста, 52 иллюстрации и 23 таблицы.
ІАПастеровский эффект и механизмы его регулирования
Регулирование эффекта Пастера на энергетическом уровне Повышение уровня АТФ в клетках приводит к замедлению скорости реакции превращения Ф-6-Ф (фруктозо-6-фосфата) во Ф-1,6-дифосфат, катализируемой ферментом фосфофруктокиназой. И, наоборот, АМФ ускоряет скорость этой реакции.
Регулирование эффекта Пастера на субстратном уровне Регулирование эффекта Пастера на субстратном уровне можно рассматривать с точки зрения влияния на активность фосфофруктокиназы ацетил -КоА и оксалоацетата - с одной стороны, и цитрата - с другой. При этом большое значение имеет биотин, цинк, витамины В Вз. Недостаток этих компонентов в среде приводит к снижению скорости синтеза ацетил-КоА, следовательно, замедлению скорости образования цитрата, исходного компонента НТК.
Синтезируемый цитрат представляет собой второй аллостерический (по принципу обратной связи) регулятор активности фосфофруктокиназы (ФФК): увеличение уровня цитрата в дрожжах приводит к торможению активности ФФК [20,79]. Академик Энгельгард доказал, что именно цитрат является тем основным регуляторным фактором, который вызывает пастеровский эффект у дрожжей.
Еще одним активатором ПЭ является кислород. Так, в присутствии ( пировиноградная кислота (ПВК) преимущественно превращается в Ац-КоА, т.к. пируватдегидрогеназа имеет более выраженное сродство к пирувату, чем пируватдекарбоксилаза.
Особенностью метаболизма сахаромицетов является наличие у них эффекта Кребтри, суть которого заключается в том, что, несмотря на интенсивную аэрацию, в среде с высокой концентрацией сахара часть субстрата сбраживается на спирт, т.е. имеет место «аэробное брожение». Эффект Кребтри - обратное явление пастеровскому эффекту. Этот процесс также называют глюкозной или катаболитной репрессией [16] , при этом действуют одновременно оба энергетических пути, и в зависимости от массовой доли и природы углевода в среде, выход биомассы изменяется в широких пределах.
Для S.cerevisiae установлено, что при концентрации глюкозы (фруктозы) в среде более 0,1% [41], по другим источникам - более 0,4% [106], а галактозы - более 0,5% наблюдается репрессия синтеза ферментов ЦТК [41], цитохромов и ферментов дыхательной цепи, даже при отсутствии лимита по кислороду. Во время катаболитной репрессии наблюдается деградация митохондрий, количество их уменьшается в 3-5 раз, кроме того, изменяется их морфология: увеличивается размер и исчезают кристы. Эффект Кребтри на глюкозе и фруктозе выражен значительно сильнее, чем на мальтозе или галактозе. В то же время, Иянг [106] указывает, что ни мальтоза, ни мальтотриоза не вызывает репрессивного действия на дыхание у штаммов дрожжей низового брожения.
Следовательно, именно массовая доля углевода в среде определяет преобладающий тип энергетического обмена в клетках, а значит и выход биомассы.
Таким образом, на энергетический обмен дрожжевой клетки оказывают влияние многие факторы: концентрация сахара, концентрация растворенного в среде кислорода, факторы роста и минеральные компоненты, но, прежде всего, он связан с концентрацией сахара и растворенного кислорода в среде культивирования.
Энергетический обмен тесно связан с конструктивным обменом, т.е. синтезом всех компонентов клетки. С точки зрения накопления биомассы и обеспечения длительной сохранности хлебопекарных свойств дрожжей мы остановимся на метаболизме углеводов, в частности резервных углеводов, и белка. Роль резервных углеводов в метаболизме дрожжей Резервные углеводы представлены в клетках дрожжей тремя фракциями: трегалозой и двумя фракциями гликогена, растворимыми в уксусной и хлорной кислотах. Метаболически активные фракции накапливаются не одновременно. Содержание гликогена растет в процессе размножения, в то время как трегалоза аккумулируется при переходе культуры к стационарной фазе [87].
Гликоген- это осмотически неактивный полисахарид, способный быстро вступать в метаболизм дрожжей. Синтез гликогена начинается с образования уридиндифосфатглюкозы (УДФГл), катализируемого ферментом глюкозо-1-фосфатуридил-трансферазой (ЕС 2.7.7.9). Гликоген-синтаза-Д-фосфатаза катализирует последовательное присоединение глюкозного остатка УДФГл к полисахаридному акцептору. Глюкозные единицы в полисахариде соединены а(1-4) связями в линейных цепях. Процесс идет по следующей схеме:
Влияние тоничности среды (осмотического давления) на микроорганизмы
Минеральные вещества, растворяясь в межмицеллярной воде, играют большую роль в биодинамике цитоплазме клетки [45,92]
Фосфор. Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, АТФ, фосфолипидов, полимеров клеточной стенки, он может накапливаться в клетке в виде полифосфатов. Для физиологических потребностей дрожжей расходуется около 10... 13 мг фосфора на прирост 10 млрд. клеток.
Калий. Калий содержится в дрожжах в значительных количествах: от 1,4 до 4,3% от СВ. Это сопоставимо лишь с содержанием азота (до 10% от СВ) и фосфора (до 5,5% от СВ), что свидетельствует о его важной роли в обмене дрожжей. Действительно, в отличие от многих ионов, калий выполняет роль не только кофермента, но также входит в некоторые структуры клетки. Кроме того, он участвует в регуляции транспорта ионов через клеточную стенку и через митохондриальную мембрану. Калий активирует около 40 различных ферментов.
При синтезе биомассы потребность дрожжей в калии составляет 1г. калия на 54 г сухой биомассы. Магний. Магний имеет большое значение в энергетическом обмене дрожжей. Экономический коэффициент в расчете на потребленный магний варьирует от 300 до 900 г сухой биомассы на 1 г магния, для пивных дрожжей эта величина обычно составляет 540г/г магния.
Сера. Сера необходима главным образом для синтеза таких аминокислот, как цистеин и метионин.
Небольшое количество серы требуется для образования сульфогрупп в некоторых коферментах, таких как биотин, кофермент А, липоевая кислота, тиамин и перидоксин.
Для дрожжей было установлено, что при лимитации этого компонента в среде наблюдается снижение дыхательной активности клеток, как и при лимитации роста дрожжей железом. у Экономический коэффициент в расчете на ионы SO/ для дрожжей составляет 100 г сухой биомассы на 1 г серы.
Микроэлементы. К микроэлементам, которые обычно необходимы для роста дрожжей, относятся: Са, Mn, Fe, Со, Си. А также цинк (Zn), который считается одним из самых важных микроэлементов клетки [ 63, 64,101]. Элементы, редко требуемые для роста: В, Na, Al, Si, СІ, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, I.
Приближенная оценка экономического коэффициента, т.е. количество прироста биомассы (г) в расчете на 1 г потребленного элемента дана в таблице 1.4.
Потребность в микроэлементах может увеличиваться в несколько раз, когда культура испытывает стресс, например, при увеличении температуры выше оптимальной.
Следует отметить, что меласса содержит все необходимые минеральные макро-и микроэлементы, кроме фосфора, калия, магния и цинка, поэтому оптимизировать минеральный состав среды следует именно по содержанию этих компонентов.
Факторами роста дрожжей являются витамины: пантотеновая кислота (витамин В3), мезоинозит (витамин В8), а также витамин биотин (витамин
В7), который клетками дрожжей не синтезируется [46]. Активатором спиртового брожения служит тиамин (витамин В і). Содержание этих витаминов в клетках и их роль в обмене (метаболизме) веществ-углеводов и жиров у дрожжей приведены в таблице 1.5. и на рисунках 1.7 и 1.8
Осмотическое давление возникает из-за стремления воды проникнуть через полупроницаемую мембрану в сторону более концентрированного из двух разделенных этой мембраной растворов. Такое давление прямо пропорционально концентрации молекул, которые не могут пройти через мембрану.
Цитоплазматическая мембрана характеризуется полупроницаемостью относительно воды и гидрофильных соединений с высокой молярной массой.
Когда концентрация среды очень низкая клетка испытывает гипоосмотический стресс и стремится впитать воду. В плотной среде гиперосмотический стресс - клетки теряют воду и «сморщиваются». Степень стресса зависит от плотности сусла и типа Сахаров, а так же физиологического состояния клеток. Растущие клетки более чувствительны к стрессу, чем клетки из стационарной фазы [97], что может быть связано с накоплением трегалозы в стационарной фазе [70, 86]. По всей видимости её роль в данном случае совпадает с таковой при термошоке. Сахара препятствуют денатурированию белков и взаимодействуют с белками, возникающими в результате термошока [96,105].
В гипоосмотических условиях, с целью противостоять поступлению воды в клетки происходит стимуляция синтеза клеточной стенки [68].
Осмотическое давление в клетке определяется содержанием воды. Вода в этом случае играет механическую роль, поддерживая тургор клеток. Это одна из важнейших функций воды в живых организмах.
Определение ферментативной активности дрожжей по интенсивности выделения СОг
Мальтазная и зимазная активности дрожжей (скорость сбраживания мальтозы/глюкозы) - это время (в минутах), необходимое для выделения 10 мл диоксида углерода при сбраживании 5 %-го раствора мальтозы или глюкозы прессованными дрожжами в количестве 2,5 % (по отношению к объему раствора сахара).
При определении бродильной активности используют прибор Елецкого (рис. 2.2) либо прибор АГ (рис.2.3).
Перед началом работы в манометрическую крышку заливают насыщенный раствор поваренной соли (40 г NaCl в 100 мл воды), подкрашенный метиленовой синью. Раствор наливают до уровня измерительной трубки и этот уровень считают за ноль. Ход определения:
0,5 г прессованных дрожжей помещают в стакан прибора, по палочке приливают 10 мл подогретой до 35С воды, смывая остатки дрожжей с палочки. К полученной суспензии дрожжей добавляют 10 мл нагретого до 35С раствора исследуемого сахара и быстро закрывают стакан манометрической крышкой. С помощью трехходового крана выравнивают давление внутри прибора до уровня атмосферного давления. После этого кран закрывают. Прибор помещают в термостат при 35С. Отмечают время, в течение которого солевой раствор поднимется по измерительной трубке до отметки 10 мл. .0пределение количества С02, образующегося при брожении
Для определения бродильной активности дрожжей в данной работе измеряли количество выделявшихся в культуральную среду газообразных продуктов при брожении на приборе АГ (рис.2.3). Ход определения:
В колбы емкостью 150 мл помещают 100 мл сусла с известной концентрацией сухих веществ и вносят суспензию дрожжей, известной концентрации. Таким образом, готовят максимальное количество проб, которые могут быть обработаны на аппарате АГ, в количестве шесть.
Герметично подсоединяют колбы к перевернутым мерным цилиндрам. Погружают колбы в водяную баню и выбирают требуемую температуру с помощью регулятора. Откачивают воздух из мерных цилиндров, пока поднявшийся уровень масла, не достигнет нулевой отметки на шкале. В ходе опыта замеряют уровень масла в мерных цилиндрах.
Изменение уровня масла в мерных цилиндрах равно изменению объёма газа в герметично закрытой системе мерный цилиндр - резиновый шланг колба с суслом. Таким образом, получают данные о скорости выделения углекислого газа дрожжами в процессе брожения [13].
Методика определения жизнеспособности дрожжей по степени окисления путем измерения рН (тест «силы подкисления»).
Анализы проводились по методу Операкова и Сиглер. Тест «силы подкисления» - заключается в измерении значения внеклеточного рН дрожжевой суспензии до (спонтанное снижение) и после добавления глюкозы. Снижение значения внеклеточного рН вызывается выделением дрожжами ионов Н+. Уровень спонтанного подкисления является индикатором содержания гликогена, а индуцированный глюкозой уровень подкисления является индикатором скорости прохождения гликолитического пути. Этот метод является полезным, быстрым и удобным для определения жизнеспособности дрожжевых клеток [58].
Для определения жизнеспособности дрожжей по степени окисления дрожжи промывают дистиллированной водой, затем тщательно перемешивают в 100 мл дистиллированной воды. Через 10 минут добавляют 5 мл 20 % (масс/об.) раствора глюкозы и перемешивают еще 10 минут. В ходе инкубации в течение 20 минут ежеминутно измеряют рН суспензии. Резкое снижение рН после добавления раствора глюкозы свидетельствует о высокой активности дрожжей. Удельную скорость падения рН определяли по формуле: Vc.Ph=[ln(pHi/pH2)]/(t2i).
Культивирование дрожжей штаммов Л-128, ЛВ-7, ПК,34/70 было проведено на двух аппаратах разной конструкции.
На рисунке 2.4. приведена схема аппарата с барботажной воздухораспределительной системой, а на рисунке 2.5. - кожухотрубный струйно-инжекционный аппарат (КСИА) [25].
В процессе исследования были использованы два способа культивирования: воздушно-приточный и бесприточный. Принцип расчета режимов культивирования проводили в соответствии с методическим руководством [33].
Культивирование дрожжей с притоком питательных компонентов
Исходя из полученных экспериментальных данных, представленных в таблице 2 при расходе воздуха 214 м /ч/м экономический коэффициент составляет 77,0 ±3,2 %..
Как видно на рис. 3.17. уже при расходе воздуха 60 м/ч/м в барботажном аппарате фактически достигается максимально возможный для данной воздухо-распределительной системы коэффициент прироста биомассы. Кроме того выход биомассы незначительно отличается от результатов, полученных при расходе воздуха 214 м /ч/м (сравнить 74,0±2,1%и77,0±3,2%).
Причем следует отметить, что он значительно ниже, чем предусмотрено при расчете технологического режима табл.3.4. Можно было бы предположить, что это связано с недостаточной концентрацией кислорода в среде культивирования, которая по мнению ряда авторов, не должна быть ниже 100 мкг/л (ссылки). Действительно, при подаче воздуха из расчета 31 м3/ч/м3 уже при достаточной концентрации воздуха в среде культивирования (среднее значение 7,5 мкг/л, табл.3.4) коэффициент прироста составляет всего в среднем 1,1 г/г. Увеличение расхода воздуха до 60 м /ч/м и далее до 214 м /ч/м приводит к повышению остаточной концентрации воздуха в среде с 12-15 до 32-42 мкг/л, но при этом это не отразилось на величине а и выходе биомассы (табл. 3.5 -3.7.).
Следовательно, можно придти к заключению, что в данном случае большее влияние на выход биомассы оказывает не расход воздуха и не величина сахар/дрожжи в начале каждого часа процесса, которая была ниже установленной ранее величины 0,1 г/г [24], а отсутствие растворенного в среде кислорода, который, несмотря на интенсивность аэрации, (214 м /ч/м ) не успевает раствориться в культуральной жидкости и потребиться дрожжами.
При оценке бродильной активности дрожжей была отмечена тенденция повышения зимазнои и мальтазнои активности клеток с увеличением расхода воздуха (рис.3.18). Это не противоречит данным, полученным в разделе 3.2.1 (табл. 3.3.), где видно, что при оптимальной концентрации биотина в среде и повышение интенсивности аэрации незначительно увеличивается (с 82 до 77 мин.) мальтазная активность дрожжей.
Физиологическая активность дрожжей, а именно активность ферментов, которые участвуют в потреблении углеводов питательной среды определяется целым рядом факторов, в частности кратностью разведения мелассы, концентраций спирта и температурой культивирования. Причем, в начале выращивания дрожжей, клетки испытывают осмотический шок, связанный с высокой концентрацией углеводов в питательной среде, в результате они теряют воду [19]. Степень стресса зависит от плотности сусла, а также физиологического состояния клеток. Растущие клетки более чувствительны к стрессу, чем клетки стационарной фазы роста, что объясняется высоким содержанием в последних - трегалозы, выполняющей роль осмотического барьера [49]. Далее следует отметить, что по мере уменьшения содержания сухих веществ в процессе культивирования в среде увеличивается концентрация этанола, который также как и высокая тоничность среды отрицательно сказывается на физиологии дрожжей. Однако, отрицательное действие на клетки во время получения биомассы дрожжей не ограничивается только двумя этими стрессами, так как после накопления биомассы следует ее отделение от культуральной жидкости и промывание водой при температуре 2- 4С. В этих условиях клетки подвергаются гипотоническому стрессу и воздействию низких температур, что также может повлиять на активность ферментов зимазного и мальтазного комплексов. В связи с этим изучение влияния кратности разведения мелассы (КРМ), т. е осмотического давления, концентрации этанола в конце процесса культивирования на активность ферментов зимазного и мальтазного комплекса, которые определяют хлебопекарные свойства в полученной биомассе дрожжей, является актуальной задачей.
