Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 9
1.1. Общая характеристика полисахаридов 9
1.2. Свойства полисахаридов 11
1.3. Новые возможные аспекты применения молочнокислых бактерий 14
1.3.1. Молочнокислые бактерии - продуценты биологически активных веществ 14
1.3.2.. Экзополисахариды молочнокислых бактерий и факторы, влияющие на их синтез 18
1.4. Современные представления о роли ЭПС-штаммов в кисломолочных продуктах 24
1.5. Обоснование перспективности выбранного направления, формулирование цели и задач работы 30
2. Объекты и методы исследований ; 34
2.1. Объекты исследований 34
2.2. Методы исследований 34
2.2.1. Микробиологические методы 34
2.2.2. Биохимические методы 36
2.2.3. Генетические методы 38
2.2.4. Методы определения структурно-механических свойств 39
2.2.5. Хроматографические методы 40
2.2.6. Математические методы 41
3. Исследование способности штаммов молочнокислых бактерий синтезировать ЭПС 42
3.1. Активизация коллекционных штаммов молочнокислых бактерий и изучение технологических свойств восстановленных штаммов 42
3.2. Исследование способности отечественных культур молочнокислых бактерий к синтезу ЭПС 47
3.3. Изучение влияния внешних факторов на способность
бактерий синтезировать ЭПС 48
3.4. Определение плазмидного профиля и изучение стабильности сохранения синтеза ЭПС у подобранных культур 55
3.5. Получение индивидуальной генетической характеристики отобранных штаммов 59
4. Научное обоснование параметров биотехнологии биомассы эпс-культур молочнокислых бактерий 63
4.1. Определение количества ЭПС, синтезируемых молочнокислыми бактериями, при разных условиях культивирования 63
4.2. Характеристика ЭПС, синтезируемых штаммом L. lactis LLN-E2 69
4.3. Изучение влияния температуры культивирования и состава питательных сред на показатели качества стартовой культуры в условиях стационарного культивирования 74
4.4. Изучение влияния температуры культивирования на показатели качества стартовой культуры в условиях полунепрерывного культивирования 81
4.5. Получение сухой биомассы ЭПС-штамма 86
4.6. Исследование производственно-ценных свойств полученной в условиях полунепрерывного культивирования лиофилизированной ЭПС-стартовой культуры 87
4.7. Исследование свойств разработанной стартовой культуры в процессе хранения 91
5. Изучение показателей качества продуктов, полученных с использованием разработанной эпс-стартовой культуры 93
5.1. Применение ЭПС-стартовой культуры в технологии сметаны 93
5.2. Изучение микробиологических показателей сметаны, выработанной с ЭПС-стартовой культурой 95
5.3. Изучение органолептических и физико-химических показателей сметаны 97
5.4. Изучение структурно-механических свойств сметаны 101
5.5. Исследование показателей сметаны в процессе хранения 108
Выводы 113
Библиографический список
- Новые возможные аспекты применения молочнокислых бактерий
- Методы определения структурно-механических свойств
- Исследование способности отечественных культур молочнокислых бактерий к синтезу ЭПС
- Изучение влияния температуры культивирования и состава питательных сред на показатели качества стартовой культуры в условиях стационарного культивирования
Введение к работе
Современные требования к пищевым продуктам, предъявляемые медиками-диетологами, обусловленные развитием общества, энергозатратами людей, состоянием здоровья населения, стимулируют производителей выпускать как традиционные, так и новые продукты с более длительным сроком хранения. Выработка качественных и безопасных молочных продуктов, стабильно сохраняющих показатели при хранении, одна из важнейших задач в производстве продуктов питания. Существуют и постоянно совершенствуются технологические приемы, направленные на получение кисломолочных продуктов с заданными характеристиками. Важнейшую роль в производстве ферментированных молочных продуктов играют стартовые культуры (закваски).
Научные основы биотехнологии молочных продуктов изложены в трудах: Банниковой Л.А., Гавриловой Н.Б., Ганиной В.И., Евдокимова И.А., Забодаловой Л.А., Королевой Н.С., Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Хорольского В.В., Храмцова А.Г., Degeest В., Hassan A., De Vuyst L. и др.
Интенсивное расширение ассортимента молочных продуктов, произошедшее в конце XX и в начале XXI века, привело к широкому использованию в технологии пищевых добавок. Для улучшения реологических характеристик и увеличения срока годности кисломолочных продуктов применяют полисахариды различного происхождения: натуральные полимеры, полученные из морских водорослей (агар, альгинаты и каррагинаны) и из растений (крахмал, галактоманнаны и пектины); модифицированные (кукурузный, картофельный крахмалы и др.) [90, 178]. Однако, как показала практика, применение пищевых добавок для улучшения консистенции, имеет ряд недостатков. Во-первых, каждый из полисахаридов обладает комплексом функциональных свойств, которые варьируют в зависимости от состава, рН используемой коллоидной системы и других параметров [14, 21, 41]. Во-вторых, иногда только применение композиции полисахаридов позволяет получить требуемый результат. До последнего времени не решены все аспекты
биобезопасносга, возникающие при использовании в продуктах питания пищевых добавок.
За рубежом в последние годы акцентируется внимание на новые стартовые молочнокислые культуры, синтезирующие экзополисахариды (ЭПС), которые могут быть не только натуральным альтернативным источником пищевым добавкам, улучшающим реологические показатели кисломолочных продуктов, но также выступать в роли факторов, способствующих адгезии полезных микроорганизмов на стенках кишечника Особый интерес к ЭПС-синтезирующим культурам обусловлен тем, что на Международном уровне молочнокислым бактериям, которые используются in situ, присвоен статус безопасности - GRAS, что подтверждает возможности применения этих микроорганизмов в производстве безопасных продуктов питания [54, 105, 118, 151, 183]. В этой связи, актуальным и целесообразным является получение стартовых культур на основе природных отечественных штаммов молочнокислых бактерий, синтезирующих ЭПС, внесение которых на соответствующей стадии технологического процесса будет способствовать наибольшему сохранению полезных природных свойств получаемой продукции, ее конкурентоспособности при заданных показателях качества и безопасности.
Целью диссертационной работы являлась разработка биотехнологии новых отечественных стартовых молочнокислых культур, обладающих свойством синтезировать экзополисахариды, путем селекции молочнокислых бактерий с дальнейшим скринингом культур по биотехнологическим параметрам и способности к максимальному синтезу экзополисахаридов.
Научная новизна работы заключается в том, что проведена диагностика и селекция отечественных штаммов молочнокислых бактерий, позволившая выявить среди них синтезирующие экзополисахариды; получены новые данные о влиянии внешних условий на метаболистическую активность ЭПС-культур в условиях стационарного и полунепрерывного глубинного культивирования; селекционирован природный импортозамещающий штамм-продуцент ЭПС - Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2 со стабильными
свойствами, который принят на патентное депонирование за № ВКПМ В-8558 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов; определены фракционный и мономерный состав, молекулярная масса и соотношение моносахаридов в экзополисахариде, синтезируемом штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2; научно обоснованы параметры биотехнологии, обусловливающие получение биомассы ЭПС-стартовой культуры, характеризующейся высоким выходом экзополисахаридов, количеством клеток и технологичностью.
Практическая ценность результатов состоит в том, что освоены количественный и качественный методы по определению и выделению ЭПС у культур молочнокислых бактерий. Выявлены штаммы молочнокислых бактерий, обладающие комплексом биотехнологических свойств, и способные синтезировать экзополисахариды. Показано, что штаммы молочнокислых бактерий разных таксонов, способные к синтезу ЭПС, отличаются составом и размером обнаруженных плазмид. Разработана и проверена в лабораторных и промышленных условиях биотехнология ЭПС-стартовой культуры. Проведена выработка сметаны на ОАО «Волоколамском молочном заводе» с применением биомассы полученной ЭПС-культуры молочнокислых бактерий. Показано, что опытный готовый продукт обладал лучшими органолептическими и реологическими показателями по сравнению с контрольным продуктом, полученным с традиционно используемыми заквасками. Разработан проект технической документации на биомассу стартовой культуры молочнокислых бактерий, синтезирующих ЭПС.
На штамм бактерий Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558, используемый в производстве молочных продуктов, и способ получения стартовой культуры штамма Lactococcus lactis subspecies lactis ВКПМ В-8558 подана заявка на патент, зарегистрированная за № 2005125605.
Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при выполнении лабораторных, курсовых и дипломных работ на основе вновь
разработанных методических указаний к выполнению лабораторных и научно-исследовательских работ для магистров техники и технологий направления 260100 - Технология продуктов питания и студентов по специальностям: 260303, 260301, 260302, 260505, 240902, 240901 по дисциплине «Стартовые культуры в технологии продуктов питания и кормов». Работа выполнялась в рамках НИР №2-6-02 «Биотрансформация мясного сырья. Подбор и изучение штаммов бактерий. Технологии переработки биотрансформированного сырья».
По выполняемой теме в 2003 году выигран внутривузовский грант на конкурсе среди молодых ученых и получен диплом за разработку в области биологии «Биотехнология стартовой культуры с ЭПС-активностыо для молочных продуктов» на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва.
Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 2-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (21 октября, 2003г.); 3-ей Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (26 ноября, 2004г.); конференции, посвященной 60-ти летаю кафедры «Технология молока и молочных продуктов» и 75-ти летию МГУПБ (31 января, 2005г); Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва (29 июня - 3 июля, 2005г.); 4-ой Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» (30 ноября, 2005г.) и др.
По материалам диссертации опубликовано 19 работ.
Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, приложений. Основной текст работы изложен на 114 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 45 рисунков. Библиография представлена 200 источниками, в том числе 108 зарубежных авторов, количество приложений 13.
1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
Новые возможные аспекты применения молочнокислых бактерий
На современном этапе развития микробиологии и биотехнологии особый научный и практический интерес представляют исследования экзополисахаридов, синтезируемых Грам-положительными микроорганизмами, в частности, молочнокислыми бактериями. К настоящему времени большая часть исследований, проведенных по ЭПС микробного происхождения, касается Грам-отрицательных бактерий, таких как Azotobacter vinelandii, Xanthomonas campestris, Rhizobium meliloti [115, 134, 161, 175, 186, 193]. Использование этих микроорганизмов в пищевых системах требует дополнительных исследований по их безопасности и как следствие увеличение продолжительности процедуры их утверждения. В связи с этим пищевая промышленность заинтересована в получении ЭПС-микроорганизмов, классифицированных как GRAS (широко признанные как безопасные), к которым относят молочнокислые бактерии [93, 115, 118, 134, 166, 173, 175, 188, 189,193,195].
Молочнокислые бактерии широко используются для ферментирования пищевых продуктов, благодаря их способности улучшать вкус, аромат, структуру и обеспечивать безопасность скоропортящемуся сырью (молоко, мясо, овощи). Молочнокислые бактерии выполняют важные функции в различных пищевых системах, включая кисломолочные продукты, мясо и хлебобулочные изделия. Способность продуцировать молочную кислоту в результате сбраживания Сахаров является одной из наиболее важных характеристик молочнокислых культур, используемых в производстве ферментируемых продуктов [118, 165, 187, 197]. Молочнокислые бактерии характеризуются способностью к синтезу важных продуктов метаболизма, что предоставляет широкий диапазон для их промышленного применения [54, 81, 128, 141, 166, 188, 195]. Например, это их протеолитическая и пептидазная активность; способность к ароматообразованию; продуцирование смесей ингибиторов с низкой молекулярной массой (пероксид водорода, бензойная кислота и диацетил) и бактериоцинов [118,155, 165, 168,175,195].
Среди продуктов метаболизма молочнокислых бактерий в последние годы повышенное внимание получили экзополисахариды, из-за их роли в структуре кисломолочных продуктов и их потенциальной пользе в качестве гелеобразующих агентов взамен ЭПС, продуцируемым не пищевыми классами микроорганизмов (ксантан, гелан, пулулан и др.) и стабилизаторам растительного происхождения. ЭПС, синтезируемые молочнокислыми бактериями, имеют пищевой статус, и это определяет их возможность применения в качестве стабилизаторов, структурообразователей, гелеобразователей и загустителей [65, 93, 113, 116, 118, 125, 134, 152, 175, 181, 184, 189]. ЭПС за рубежом представляют типичный пример так называемых функциональных стартовых культур [118]. Из-за высокой водосвязывающей способности, ЭПС способствуют уменьшению количества выделяющейся сыворотки во время производства и в готовых продуктах, тем самым, увеличивая сроки их годности [10, 94, 99, 105, 115, 118, 126, 136, 157, 164, 179, 181, 184, 189]. Кроме того, ЭПС, синтезируемые микроорганизмами, имеют еще несколько преимуществ по сравнению с полисахаридами растительного происхождения. Они могут накапливаться в биотехнологических процессах, протекающих при определенных условиях, что позволяет получить полимеры с постоянными характеристиками. В отличие от них полимеры растительного происхождения могут сильно изменяться как качественно, так и количественно в результате влияния климатического фактора и фактора окружающей среды [39, 178].
На сегодняшний день качество и безопасность пищевых продуктов является одним из основных условий сохранения здоровья населения страны. Показатели готовой продукции формируются на всех этапах биотехнологического цикла получения продукта. Для обеспечения стандартных характеристик кисломолочных продуктов и сыров важным этапом является получение и внесение стартовой культуры молочнокислых бактерий с заданными свойствами. В настоящее время остро стоит проблема предотвращения инфицирования бактериофагами стартовой культуры, которые широко распространены на предприятиях молочной отрасли [11, 83]. Ученые полагают, что экзополимерная капсула штаммов микроорганизмов является фактором, участвующим в механизме резистентности клетки к адгезии фаговых частиц, выполняя защитную функцию клетки от лизиса бактериофагов. Таким образом, используя ЭПС-штаммы молочнокислых бактерий, можно повысить устойчивость стартовых культур к бактериофагам [122, 134, 147, 151, 163].
Некоторые зарубежные авторы приводят данные о том, что ЭПС, синтезируемые молочнокислыми бактериями, могут в организме человека выполнять ряд важных биологических функций. Существуют мнения, что ЭПС-штаммы обладают повышенной устойчивостью к агрессивной среде благодаря наличию экзополисахаридной капсулы, которая к тому же, вероятно, служит связующим звеном при их заселении и адгезии в кишечнике. Это свойство повышает вероятность накопления таких штаммов в пищеварительном тракте человека [69, 89, 146, 148, 167, 175, 183, 193, 196].
Методы определения структурно-механических свойств
Определение плазмидного профиля. Определение плазмидного профиля осуществляли у молочнокислых бактерий, относящихся к разным таксонам, на основе модифицированной методики выделения плазмид из штаммов Е. соН [48]. При определении размеров плазмид в качестве реперов (маркеров) использовали плазмиды R-64 - 120 kb; R:D - 100 kb; RP4 - 56,4 kb и RP-1 - 50 kb в штаммах E.coli.
Технология ДНК-фингерпринта (выделение ДНК и ПЦР- протоколы). 5 мл ночной культуры, выращенной в гидролизованном молоке по Богданову, были центрифугированы в эпиндорфе и заморожены при температуре минус 20С. Замороженная биомасса использовалась для выделения ДНК при помощи Genomic DNA Purification Kit фирмы «Fermentas». ДНК-фингерпринт молочнокислых бактерий проводили с использованием модифицированных праймеров рибосомальных последовательностей (triplicate arbitrary primers polymerase chain reaction TAP-PCR) [108]: Kpml (CAG-CAG-CCG-CCGAAAC); Kpm2 (CAG-CAG-CCG-CGGAATC), а так же Random Amplified Polymorphic ДНК фингерпринт (RAPD) с использованием произвольных праймеров: М13 (GAG-GGT-GGC- GGTCT);1254 (CCG-CAG-CCA-A) [190].
Методы определения структурно-механических свойств Определение вязкости продукта. Реологические свойства сгустков исследуемых образцов сметаны определяли методами инженерной физико-химической механики с помощью ротационного вискозиметра с коаксиальными цилиндрами «Реотест-2». Измерения проводили в режиме «а» с рабочим цилиндром S3 [44].
Определение микроструктуры продукта. Образцы сметаны замораживали в камере замораживающего микротомкриостата МК-25 до температуры минус 25С на предметном столике. Гистологические срезы толщиной 15-20 мкм переносили в замороженном виде на охлажденное предметное стекло и монтировали расплавлением на ладони. Затем предметные стекла со срезами переносили в комнатные условия и подсушивали. Подсушенные срезы осторожно окрашивали гематоксилином Эрлиха в течение 10 минут, дифференцировали в солянокислой воде, обрабатывали аммиачной водой и докрашивали свежим водно-спиртовым эозином в соответствии с классическими методиками. Заключали срезы в глицерин-желатин, применяя возможно низкие температурные воздействия [5,7,49].
Изучение и фотографирование срезов проводили на световом микроскопе «Yenaval» (Германия) с использованием системы анализа изображения «ВидеоТесТ» с программным обеспечением «Морфо-4,0» [87].
Хроматографические методы
Гель хроматография. Гель-хроматографию (гель-фильтрацию) образцов выделенных ЭПС объемом (2,5- -8,5) см3 (содержание ЭПС (0,01-г0,02)г проводили на стеклянной хроматографической колонке размером (400x25) мм. Сорбент - гель TSK-Gel Toyopearl, элюент — дистиллированная вода. Собирали фракции объемом 1 см3.
Для определения молекулярной массы выделенного ЭПС проводили калибровку колонки по четырем контрольным образцам с известной молекулярной массой.
Тонкослойная хроматография (ТСХ). Системы растворителей для ТСХ: система А: Изопропанол и дистиллированная вода в соотношении 17:3; система В: Хлороформ. ТСХ проводили на пластинках Sorbfil.
Газожидкостная хроматография (ГЖХ) с масс-спектрометрией. Проведению ГЖХ с масс-спектрометрией для более глубоко изучения состава ЭПС предшествовало приготовление образца ЭПС в ацстилированной форме, которое проводили по следующим этапам: 1. Полный кислотный гидролиз сухого остатка ЭПС в 2Н трифторуксусной кислоте (ТФУ). Проводили ТСХ в системе А. Обнаружитель - анилинфталат. 2. Полученный гидролизат ацетилировали в присутствии свежеприготовленного ацетата натрия и уксусного ангидрида. Проводили ТСХ в системе В. Обнаружитель пятен - нагревание хроматограммы на электрической плитке. [ Пентаацетат гидролизата ЭПС исследовали при помощи ГЖХ с масс-спектрометрией на газовом хроматографе 6890N (Agilent Technologies) и масс-детекторе 5973N (Agilent Technologies).
. Математические методы Математическую обработку экспериментальных данных по результатам 3-7 повторностеи осуществляли с помощью методов математической статистики [22, 31, 32].
Исследование способности отечественных культур молочнокислых бактерий к синтезу ЭПС
Из зарубежных источников информации известно, что температура и состав питательной среды, на которой культивируют штаммы молочнокислых бактерий, могут влиять на их способность к синтезу ЭПС. В связи с этим в стационарных условиях культивирования исследовали влияние на синтез ЭПС отечественными штаммами молочнокислых бактерий двух параметров: температуры и состава питательной среды.
Все культуры перевивали трех кратно для их адаптации к установленным условиям исследований. Способность микроорганизмов к синтезу ЭПС на разных питательных средах определяли при температуре культивирования: для штаммов тер мофильного стрептококка и молочнокислых палочек - 32±1С, 37±1С и 42±1С; для лактококков -24±ГС,30±1Си37±1С.
В ходе проведения экспериментов наблюдали за временем образования и характером сгустка в обезжиренном молоке, наличием мути в гидролизованном молоке и сывороточной среде и характером роста на плотной питательной среде MRS. Выявлено что, трехкратное пассирование изучаемых штаммов на вышеперечисленных питательных средах не приводило к изменению их активности.
Проведенные исследования показали, что изученные штаммы разных таксонов молочнокислых бактерий можно культивировать на среде MRS, в обезжиренном молоке, гидролизованном молоке и сывороточной среде.
На первоначальном этапе ранее отобранные технологичные штаммы культивировали при различных температурах в традиционной среде для молочнокислых бактерий - обезжиренном молоке и более богатой питательной среде - гидролизованном молоке.
Результаты исследований способности штаммов термофильного стрептококка к синтезу ЭПС, представлены на рис. 3.4., молочнокислых палочек - рис. 3.5., лактококков - рис. 3.6.
Количество штаммов термофильного стрептококка, синтезирующих ЭПС, при развитии на обезжиренном молоке увеличивалось как при снижении температуры культивирования с 37±1С до 32±1С (26%), так и при увеличении температуры до 42±1С (32%). Следует отметить, что штаммы термофильного стрептококка В 2011, В 2890 и СТ138, не синтезирующие ЭПС при температуре 37±1С, проявляли защитную реакцию на изменение температуры и начинали синтезировать ЭПС при изменении температуры. Температура культивирования Рис. 3.4. - Изменение количества штаммов термофильного стрептококка, синтезирующих ЭПС, в зависимости от температуры культивирования. МО -молоко обезжиренное; ГМ - молоко гидролизованное.
Наблюдали ту же тенденцию проявления защитных механизмов у клеток бактерий: происходило увеличение количества штаммов Streptococcus thermophilus - продуцентов ЭПС при изменении температуры при их развитии в гидролизованном молоке. По сравнению с культивированием в обезжиренном молоке при 32±1С количество штаммов, синтезирующих ЭПС, в гидролизованном молоке уменьшилось на 9%; 37±1С - на 15% и 42±1С - на 15%, что указывает на снижение количества ЭПС-штаммов термофильного стрептококка при более благоприятных условиях их ферментации.
Изученные штаммы болгарской палочки, не проявляющие ЭПС-способности при оптимальной температуре развития (42±1С), проявляли ее при понижении температуры на 5С как на обезжиренном молоке, так и на гидролизованном молоке. Отмечено, что понижение температуры на 10С вновь приводило к утрате данного свойства. У проверенных штаммов ацидофильной палочки при разных условиях культивирования способность к синтезу ЭПС не выявлена.
Все изученные штаммы лактококков сохраняли способность к синтезу ЭПС при изменении температуры в равной степени при их развитии в обезжиренном молоке. В гидролизованном молоке лактококки утрачивали свойство синтезировать ЭПС, кроме штамма Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2, который сохранял способность к синтезу ЭПС в различных условиях.
Следовательно, вполне обоснованным является предположение, что наличие экзополисахаридной капсулы выполняет защитную функцию для некоторых штаммов молочнокислых бактерий. Проявление этого свойства часто наблюдается при отклонении условий культивирования: изменении температуры или питательной среды.
На следующем этапе изучали способность к синтезу ЭПС в жидкой сывороточной среде (СС) и на плотной питательной среде MRS (как наиболее часто используемую за рубежом). В исследованиях использовали наиболее технологичные штаммы термофильного стрептококка СТ 138; СТ 95; СТ ВГР; молочнокислых палочек -АКА-5; АБ-259; Б-ЛГ; лактококков -L18-AK; L36c; LLN-E2; сг 152.
Изучение влияния температуры культивирования и состава питательных сред на показатели качества стартовой культуры в условиях стационарного культивирования
На рисунке 4.9. показаны данные по динамике развития штамма Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2. Динамика развития в сывороточной среде практически аналогична таковой в обезжиренном молоке, что указывает на возможность использования сывороточной среды для накопления биомассы при 24±1 С. В момент времени, составляющий 12±0,5ч в обезжиренном молоке начиналась стационарная фаза, а в сывороточной среде наблюдали окончание фазы логарифмического роста, т.е. существует возможность накопления большего количества клеток при проведении дальнейшего культивирования.
При развитии штамма L. lactis LLN-E2 в обезжиренном молоке наблюдали стационарную фазу и фазу отмирания, то являлось важным найти стационарные точки с помощью методов математического анализа по оптимальным моделям. По построенным для экспериментальных зависимостей параметрам - количества клеток от времени культивирования -полиномиальным моделям третьего или четвертого порядка, наиболее адекватно описывающим результаты проведенного эксперимента, средствами программы Advanced Grapher найдены стационарные точки, то есть такие точки (области), в которых можно ожидать абсолютного максимума функций в исследуемой области (приложение 8). Экстремумы, найденные по математическим моделям, относительно близки, и почти совпадают с экстремумами, полученными в ходе эксперимента, что относительно указывает на точность проведения эксперимента.
Проанализировав полученные данные, можно сказать, что развитие изучаемого штамма при температуре культивирования 24+1 С в стационарных условиях в сывороточной среде было не хуже, чем в обезжиренном молоке, а следовательно, сывороточную среду можно рекомендовать для накопления биомассы изучаемого штамма.
Для сравнения развития штамма LLN-E2 на питательных средах разного состава представлялось интересным провести исследования и при температуре 30±1С, наиболее часто применяемой при выработке кисломолочных продуктов на предприятиях молочной промышленности.
По экспериментальным данным проведен регрессионный анализ (приложение 6). Полиномиальная модель третьего и четвертого порядка (для количества клеток) наиболее адекватно описывают результаты проведенного эксперимента. Следовательно, можно сделать предположение, что биологическая система с применением штамма Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2 изменяется пропорционально кубу или четвертой степени (для количества клеток) от времени его культивирования.
Результаты изменения титруемой кислотности в зависимости от времени культивирования представлены на рисунке 4.10.
Прирост титруемой кислотности при развитии штамма в обезжиренном молоке за 14±0,5 часов составлял 57±2Т, что выше на 12±2Т, чем при температуре 24±1 С. Таким образом, из данных рисунков 4.7. и 4.10. видно, что титруемая кислотность была умеренной и составляла 67+79Т, что указывает на достаточную биохимическую активность данного штамма.
При развитии штамма в обезжиренном молоке падение рН за 13±0,5ч культивирования составляло 1,60+0,02 единицы рН (рис. 4.11). Следует отметить, что к 13±0,5ч культивирования значения активной кислотности были более близкими в обезжиренном молоке и сывороточной среде. По математическим моделям найдены экстремумы, которые близки, и почти совпадают с экстремумами, полученными в ходе эксперимента, на что относительно указывает точность проведения данного эксперимента (приложение 8).
При развитии штамма в сывороточной среде количество клеток было чуть больше (8,72±0,04 Ig КОЕ в 1 см3), чем в обезжиренном молоке (8,53±0,06 Ig КОЕ в 1 см3) (рис. 4.12)- Стационарная фаза в обезжиренном молоке наступала через 7±0,5ч (наблюдали максимальное количество клеток), в сывороточной среде через 8,5±0,5ч, т.е. культивирование до максимального количества клеток проходит дольше на 1,5±0,5ч, но на период времени 7±0,5ч ферментации, количество клеток в обезжиренном молоке и сывороточной среде было одинаково. Данные аргументы показывают положительные аспекты в использовании сывороточной среды при температуре культивирования 30+1 С.
В результате проведенной работы видно, что при температуре культивирования 24±1С и 30±1С в стационарных условиях штамм LLN-E2 в сывороточной среде развивался лучше, чем в обезжиренном молоке.
Изучение влияния температуры культивирования на показатели качества стартовой культуры в условиях полунепрерывного культивирования
С научной и практической точек зрения представляло интерес провести управляемое культивирование ЭПС-синтезирующего штамма, которое осуществляли в условиях полунепрерывного глубинного культивирования на аппарате АК-203. Сывороточную среду выбрали в качестве альтернативы обезжиренному молоку, как наиболее распространенную среду для культивирования в ферментере, а, также, опираясь на ранее полученные данные, свидетельствующие о том, что в сывороточной среде по сравнению с обезжиренным молоком синтезируется большее количество ЭПС штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2. Необходимым условием является не только получить нужное количество клеток, но и определить момент максимальной активности ферментов, отвечающих за синтез ЭПС.
В аппарате культивирования АК-203 поддерживали постоянный уровень активной кислотности (6,2±0,2) единиц рН, опираясь на литературные данные.
Ферментационная кинетика штамма Lactococcus lactis subsp. lactis LLN-E2 при 24±1C в условиях полунепрерывного глубинного культивирования представлена на рисунке 4.13.
В условиях полунепрерывного культивирования наблюдали большее количество клеток, по сравнению со стационарными условиями в одинаковые моменты времени.
Похожие диссертации на Биотехнология стартовых культур на основе молочнокислых бактерий, синтезирующих полисахариды
